L'examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

Nous allons décrire une méthode qui mesure la cinétique de transport des ions des protéines membranaires spécifiques au site aux côtés de l'analyse des changements conformationnels à l'aide de fluorescence sur des cellules individuelles. Cette technique est adaptable aux canaux ioniques, les transporteurs et les pompes ioniques et peut être utilisé pour déterminer les contraintes distance entre sous-unités protéiques.

L’objectif global de cette procédure est d’examiner la dynamique de confirmation des protéines membranaires en utilisant le marquage par fluorescence dirigé à la surface de cellules individuelles. Ceci est accompli en faisant d’abord muter individuellement les résidus à l’interface des domaines extracellulaire et transmembranaire à la cystine, comme le montre le rouge C.It est ensuite nécessaire pour déterminer si ce résidu peut être marqué avec une cystine réagissant au fluoro quatre. La deuxième étape de la procédure consiste à examiner si la cystine, la mutagenèse et/ou le marquage au fluoro quatre affectent la cinétique et/ou l’état de confirmation de la protéine.

Cette opération s’effectue à l’aide de la configuration indiquée. La troisième étape de la procédure consiste à comparer et à opposer les changements d’intensité de fluorescence aux paramètres cinétiques de la protéine cible. Une trace de fluorescence typique est illustrée ici.

La dernière étape de la procédure consiste à marquer des paires de cystéine mutées avec des Fluor quatre donneurs ou des Fluor quatre accepteurs pour mesurer les taux de photodestruction en tandem avec des mesures de pince de tension pour déterminer les contraintes de distance. Cette figure montre les taux de photodestruction du donneur en l’absence d’accepteur en noir, la destruction de la photo du donneur en présence de l’accepteur est en rouge. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent que les changements d’intensité de fluorescence, qui sont le résultat de changements de confirmation de protéines, peuvent être corrélés à la fonction des protéines membranaires par fluorométrie à pince de tension.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du transport d’ions membranaires, telles que la façon dont les changements d’état de confirmation de la protéine facilitent le transport de petites molécules et d’ions à travers la membrane plasmique. Commencez la procédure en clonant la pompe sodium potassium dans un vecteur adapté aux postes xop, l’expression des ovocytes de Lavis. L’étape suivante consiste à réaliser des mutations de cystéine au niveau des résidus situés à l’interface entre le domaine transmembranaire et le domaine extracellulaire, comme indiqué dans l’article ci-joint.

Une fois terminé, vérifiez l’insertion de la mutation par séquençage de l’ADN après avoir transcrit l’ADN plasmatique en ARNm comme indiqué dans l’article ci-joint, quantifiez le rendement de l’ARNm à l’aide d’un spectrophotomètre avant la chirurgie. La grenouille doit être à jeun pendant 12 heures pour éviter les vomissements pendant l’opération. Pour commencer l’opération le lendemain, plongez la grenouille dans la solution anesthésique jusqu’à ce qu’elle ne réponde plus à un pincement de l’orteil.

Retirez la grenouille de la solution anesthésique et placez-la, côté dorsal vers le bas, sur le côté absorbant d’un coussinet à couches. Placez une serviette en papier humide sur la grenouille pour la garder humide. De plus, si les yeux de la grenouille sont ouverts, gardez-les humides avec une solution saline.

Faites une petite incision smique d’un côté de la ligne médiane de la grenouille. Localisez l’ovaire et amenez-le à l’extérieur de la grenouille. Évitez de toucher l’ovaire à la peau.

Retirez l’ovaire et placez-le dans une boîte de Pétri contenant une solution de ringer. Vérifiez que le tissu restant ne saigne pas avant de le remettre à l’intérieur de la cavité smique. En cas de saignement, appliquez une pression avec un coton-tige stérile jusqu’à ce qu’il s’arrête.

Terminez la chirurgie en suturant l’incision à l’aide d’un motif de suture interrompu. Remettez la grenouille dans son logement pour qu’elle se remette de l’anesthésie à l’aide de ciseaux. Divisez le lobe ovarien isolé en plus petites parties.

Transférez les grumeaux dans une solution de ringer plus du calcium avec de la collagénase. Ensuite, agitez doucement la solution de digestion pendant deux heures à 18 degrés Celsius. Lorsque la plupart des cytes sont séparés, lavez les ovocytes avec une solution de ringer sans calcium.

Ensuite, incubez les ovocytes pendant 10 minutes dans une solution de raguage sans calcium à température ambiante. À ce stade, lavez les cytes de manière exhaustive dans une solution de sonneurs plus calcium. Transférez ensuite les ovocytes dans une solution de raguage plus du calcium pour le stockage avant l’injection.

Pour l’étape suivante, récupérez l’ARNm synthétisé dans le congélateur à moins 20 degrés Celsius. Ajoutez 25 nanogrammes d’ARNm à un volume final de 50 nanolitres. Injectez ensuite l’ARNm dans les cytes après l’injection.

Placez les ovocytes dans une solution de ringer et un milligramme par millilitre de gentamicine et incubez-les à 18 degrés Celsius dans l’obscurité pendant trois à sept jours. Cela permet à la pompe sodium-potassium d’être exprimée dans la membrane plasmique de l’ovocyte. Le jour de l’expérience, retirez les ovocytes de l’incubateur et placez-les dans le tampon de chargement pendant 45 minutes, puis dans le tampon de post-chargement pendant 45 minutes.

Cela augmente la concentration intracellulaire de sodium pour faciliter la mesure de la pompe sodium-potassium. Pour les mesures de fluorescence, incubez les cytes dans un tampon de post-chargement contenant cinq micromolaires du fluorophore souhaité, tel que TMRM ou FM, pendant cinq à 10 minutes dans l’obscurité. Après l’étiquetage de la quatrième flore, lavez les ovocytes de manière exhaustive avec un tampon de poteau sans colorant.

Gardez les ovocytes dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment. Pour se préparer aux mesures de tension à deux électrodes, commencez par remplir les micro-électrodes avec trois molaires de chlorure de potassium et testez la résistance. La résistance doit être comprise entre 0,5 et 1,5 méga ohms.

Pour les expériences de balayage à cystéine, équipez le microscope à fluorescence d’un filtre d’excitation 5 35 DF 50, d’un filtre d’émission 5 65 EFLP et d’un miroir diique 5 70 DRLP. Ensuite, placez l’octe dans une chambre RC 10 sur la platine du microscope fluorescent. Ensuite, insérez doucement les deux micro-électrodes dans l’octe à l’aide de l’amplificateur pour maintenir le potentiel de membrane à une valeur constante.

Mesurez le flux d’ions à travers la membrane en activant la protéine à l’aide d’une technique appropriée telle que l’échange de solution ou la modification du potentiel membranaire. Pour des mesures de fluorescence simultanées, utilisez une source lumineuse tungstène de 100 watts pour exciter le fluorophore donneur et pour épingler 0 2 2, une photo DDE pour détecter les changements d’intensité de fluorescence pour le marquage fluorescent. Après une scintigraphie à cystéine.

Mesurez la variation de l’intensité fluorescente à un courant stationnaire à l’aide de pas de tension contrôlés par le logiciel P clamp 10. Une deuxième partie du protocole consiste à prendre des mesures d’atropie anes en plus des mesures de distance. Pour calculer la plage des valeurs du kappa carré, une atropie mesure la mobilité relative du fluoro quatre due à la rotation.

Voir l’article ci-joint pour plus de détails sur les calculs. Pour mesurer les contraintes de distance, utilisez une enzyme holographique, qui possède deux résidus de cystéine extracellulaires accessibles qui peuvent être marqués avec des fluoro-quatre. Ajoutez un tampon de post-chargement contenant un FM micromolaire et quatre TMRM micromolaires.

C’est-à-dire le donneur et l’accepteur. Les quatre fluorofluorés à un lot d’ovocytes n’ajoutent qu’une FM micromolaire. Il s’agit simplement du fluor donneur.

Quatre à un autre lot d’ovocytes incubent les deux lots d’ovocytes sur de la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité. Cela permet de mesurer les enzymes hollo marquées avec et sans accepteur fluoro quatre. Ensuite, équipez le microscope d’un filtre d’excitation 4 75 DF 40, d’un filtre d’émission 5 30 DF 30 et d’un miroir dichroïque 5 0 5 DRLP.

Placez ensuite l’ovocyte dans la chambre sur la platine du microscope à fluorescence. Le maintien d’un flux continu de solution permet de mesurer la dépendance temporelle du blanchiment du donneur en présence et en l’absence de la flore acceptatrice. Quatre. Ces résultats peuvent être utilisés pour calculer la distance entre les deux résidus sur la pompe sodium-potassium à l’aide de la méthode de forester.

Les mesures de la tension de l’électrode de l’équation deux doivent être effectuées simultanément pour s’assurer que la protéine est fonctionnelle. À l’aide de la fonction de pince X dans la pince P 10, faites la moyenne des résultats de la photodestruction du donneur de fluor quatre pour un minimum de quatre enregistrements de site. Pour mesurer le mouvement relatif des sous-unités protéiques, utilisez des constructions à double cystéine qui contiennent des quatre fluoro accepteurs et donneurs.

L’intensité de fluorescence au niveau de ces résidus est insensible à l’état de confirmation de la protéine et sera fonction de la distance entre les deux quatre. Ensuite, remplacez le jeu de filtres du microscope par un filtre d’excitation 4 75 a F 40, un filtre d’émission 5 95 a F 60 et un miroir dichroïque 5 0 5 DRLP. Placez ensuite l’OI dans la chambre sur la platine du microscope à fluorescence.

Ensuite, le donneur est excité avec une source lumineuse au tungstène de 100 watts et l’intensité de fluorescence de l’accepteur. Le fluoro quatre est mesuré à l’aide d’une méthode appropriée telle que le ligand de tension ou l’échange de solution, active la protéine membranaire et mesure simultanément le changement d’intensité de fluorescence. Cette figure montre la corrélation entre le transport d’ions à travers la membrane cellulaire et les changements d’intensité de fluorescence.

La trace supérieure montre les mesures de la pince de courant en présence d’une solution d’essai de sodium et d’une solution d’essai de potassium en présence de 10 micromolaires et de 10 millimolaires. La trace inférieure montre les changements d’intensité de fluorescence mesurés en tandem avec les mesures de la pince de courant. Cette figure montre deux ovocytes marqués avec TMRM, l’accepteur fluoro quatre.

L’ovocyte de gauche exprime l’atpa de sodium et de potassium de type sauvage, tandis que l’ovocyte de droite exprime l’APA de sodium et de potassium avec un résidu de cystéine accessible. Les traces supérieures de cette figure montrent les données de courant transitoire lors de l’impulsion de tension. Les pistes inférieures montrent des enregistrements en temps réel des changements d’intensité de fluorescence lors de l’impulsion de tension.

Cette figure montre que la dépendance temporelle du photoblanchiment du photoblanchiment est mesurée en l’absence et la présence d’un accepteur fluoro quatre : le photoblanchiment se produit plus rapidement sans accepteur fluoré quatre. Chaque trace est la moyenne de quatre enregistrements de site oh. Cette figure montre le mouvement relatif des sous-unités lors des changements de confirmation.

Les changements de fluorescence sont indiqués dans les traces rouges et le flux de courant est indiqué dans les traces noires. Une augmentation de l’intensité de la fluorescence illustrée à gauche indique que les étages de la flore se rapprochent. Aucun changement dans l’intensité de la fluorescence indiqué au milieu indique que la distance Fluor quatre reste statique.

Une diminution de l’intensité de la fluorescence indiquée à droite indique que les quatre Fluor s’éloignent davantage lors de la tentative de cette procédure. Il est important de ne pas oublier de corréler les changements d’intensité de fluorescence cinétique et stationnaire aux changements de confirmation de la protéine.