L'examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la dynamique conformationnelle des protéines membranaires en utilisant un marquage fluorescent dirigé sur la surface de cellules individuelles. Cela est réalisé en mutant d'abord individuellement les résidus situés à l'interface entre les domaines extracellulaire et transmembranaire en cystéine, comme indiqué par le « C » rouge. Il est ensuite nécessaire de déterminer si ce résidu peut être marqué par un fluorophore réagissant avec la cystéine. La deuxième étape de la procédure consiste à examiner si la mutagenèse de la cystéine, le marquage par le fluorophore, ou les deux, affectent la cinétique et/ou l'état conformationnel de la protéine.

Ceci est réalisé à l'aide du dispositif illustré. La troisième étape de la procédure consiste à comparer et à contraster les variations de l'intensité de fluorescence avec les paramètres cinétiques de la protéine cible. Un tracé typique de fluorescence est montré ici.

La dernière étape de la procédure consiste à marquer les paires de cystéines mutées avec un fluorophore donneur Fluor quatre ou un couple donneur-accepteur Fluor quatre afin de mesurer les taux de photodestruction en parallèle avec des enregistrements en configuration de blocage de tension, afin de déterminer des contraintes de distance. Ce graphique illustre les taux de photodestruction du donneur en l'absence d'accepteur en noir ; la photodestruction du donneur en présence d'accepteur est représentée en rouge. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant que les variations d'intensité de fluorescence, résultant de changements conformationnels des protéines, peuvent être corrélées à la fonction des protéines membranaires grâce à la fluorométrie en blocage de tension.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du transport ionique membranaire, telles que la manière dont les changements d'état conformationnel de la protéine facilitent le transport de petites molécules et d'ions à travers la membrane plasmique. Commencez la procédure par le clonage de la pompe sodium-potassium dans un vecteur adapté à l'expression dans des ovocytes de xénope, comme XOP ou Lavis. L'étape suivante consiste à introduire des mutations en cystéine au niveau des résidus situés à l'interface entre les domaines transmembranaires et extracellulaires, comme décrit dans l'article accompagnant.

Lorsque l'opération est terminée, vérifier l'insertion de la mutation par séquençage de l'ADN plasmatique après transcription de l'ADN plasmatique en ARNm comme décrit dans l'article associé, et quantifier le rendement en ARNm à l'aide d'un spectrophotomètre avant la chirurgie. La grenouille doit être mise à jeun pendant 12 heures afin d'éviter les vomissements pendant l'opération. Pour commencer la chirurgie le jour suivant, plonger la grenouille dans la solution anesthésiante jusqu'à ce qu'elle ne réagisse plus à une pincée du doigt de pied.

Retirez la grenouille de la solution anesthésiante et placez-la du côté dorsal vers le bas sur la partie absorbante d'une serviette-couche. Placez une serviette en papier humide sur la grenouille pour maintenir son humidité. En outre, si les yeux de la grenouille sont ouverts, maintenez-les humides avec une solution saline.

Réalisez une petite incision semi-circulaire sur un côté de la ligne médiane de la grenouille. Localisez l'ovaire et faites-le sortir à l'extérieur de la grenouille. Évitez de toucher l'ovaire avec la peau.

Retirez l'ovaire et placez-le dans une boîte de Pétri contenant une solution de Ringer. Vérifiez le tissu restant à la recherche d'un saignement avant de le remettre à l'intérieur de la cavité smic. En cas de saignement, appliquez une pression avec un coton stérile jusqu'à l'arrêt du saignement.

Terminer la chirurgie en suturant l'incision selon un motif de points séparés. Retourner la grenouille dans son logement pour qu'elle se remette de l'anesthésie à l'aide de ciseaux. Diviser le lobe ovarien isolé en parties plus petites.

Transférez les agrégats dans une solution de Ringer contenant du calcium et de la collagénase. Ensuite, agitez doucement la solution de digestion pendant deux heures à 18 degrés Celsius. Lorsque la majorité des cytes sont séparées, lavez les ovocytes avec une solution de Ringer sans calcium.

Incuber ensuite les ovocytes pendant 10 minutes dans une solution de Ringer sans calcium, à température ambiante. À ce stade, laver soigneusement les cytes dans une solution de Ringer contenant du calcium. Puis transférer les ovocytes dans une solution de Ringer avec calcium pour stockage avant injection.

Pour l'étape suivante, retirez l'ARNm synthétisé du congélateur à moins 20 degrés Celsius. Ajoutez 25 nanogrammes d'ARNm pour un volume final de 50 nanolitres. Ensuite, injectez l'ARNm dans les cytes après l'injection.

Placer les ovocytes dans une solution de Ringer contenant un milligramme par millilitre de gentamicine et les incuber à 18 degrés Celsius à l’obscurité pendant trois à sept jours. Cela permet l’expression de la pompe sodium-potassium dans la membrane plasmique de l’ovocyte. Le jour de l’expérience, retirer les ovocytes de l’incubateur et les placer dans un tampon de chargement pendant 45 minutes, puis dans un tampon de post-chargement pendant 45 minutes.

Cela augmente la concentration intracellulaire de sodium afin de faciliter la mesure de la pompe sodium-potassium. Pour les mesures de fluorescence, incuber les cytes dans un tampon post-incubation contenant cinq micromoles du fluorophore souhaité, tel que TMRM ou FM, pendant cinq à dix minutes à l'abri de la lumière. Après le marquage avec le fluorophore quatre, laver soigneusement les ovocytes avec le tampon postérieur sans colorant.

Gardez les ovocytes à l'abri de la lumière pour éviter le blanchiment photo-induit. Pour préparer les mesures par clampage de tension à deux électrodes, commencez par remplir les microélectrodes avec du chlorure de potassium à trois molaire et mesurez la résistance. La résistance doit être comprise entre 0,5 et 1,5 mégaohms.

Pour les expériences de balayage par cystéine, équipez le microscope à fluorescence d'un filtre d'excitation 5 35 DF 50, d'un filtre d'émission 5 65 EFLP et d'un miroir dichroïque cinq 70 DRLP. Ensuite, placez l'octe dans une chambre RC 10 sur la platine du microscope à fluorescence. Puis insérez délicatement les deux microélectrodes dans l'octe en utilisant l'amplificateur pour maintenir le potentiel membranaire à une valeur constante.

Mesurez le flux ionique à travers la membrane en activant la protéine à l’aide d’une technique appropriée, comme l’échange de solution ou la modification du potentiel membranaire. Pour des mesures de fluorescence simultanées, utilisez une source lumineuse au tungstène de 100 watts afin d’exciter le fluorophore donneur et d’épingler 0 2 2, A photo DDE pour détecter les variations de l’intensité de fluorescence lors du marquage fluorescent. Suite au balayage par cystéine.

Mesurez la variation de l'intensité fluorescente à courant stationnaire à l'aide d'impulsions de tension contrôlées par le logiciel P clamp 10. Une seconde partie du protocole consiste à effectuer des mesures d'atropie en parallèle avec des mesures de distance. Pour calculer la plage des valeurs de kappa carré, une mesure d'atropie évalue la mobilité relative du fluoro quatre due à la rotation.

Voir l'article accompagnant pour les détails des calculs. Pour mesurer les contraintes de distance, utiliser une holo-enzyme, qui possède deux résidus de cystéine extracellulaires accessibles pouvant être marqués avec des fluorophores. Ajouter un tampon post-chargement contenant un micromolaire de FM et quatre micromolaires de TMRM.

Il s'agit du donneur et de l'accepteur. Ajouter quatre fluoro pour une série d'ovocytes, une micromolaire de FM uniquement. C'est simplement le fluoro donneur.

Quatre à un autre lot d'ovocytes, incuber les deux lots d'ovocytes sur de la glace pendant 30 minutes à l'abri de la lumière. Cela permet d'effectuer des mesures d'enzymes hollo marquées avec et sans un fluorophore accepteur. Ensuite, équiper le microscope d'un filtre d'excitation 475 DF 40, d'un filtre d'émission 530 DF 30 et d'un miroir dichroïque 505 DRLP.

Ensuite, placez l'ovocyte dans la chambre sur la platine du microscope à fluorescence. En maintenant un flux continu de solution, mesurez la dépendance temporelle du blanchiment du donneur en présence et en absence de l'accepteur flora.Quatre. Ces résultats peuvent être utilisés pour calculer la distance entre les deux résidus sur la pompe sodium-potassium en utilisant la méthode de Forester.

Les mesures de blocage de tension à deux électrodes selon l'équation doivent être effectuées simultanément afin de garantir que la protéine est fonctionnelle. À l'aide de la fonction X de blocage dans P clamp 10, moyennez les résultats de la photodestruction du fluorophore donneur quatre pendant au moins quatre enregistrements sur des sites oh. Pour mesurer le déplacement relatif des sous-unités protéiques, utilisez des constructions à double cystéine contenant des fluorophores quatre accepteurs et donneurs.

L'intensité de fluorescence de ces résidus est insensible à l'état conformationnel de la protéine et dépendra de la distance entre les deux fluorophores. Ensuite, remplacez le jeu de filtres du microscope par un filtre d'excitation 475 aF 40, un filtre d'émission 595 aF 60 et un miroir dichroïque 505 DRLP. Puis placez l'OI dans la chambre sur la platine du microscope à fluorescence.

Ensuite, le donneur est excité à l'aide d'une source lumineuse au tungstène de 100 watts et l'intensité de fluorescence de l'accepteur. Fluoro four est mesurée à l'aide d'une méthode appropriée, telle que le ligand voltage ou l'échange de solution, afin d'activer la protéine membranaire et de mesurer simultanément la variation de l'intensité de fluorescence. Cette figure montre la corrélation entre le transport d'ions à travers la membrane cellulaire et les variations de l'intensité de fluorescence.

La trace supérieure montre des mesures en régime de potentiel constant en présence de solution-test de sodium et de solution-test de potassium, avec 10 micromolaire et 10 millimolaire d'ing. La trace inférieure montre les variations de l'intensité de fluorescence mesurées en parallèle avec les mesures en régime de potentiel constant. Cette figure présente deux ovocytes marqués avec le TMRM, le fluorophore accepteur.

L'oocyte situé à gauche exprime la pompe sodium-potassium de type sauvage, tandis que l'oocyte situé à droite exprime des pompes sodium-potassium comportant un résidu de cystéine accessible. Les tracés supérieurs de cette figure montrent les données de courant transitoire en réponse à une impulsion de tension. Les tracés inférieurs montrent des enregistrements en temps réel des variations d'intensité de fluorescence induites par l'impulsion de tension.

Cette figure montre la dépendance temporelle du photoblanchiment : la photodestruction du donneur est mesurée en l'absence et en présence du fluorophore accepteur. Le photoblanchiment se produit plus rapidement en l'absence du fluorophore accepteur. Chaque courbe représente la moyenne de quatre enregistrements effectués sur différents sites. Cette figure illustre le déplacement relatif des sous-unités lors de changements conformationnels.

Les variations de fluorescence sont indiquées par les tracés rouges et le flux de courant est représenté par les tracés noirs. Une augmentation de l'intensité de fluorescence illustrée à gauche indique que les flores s'approchent l'une de l'autre. L'absence de variation de l'intensité de fluorescence montrée au centre indique que la distance entre les Fluor quatre reste constante.

Une diminution de l'intensité de fluorescence indiquée à droite indique que les Fluor fours s'éloignent pendant la réalisation de cette procédure. Il est important de se rappeler de corréler les variations de l'intensité de fluorescence cinétique et en état stationnaire aux changements conformationnels du protéine.