Name: Studiare le basi neurali del comportamento adattivo Locomotore in Insetti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Scopri come registrare l'attività muscolare delle zampe in insetti legati su superficie scivolosa. Questo metodo elettromiografico rivela i meccanismi neurali del comportamento locomotorio adattivo.

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Ringraziamo Michael Dubbert, Oliver Hoffmann, Hans Scharstein, Jan Sydow e Anne Wosnitza per un&#39;eccellente assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato da DFG concedere Bu 857 / 8,10 ad AB

1. Il piano di calpestio Il piano di calpestio nero è composto da due lastre di ottone nichelato rivestito permanentemente uniti fianco a fianco ed elettricamente isolate l'una dall'altra da una fascia larga due millimetri di 2-componente colla epossidica (UHU plus, UHU GmbH, Germania), direttamente sotto l'asse longitudinale del l'animale. Essi producono una superficie totale di 13.5x15.5cm (Figura 1). La separazione dei semipiani per le gambe a destra ea sinistra permette indipendente di monitoraggio tarsale contatto per una sola gamba su ogni lato. <ol><li> La piastra è lubrificato con glicerina acqua / miscela con un rapporto di 95 parti di glicerina a 5 parti-soluzione satura di NaCl per trasmettere scivolosità e conducibilità elettrica, la viscosità è di circa 430cStokes (Shankar e Kumar, 1994). </li><li> La miscela viene applicata direttamente sulla superficie e si disperde con un pezzo di tessuto molle per garantire uno spessore complessivo di 0.1-0.2mm. </li></ol> 2. Stimolazione installazione ottica <ol><li> Episodi piedi sono suscitato utilizzando due proiettori come descritto da Scharstein (1989) per proiettare un modello a strisce su due rotonde, schermi di vetro smerigliato (diametro 130mm, schermi Marata, Linos Photonics, Göttingen, Germania) che sono posizionati ad una distanza di ca. 70 millimetri dagli occhi, e con un angolo di 45 ° nella parte anteriore sinistra e destra del piatto (Fig.1). La lunghezza d'onda del pattern a strisce viene mantenuta costante a λ = 21 °. La frequenza di contrasto degli stimoli in movimento può essere variata tra 0,35, 0,72, 1,07 e 1.49Hz. Dal momento che la reazione degli animali dipende solo dalla frequenza ω contrasto / λ (ω = velocità angolare, λ = lunghezza d'onda modello) se il contrasto modello è sufficientemente elevato (Fermi e Reichhardt, 1963), non abbiamo λ variare nel corso degli esperimenti . La luminanza delle strisce luminose sulla parte dell'animale è di circa 15cd/m2 e il contrasto 0.8. L'occhio composto di insetto stecco (Carausio morosus) ha 24 ommatidi nel dorso-ventrale asse (Friza, 1928) e alcuni più in asse rostro-caudale. Come l'angolo di divergenza degli occhi insetto stecco è in media di 6,2 ° (Jander e Volk-Henrichs, 1970) il nostro modello di lunghezza d'onda è stata di circa 4 volte l'angolo del ommatidi. Gli esperimenti sono installati in una gabbia di Faraday oscurato e si esibisce in una stanza buia a 20-22 ° C. </li><li> In avanti a piedi è indotto da un andamento progressivo su entrambi gli schermi, dove le strisce ogni mossa schermo verso l'esterno, o un singolo fascio nero su sfondo bianco posto tra le schermate </li><li> Svolta è indotto da bande in movimento nella stessa direzione su entrambi gli schermi. Non abbiamo trovato una correlazione tra la velocità delle strisce in movimento e l'angolo del turno. Una volta luminanza del pattern a strisce è impostato per indurre a piedi, di solito non richiede ulteriori regolazioni, ma può essere regolata per animali diversi a seconda delle necessità per la tensione delle lampade alogene nei proiettori. </li></ol> 3. Preparazione del Animal Sperimentale <ol><li> Femmina insetti stecco adulti (Carausio morosus) sono incollate (cemento dentale, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Germania) lato ventrale giù su un bastoncino di balsa (3x5x100mm, LxAxP), che è inserito in un tubo di ottone che ha connettori multipli. L'animale viene tenuto premuto per circa un minuto fino a quando la colla è almeno in parte indurito. </li><li> La testa e le gambe sporgono dalla parte anteriore e laterale del tassello per permettere la loro libera circolazione. L'area del coxae di tutte le gambe, così come la maggior parte del ventre deve essere lasciato libero di colla. </li><li> Testa dell'insetto, torace, e le estremità distali di ciascun femore e tibia sono contrassegnati con pigmenti fluorescenti (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Germania) miscelato con cemento dentale per il monitoraggio video di seguito. </li></ol> 4. Posizionamento di elettrodi EMG L'attività muscolare dei muscoli delle gambe diversi come, in questo esempio, il goniometro e muscoli coxae retrattore, che si trovano nel torace e la protrazione causa (movimento in avanti) e retrazione (movimento all'indietro) della gamba, viene registrata per mezzo di elettrodi EMG impiantato nel torace. Tutte le registrazioni EMG sono amplificati in modo differenziato. Il segnale è stato amplificato 100 volte in un preamplificatore (elettronica officina, Istituto Zoologico, Colonia), filtro passa-banda (100Hz-2000Hz), ulteriormente amplificata (10x) e importati attraverso un convertitore AD in spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK). <ol><li> Gli elettrodi sono fatti di fili di rame rivestiti (Elektrisola, Eckernhagen, Germania; 47μm diametro esterno). Per un elettrodo, due fili vengono prima spalmata di colla, poi, i due fili appiccicosi sono intrecciati intorno a vicenda </li><li> Ad una estremità estremità del filo ritorto sono saldati ad un mini-plug. All'altra estremità i fili vengono tagliati per fornire le estremità pulita senza isolamento per l'inserimento nel animale. </li><li> Gli elettrodi EMG sono Plugged nel connettore piccolo, alla fine del tubo di ottone. </li><li> Un perno Minuten è usato per perforare forellini nella cuticola </li><li> Le estremità taglio degli elettrodi vengono poi separati e inserita in un muscolo a distanza di circa 1 millimetro l'uno dall'altro, che, nella nostra esperienza, dà un buon rapporto segnale rumore. Si deve prestare attenzione a non inserire gli elettrodi troppo in profondità nel muscolo in modo da evitare il danno. La figura 2 mostra la posizione degli elettrodi nel torace dell'animale. La Figura 3 mostra un animale con i cavi elettrodo in posizione. </li><li> Noi usiamo una piccola goccia di colla histoacrylic (3M Vetbond, San Paolo, MN, USA) per tenere i fili in posizione. </li><li> Un filo di terra viene inserito nell'addome. </li></ol> 5. Registrazione del contatto tarsale Contatto tarsale è sempre registrato insieme con tracce EMG. Poiché la superficie scivolosa è diviso in due metà, un massimo di due contatti controlaterale tarsali possono essere registrati nello stesso momento. A tal fine, la gamba viene utilizzato come un "interruttore" per chiudere un circuito tra la piastra e l'amplificatore. Corrente può essere applicata alle placche separatamente attraverso due prese alla base di ogni piatto. Siamo in grado di generare due segnali ad onda quadra con 2-4mV ampiezze con un generatore di impulsi (modello MS501, elettronica di laboratorio, Istituto Zoologico, Colonia) che sono in ritardo di fase di 90 °. I segnali vengono attenuati da 60dB (/ 1000) e applicato le due metà della superficie scivolosa. In questo esperimento utilizziamo solo uno dei due segnali. E 'allo stesso tempo inserito in un lock-in-amplificatore come un segnale di riferimento. La fase 2-lock-in-amplificatore (elettronica officina, Istituto Zoologico, Colonia) amplifica selettivamente solo segnali della stessa frequenza e fase, come il segnale di riferimento fornito. Un secondo canale rileva solo il 90 ° fase del segnale ritardato. Segnali di rumore a frequenze diverse dalla frequenza di riferimento vengono rifiutate e non influenzano la misura. Il segnale di uscita dell'amplificatore è immessa in un convertitore AD (Micro 1401k II, CED, Cambridge, UK) e digitalizzate Spike2 uso. Tra il touch-down e decollo del tarso sulla e dalla superficie scivolosa, la corrente scorre dalla piastra attraverso tarso e tibia in filo di rame (vedi sotto: 5,3-5,8). L'amplificatore scelto ha una elevata resistenza di ingresso (1M) e la tensione del segnale è molto piccolo in modo da evitare di compromettere il comportamento a piedi dell'animale. Il passaggio di corrente attraverso il tarso e tibia è compreso tra 2 e 4NA. Il lead time del segnale durante il touch-down, tra l'entrata in il lubrificante e la superficie di contatto è inferiore a 1ms. La transizione del segnale di contatto durante il decollo è meno ripida e più ritardata. Ciò è dovuto al ritardato strappo del lubrificante dal tarso da un effetto di risalita capillare e grazie al movimento della gamba, senza completa lift-off in fase dinamica. <ol><li> Il tubo di ottone con il bastone balsa a cui è incollato l'animale viene inserito in un micromanipolatore per consentire la regolazione in altezza dell'animale compresa tra il 7 e 12 mm al di sopra della superficie scivolosa, che corrisponde all'altezza durante il cammino libero. </li><li> Al fine di misurare il flusso di corrente ogni volta che il tarso insetto della gamba monitorato è a terra, un filo (diametro 47μm) viene tagliata in pezzi lunghi circa 15 cm. </li><li> L'isolamento di rame viene rimosso dalla combustione di via con l'alcol. </li><li> Un ciclo è formato con una estremità del filo e scivolò oltre il tarso dell'animale </li><li> Il ciclo è legato al termine distale della tibia per fornire un buon contatto tra l'animale e filo. </li><li> Il filo è poi fissato sul torace dell'animale con una goccia di colla bicomponente (ProTempII, vedi sopra), e collegata al amplificatore differenziale tramite un morsetto alligatore. </li><li> Per migliorare la conducibilità del filo alle estremità, una goccia di crema elettrodo viene applicato (Marquette Hellige, Friburgo, Germania) sulle aree di contatto. </li><li> La potenza del segnale viene poi testato sul monitor. A causa delle proprietà del filtro passa-basso del lock-in-amplificatore (10ms costante di tempo) e la lift-off/touch-down graduale del tarso, il segnale non è un segnale preciso quadrati. Si deve quindi fare impostare soglie adatto vicino al punto di transizione per determinare l'esatta tempistica di contatto tarsale e controllare manualmente ogni evento determinato dal software di digitalizzazione. Basata sul contatto del tarso, abbiamo definito il momento in cui il tarso di una gamba dato era a terra come posizione e il tempo in cui era nell'aria come fase dinamica. </li><li> Il segnale di trigger per la fotocamera viene registrato contemporaneamente la traccia EMG e il segnale di contatto del tarso, e permette un preciso quadro di correlazione struttura di comportamento e le tracce registrate. </li></ol> 6. La registrazione ottica di movimenti delle gambe per l'analisi digitale La frequenza di stepping insetti stecco su superfici scivolose può raggiungere i 3-4 Hz (Graham e Cruse, 1981). <ol><li>Prima di registrare sequenze a piedi, uno specchio è posto in un angolo di 45 ° dietro all'animale di avere un monitor aggiuntivo visivo per touch-down. La fotocamera è di indurre dall'esterno e le immagini sono inserite in un PC attraverso una interfaccia FireWire. </li><li> Registriamo piedi sequenze dall'alto con una telecamera di video ad alta velocità (Marlin F-033C, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germania) a 100 fps per analizzare i movimenti delle gambe digitalmente, e correlare con l'attività EMG e il contatto tarsale. </li><li> Durante la registrazione di sequenze a piedi, l'animale è illuminato con array di LED blu (30-50V DC, 24cd luminanza, Elettronica Workshop, Istituto Zoologico, Università di Colonia), che sono regolate in intensità per illuminare i marcatori fluorescenti. Secondo la letteratura (Schlegtendal, 1934), insetti stecco non possiedono la visione a colori e non abbiamo osservato un effetto negativo di illuminazione luce UV sulla risposta di svolta. Un filtro giallo davanti all'obiettivo della fotocamera sopprime la breve lunghezza d'onda della luce di attivazione e dà un contrasto maggiore per le registrazioni video. </li><li> I file video possono essere analizzati utilizzando il software di monitoraggio del movimento (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak servizio, Berlino, Germania). </li></ol> 7. Registrazione di sequenze Walking <ol><li> Come controllo, in primo luogo una sequenza a piedi con un animale intatto è registrato. </li><li> La velocità del modello a strisce è impostata, e il modello e la registrazione video sono iniziate all'incirca nello stesso momento. </li><li> Se l'animale non si avvia locomozione spontaneamente, può essere stimolata al ventre con un pennello (Bässler e Wegener, 1983), o da un soffio d'aria per le antenne. In questo caso, gli animali toccato nella parte sinistra dell'addome tendono a girare a sinistra e viceversa. Il modello a strisce è continuato a muoversi fino a quando l'animale smette di camminare o fino a quando dopo 3 minuti di registrazione continua. </li><li> Al fine di testare fino a che punto l'attività muscolare a una gamba dipende da un input sensoriale dalle gambe vicini, l'animale è indotto a autotomize sue gambe. Il sito di autotomia si chiude in modo naturale in pochi secondi. Un esempio di un animale con frontale autotomized e zampe posteriori è mostrata in Figura 3. </li><li> Ad esempio, per gli esperimenti con gli animali che hanno una sola gamba centrale, ci induce autotomia delle gambe pro e metathoracic pizzicando il femore prossimale con un paio di pinze (Schmidt e Grund, 2003) o tagliare le gambe a livello del coxae dopo la registrazione dal intatta di un animale. Dopo che un minimo di 30 minuti per tempo di recupero è dato per l'animale. </li><li> Poi abbiamo il nuovo record sequenze camminare come prima. In preparazione ridotta, spesso abbiamo bisogno di indurre a piedi con pennellate di vernice. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 configurazione sperimentale; A:. Fotografia di un insetto stecco legato sopra la superficie scivolosa, contrassegnati con pigmenti fluorescenti per il monitoraggio delle gambe e cablato per la registrazione EMG e misura a contatto tarsale. B: schema di collegamento per la registrazione a doppio contatto tarsica della gamba durante la deambulazione sulla superficie scivolosa. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Posizioni per il posizionamento di elettrodi EMG nei muscoli goniometro e divaricatore nel torace della gamba centrale bastone di insetti. ML: metà gamba; FL: gamba <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 Stick insetti con fili EMG nei muscoli pro e retrattore della gamba in posizione centrale, zampe anteriori e posteriori sono stati rimossi per studiare l'effetto della presenza di gambe vicini sulla cinematica e l'attività dei muscoli delle gambe in mezzo la preparazione ridotta. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Traccia Esempio di attività retrattore EMG con segnale di riferimento di contatto tarsale in una gamba dentro mezzo durante la tornitura. All'inizio della traccia (la prima blue box), il riavvolgitore è attivo durante l'appoggio, mentre la gamba ha contatto con il terreno ("circuito chiuso"), indicando che la gamba fa passi in avanti, dopo un breve passaggio (seconda scatola blu), il riavvolgitore è attivo durante l'oscillazione, mentre la gamba è in aria ("circuito aperto", il terzo blue box), che mostra la presenza di passi indietro regia. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Schermata di una registrazione dal goniometro (traccia in alto) e divaricatore (metà traccia) i muscoli e la traccia simultaneamente contatto registrato tarso (traccia in basso). Nota l'attività di alternanza nelle tracce EMG che corrisponde all'attività dei due muscoli nel ciclo di passo, che è l'attività goniometro appena prima e duranteswing, quando la perdita di contatto tarsale traccia segnali di contatto con il terreno, e l'attività retrattore dopo e durante touch-down del tarso, quando la gamba è in posizione. L'inserto mostra il file video corrispondente corrispondente a questa registrazione che viene utilizzato per verificare il comportamento dell'animale.

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<li>Schlegtendal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitrag+zum+Farbensinn+der+Arthropoden%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschr.+f.+vergl.+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Beitrag zum Farbensinn der Arthropoden.</a> Zeitschr. f. vergl. Physiologie. 20, 573-581 Forthcoming.</li>
<li>Schmidt, J., Grund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+activity+in+a+motor+axon+induced+by+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Rhythmic activity in a motor axon induced by axotomy.</a> Neuroreport. 14, 1267-1271 (2003).</li>
<li>Shankar, P. N., Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Determination+of+the+Kinematic+Viscosity+of+Glycerol-Water+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Mathematical+and+Physical+Sci%22%5BJournal%5D)">Experimental Determination of the Kinematic Viscosity of Glycerol-Water Mixtures.</a> Proc. Mathematical and Physical Sci. 444, 573-581 (1994).</li>
<li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach+I.+Kinematics+and+electromyograms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach I. Kinematics and electromyograms.</a> J Neurophysiol. 83, 3323-3336 Forthcoming.</li>
<li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach.+II.+Extensor+motor+neuron+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach. II. Extensor motor neuron pattern.</a> J Neurophysiol. 83, 3337-3350 Forthcoming.</li>
<li>Tsuchida, Y., Hama, N., Takahata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+telemetry+system+for+underwater+recording+of+electromyogram+and+neuronal+activity+from+non-tethered+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optical telemetry system for underwater recording of electromyogram and neuronal activity from non-tethered crayfish.</a> J Neurosci Methods. 137, 103-109 (2004).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo descritto una configurazione che consente la generazione otticamente indotta di trasformare il comportamento e permette in larga misura il disaccoppiamento di neuronally generato attività a piedi dagli effetti passivi causati dallo spostamento meccanico degli arti altri a piedi per terra. Flusso di informazioni potenziali tra le gambe attraverso il sistema nervoso per le forze di reazione del terreno o contattare tarso, d&#39;altra parte, è ancora possibile e permette lo sperimentatore per studiare l&#39;influenza di tali informazioni nella preparazione ridotta. Principali vantaggi della configurazione superficie scivolosa che includono gli animali mostrano una tendenza molto alta a camminare, e contrariamente a piedi o pestare un treadwheel, l&#39;animale può eseguire swing e movimenti fase statica in tutte le direzioni del cammino naturale. Inoltre, i gradi di libertà per tutte le gambe permettere all&#39;animale di effettuare la curva a piedi se si tratta di una preparazione intatto o semi-intatti. Perché le gambe non possono essere spostati passivamente semplicemente il movimento in avanti l&#39;animale o il movimento del substrato sottostante, ogni movimento riflette l&#39;uscita del motore di quella gamba (Cruse, 1976; Graham e Wendler, 1981). L&#39;installazione è particolarmente adatto per indagare le basi neurali di comportamenti adattivi come girare all&#39;indietro o in avanti rispetto a piedi, perché si può combinare registrazioni elettrofisiologiche dell&#39;attività motoria con l&#39;analisi cinematica del movimento degli arti. Abbiamo usato la risposta optomotor dell&#39;insetto bastone di suscitare camminare. Le risposte degli animali al motivo a strisce a rotazione si mostrano pronti a effettuare la curva a piedi, mentre legato sulla superficie scivolosa. Più sorprendente per noi, solo gambe in una sola gamba qualitativamente preparati mostrano lo stesso modello in movimento come nel intatta di un animale. Abbiamo quindi ragione di credere che il controllo di camminare curva può funzionare in gran parte senza coordinando gli input sensoriali dalle gambe vicine. Sarà importante provare a ulteriori esperimenti se l&#39;attività dei motoneuroni delle gambe rimosso è influenzato anche dal modello optomotor. La configurazione può essere facilmente modificato per consentire lo studio di altre attività come dritto in avanti e indietro a piedi mettendo una striscia sola di fronte l&#39;animale o tirando delicatamente le antenne. La misura precisa di contatto con il terreno ci permette di correlare l&#39;attività muscolare e la posizione delle gambe. L&#39;elevata risoluzione temporale di questo segnale contatto elettrico è meglio di 1 ms e ci conduce a una nuova comprensione i tempi del passaggio dallo swing alla fase statica. La risoluzione è peggiore per la posizione di swing transizione a causa del ritardo nel taglio del lubrificante conduzione e la mancanza di necessità di un completo decollo durante protrazione sulla superficie scivolosa. Tuttavia, la conoscenza sull&#39;altalena preciso per la transizione posizione è un passo particolarmente utile prima se vogliamo capire i meccanismi che controllano tempi muscolare e le attività coordinate dei muscoli delle gambe in diversi contesti comportamentali (vedi anche: Büschges et al, 2008;. Büschges &amp; Gruhn 2008). Come esempio, abbiamo usato il riavvolgitore e goniometro coxae muscolare della gamba centrale e precisamente correlata la sua attività con il passaggio dallo swing alla fase statica mentre noi contemporaneamente monitorato il contesto comportamentale in cui è stata utilizzata la gamba. A questo scopo, abbiamo indotto a piedi e hanno registrato l&#39;attività muscolare in modo continuo. Una gamba dato può essere un interno o una gamba esterna, a seconda del senso di rotazione. Alla gamba mezzo passo, in qualità di una gamba dentro in senso funzionale, si può osservare che i muscoli riavvolgitore e goniometro può lavorare sia i muscoli posizione funzionale, perché la gamba produce intermittenza passi indietro in aggiunta a passi avanti diretto (vedi Fig.4 ). Il elettromiogrammi (EMG) da entrambi i muscoli sono state rettificate e normalizzato al tempo di touch-down e la latenza del primo spike muscolo è stato calcolato. È interessante notare che le latenze di entrambi i muscoli rispetto a dipendere lift-off e touch-down sulla funzione del muscolo come altalena rispettivi atteggiamento muscolare (vedi Fig. 4) e non sul muscolo stesso, e mostrano solo piccole modifiche nel tempi di inizio attività. La maggior parte delle spiegazioni per il cambiamento di stato dallo swing alla posizione assumere che i segnali sensoriali di trigger contatto tarsale l&#39;inizio della presa di posizione. La domanda interessante di come le latenze breve tra touch-down e attivazione muscolare nel insetto stecco sono determinati e su quali informazioni sensoriali dipendono ora possono essere affrontate con la configurazione modificata. In sintesi, ci mostrano una configurazione superficie scivolosa che ci permette di suscitare affidabile a dritto e in curva insetti stecco fermo. Cinematica, l&#39;attività muscolare e la tempistica di tarsale touch-down e lift-off possono essere monitorati e correlati nei due diversi c comportamentaliontexts allo stesso tempo. Questo ci dà un ottimo strumento per studiare la connessione tra l&#39;attività muscolare dettagliato e contesto comportamentali per una sola gamba e nell&#39;animale intatto e i meccanismi alla base.

<table><tbody><tr><td>Colla epossidica bicomponente</td><td>UHU plus, UHU GmbH, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schermi di vetro (diametro 130 mm)</td><td>Linos Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cemento dentale</td><td>ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, Germania</td><td>3M Id: 70-2011-0358-0 Numero di catalogo: 46430</td><td>Disponibile tramite 3M (&lt;a href=&quot;http://www.3m.com/">http://www.3m.com/&lt;/a&gt;) o fornitori dentali</td></tr><tr><td>Pigmenti fluorescenti</td><td>Dr. Kremer Farbm&amp;uuml;hle, Aichstetten, Germania</td><td>N. di catalogo: ad es. 56200 Pigmento fluorescente giallo dorato 56350 Pigmento fluorescente rosso fiamma</td><td>&lt;a href=&quot;http://kremer-pigmente.de/en">http://kremer-pigmente.de/en&lt;/a&gt; oppure &lt;a href=&quot;http://www.kremerpigments.com/">http://www.kremerpigments.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Colla histoacrilica</td><td>3M</td><td></td><td>fornitore: WPI</td></tr><tr><td>Filo di rame smaltato</td><td>Elektrisola Eckernhagen</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.elektrisola.com/">http://www.elektrisola.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Crema per elettrodi</td><td>Marquette Hellige, Friburgo, Germania</td><td></td><td>Il prodotto è ora fuori produzione, suggeriamo ad esempio: &lt;a href=&quot;http://www.grasstechnologies.com">www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Generatore di impulsi</td><td>Modello MS501, laboratorio elettronico, Istituto di Zoologia, Colonia, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore lock-in</td><td>Istituto di Zoologia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Convertitore AD</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preamplificatore</td><td>Istituto di Zoologia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telecamera ad alta velocità</td><td>Allied Vision Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrici di LED UV</td><td>Istituto di Zoologia</td><td></td><td>30-50 V CC, laboratorio elettronico&lt;br/&gt;
&amp;#955;390-395 nm&lt;br/&gt;Luminanza 24 cd</td></tr><tr><td>Software di digitalizzazione Spike2</td><td>Vers. 5.05, CED, Cambridge, Regno Unito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di tracciamento del movimento</td><td>Mikromak service, Berlino, Germania</td><td>WINanalyze, Vers. 1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

studiare le basi neurali del comportamento adattivo locomotore in insetti

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studiare le basi neurali del comportamento a piedi, si affrontano spesso il problema che è difficile separare l&#39;uscita neuronally produced un passo da quei movimenti delle gambe che risultano da forze passive e le interazioni con le gambe di altri attraverso il contatto con il substrato comune. Se vogliamo comprendere, quale parte di un dato movimento è prodotto da uscita motore del sistema nervoso, l&#39;analisi cinematica dei movimenti passo-passo, quindi, deve essere integrata con le registrazioni elettrofisiologiche dell&#39;attività motoria. La registrazione dell&#39;attività neuronale o muscolare in un animale si comporta è spesso limitata dalle apparecchiature elettrofisiologiche che possono limitare l&#39;animale nella sua capacità di muoversi con molti gradi di libertà possibile. Questo può essere evitato utilizzando elettrodi impiantabili e quindi avere la mossa animale su un cordino lungo (cioè Clarac et al, 1987;. Duch &amp; Pflüger, 1995; Böhm et al, 1997;. Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) o trasmettendo i dati utilizzando dispositivi telemetrici (Kutsch et al, 1993; Fischer et al, 1996;. Tsuchida et al 2004;. Hama et al, 2007;.. Wang et al, 2008). Entrambi questi metodi eleganti, che vengono utilizzati con successo in grandi artropodi, si rivelano spesso difficili da applicare in piedi più piccoli insetti che sia facilmente impigliata nella cordino lungo o sono impediti dal peso del dispositivo telemetrico e le sue batterie. Inoltre, in tutti questi casi, è ancora impossibile distinguere tra la base puramente neuronale di locomozione e gli effetti esercitati da collegamento meccanico tra le gambe camminando attraverso il substrato. Una soluzione per questo problema è quello di condurre gli esperimenti in un animale legato, che è libero di camminare sul posto e che è sospeso a livello locale, ad esempio, su una superficie scivolosa, che rimuove efficacemente meccanica contatto più terreno. Questo è stato utilizzato per studiare le risposte di fuga (Camhi e Nolen, 1981; Camhi e Levy, 1988), trasformando (tryba e Ritzman, 2000a, b;. Gruhn et al, 2009a), indietro a piedi (Graham e Epstein, 1985) o variazioni di velocità (Gruhn et al. 2009b) e permette allo sperimentatore di combinare facilmente intra ed extracellulari fisiologia con analisi cinematica (Gruhn et al., 2006). Noi usiamo una configurazione scivolosa superficie per indagare la tempistica dei muscoli delle gambe in insetto stecco comportarsi riguardo al touch-down e lift-off in differenti paradigmi comportamentali, come camminare dritto in avanti e curve in preparati intatto e ridotto.

Descriviamo un metodo per registrare l&#39;attività motoria, programmata per il segnale elettrico registrato contatto tarsale in un insetto legati, camminare su una superficie scivolosa. Questo è utilizzato per studiare le basi neurali del comportamento adattivo sotto l&#39;influenza della ridotta interazione meccanica tra le gambe attraverso il substrato.

Studiare le basi neurali del comportamento adattivo Locomotore in Insetti

Studiando le basi neurali del comportamento del cammino, ci si trova spesso a dover affrontare il problema della difficoltà nel separare l'output del passo prodotto a livello neuronale da quelli...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la fisiologia muscolare delle zampe, nonché il loro tempo e la cinematica in un insetto legato durante diverse situazioni di cammino. L'insetto stecco raus miosis viene utilizzato per questo studio perché, rispetto a un insetto, è relativamente grande e presenta gangli segmentali chiaramente separati.Prima, l'animale viene fissato e marcato per il tracciamento video fluorescente. Successivamente, gli elettrodi EMG vengono posizionati nei muscoli protrattori e retrattori. Infine, si procede con la preparazione dell'insetto fissato per la registrazione del contatto tarsale su una superficie scivolosa.L'ultimo passaggio della procedura consiste nella registrazione simultanea dell'attività muscolare delle zampe e del contatto tarsale in diverse situazioni di cammino. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano alterazioni nei tempi di attivazione muscolare. A seconda del contesto comportamentale, una zampa viene utilizzata nel principale vantaggio di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti come lo studio.Camminare su sfere di trekking elimina l'accoppiamento meccanico con il terreno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel controllo motorio, come ad esempio quanto un singolo arto contribuisca al cammino in un animale con arti motori. Le implicazioni di questa tecnica aprono il campo allo studio del comportamento locomotorio adattativo, poiché ora possiamo analizzare le variazioni di velocità e direzione del cammino a livello del singolo arto, dimostrando che l'allestimento sarà utile.Peter Boha, un tecnico del mio laboratorio, due piastre di ottone rivestite di nichel saldamente unite e isolate l'una dall'altra mediante una striscia larga due millimetri composta da due componenti. L'epossidico viene utilizzato per preparare la superficie scivolosa per l'animale; lubrificare separatamente ciascuna metà della piastra con una miscela conduttiva di glicerina e soluzione salina utilizzando un pezzo di tessuto morbido. Se applicata correttamente, la soluzione dovrebbe avere uno spessore compreso tra 0,1 e 0,2 millimetri e creare una viscosità cinematica superficiale di circa 430 centistokes.Due schermi circolari in vetro smerigliato sono posizionati davanti alla piastra in modo che, durante un esperimento, si trovino a 70 millimetri dagli occhi dell'animale. Quando un modello di strisce in movimento viene proiettato su questi schermi, l'animale inizierà a camminare in avanti. La camminata è indotta da un modello progressivo su entrambi gli schermi con strisce che si muovono verso l'esterno oppure da un singolo raggio nero su sfondo bianco posizionato tra gli schermi, che può provocare sequenze di camminata dritta più lunghe.Se entrambi i modelli a strisce progressivi che si muovono nella stessa direzione inducono una rotazione. Una volta assemblato il setup sperimentale, l'animale può essere preparato per un esperimento utilizzando un collare in cemento dentale per fissare un insetto mante adulto femmina, con il lato ventrale rivolto verso il basso, su un sottile bastoncino, che è collegato a un tubo di ottone con una presa. La testa e le zampe sporgono dalla parte anteriore e dai lati del supporto, consentendone il libero movimento.In seguito, pigmenti fluorescenti mescolati con cemento dentale vengono utilizzati per marcare la testa, il torace e il femore distale e la tibia di ciascuna gamba per il successivo tracciamento video. L'attività muscolare dell'animale viene registrata mediante elettrodi EMG impiantati nel torace.Il segnale viene amplificato 100 volte in un preamplificatore e successivamente amplificato 10 volte e filtrato tra 100 hertz e 2000 hertz prima della conversione in un segnale digitale. Gli elettrodi sono realizzati con due fili di rame rivestiti spalmati di colla, quindi intrecciati l'uno all'altro, saldando un'estremità del filo intrecciato a un mini plug e tagliando l'altra estremità; utilizzando una punzonatrice a spillo si praticano fori minuscoli nell'esoscheletro attraverso i quali passerà l'elettrodo. Per entrare in contatto con i muscoli, posizionare il mini plug a un'estremità del filo nella presa collegata al tubo di ottone a cui è fissato l'animale.Inserire l'estremità tagliata di un elettrodo attraverso il foro appena al di sotto della cuticola in un muscolo, in modo che i due fili di ciascun elettrodo vengano posizionati in fori separati di circa un millimetro di distanza. Per mantenere i fili in posizione, si utilizza una piccola goccia di colla acrilica istologica. Un ulteriore filo viene inserito nell'addome, che fungerà da elettrodo di riferimento al fine di comprendere la relazione tra la cinematica della deambulazione dell'insetto e la fisiologia muscolare.Il contatto del tarso durante la deambulazione viene misurato durante la registrazione dell'EMG: rimuovere l'isolamento all'estremità di un pezzo di filo di rame lungo 15 centimetri con alcol, in modo da poter misurare il flusso di corrente attraverso il tarso. Successivamente, viene formato un cappio su un'estremità del filo, che viene fatto scivolare sul tarso dell'animale e stretto all'estremità distale della tibia. Il filo viene quindi fissato al torace dell'animale con una goccia di cemento dentale, e il bolso inserito nel tubo di ottone al quale è incollato l'animale viene connesso a un micromanipolatore.Per consentire la regolazione dell'altezza dell'animale tra sette e dodici millimetri sopra la superficie scivolosa, corrispondente all'altezza dell'insetto durante la camminata libera attraverso una pinza a coccodrillo, l'altra estremità del filo viene quindi collegata all'amplificatore differenziale a blocco di sincronismo. Si applica una goccia di crema elettrodica sulle aree di contatto per migliorare la conducibilità del filo. Alle sue estremità, il circuito viene completato collegando la piastra all'amplificatore mediante spine alla base della piastra.Un generatore di impulsi crea un segnale che viene applicato a entrambe le metà della piastra attraverso questi connettori. Uno dei cavi della piastra è collegato all'amplificatore e utilizzato come segnale di riferimento. Ora, con l'animale posizionato e i fili collegati, la sua zampa funge da interruttore e una corrente fluisce attraverso il tarso per chiudere il circuito tra la piastra e l'amplificatore.Questo produce un segnale con un tempo di anticipo inferiore a un millisecondo al contatto e un segnale ritardato al distacco. L'intensità del segnale viene verificata muovendo il tarso verso l'alto e verso il basso. I fili dell'EMG vengono quindi collegati agli amplificatori.Il segnale di attivazione per la telecamera viene registrato contemporaneamente al contatto tarsale e alla traccia EMG, al fine di permettere una correlazione traccia per traccia. A questo punto, è possibile registrare una sequenza di camminata con l'animale in posizione e con tutti i collegamenti attaccati. Il modello visivo e la registrazione video vengono avviati contemporaneamente per creare una registrazione visiva del movimento come controllo.Utilizzando una videocamera ad alta velocità da 100 fotogrammi al secondo, registrare il movimento delle zampe dall'alto e attraverso uno specchio posizionato a un angolo di 45 gradi dietro l'animale. Se l'animale non inizia la locomozione spontaneamente, può essere stimolato sull'addome con un pennello o con un soffio d'aria sulle antenne. Il rilevamento dei marcatori fluorescenti sull'animale può essere migliorato illuminando l'animale con un array di luci LED blu e applicando un filtro giallo all'obiettivo della videocamera.Questo sopprime la lunghezza d'onda corta della luce di attivazione e aggiunge contrasto al video. Registrare innanzitutto la sequenza di camminata dell'animale integro come controllo. La modifica degli stimoli visivi cambia la direzione della locomozione.Se desiderato, amputare le zampe stringendo il femore con un paio di pinzette e lasciare all'animale 30 minuti per riprendersi. A questo punto è possibile valutare il ruolo fisiologico delle zampe mancanti. I punti in questa immagine mostrano le posizioni degli elettrodi nei muscoli protractor e retractor della zampa media.In questa preparazione di EMG, le zampe anteriori e posteriori sono state rimosse per studiare l'effetto delle zampe adiacenti sulla cinematica e sull'attività muscolare delle zampe medie. Ora i dati in questo tracciato di un animale in curva: il tracciato superiore mostra il tracciato del contatto tarsale, mentre quello inferiore mostra l'EMG del muscolo retraente.Durante i passi in avanti all'inizio della traccia, il retraore è attivo durante la fase di appoggio, mentre l'arto è a contatto con il suolo. Dopo un breve cambio, l'arto esegue passi all'indietro e il retraore è attivo durante la fase di oscillazione, mentre l'arto è in aria. Qui sotto è mostrata una visione completa di tutti i dati raccolti mentre l'animale cammina; nella parte superiore è riportata la traccia di EMG del muscolo protraore.Al centro è mostrato il tracciato EMG dei muscoli retractor, e sotto il segnale di contatto del tarso. Nell'immagine ingrandita è possibile osservare i movimenti effettivi dell'animale catturati dalla telecamera ad alta velocità. L'attività alternata nei tracciati EMG corrisponde all'attività dei due muscoli nel ciclo del passo.Il muscolo protractore è attivo poco prima e durante la fase di oscillazione, mentre il muscolo retraore è attivo dopo il contatto con il suolo e durante la fase di appoggio. Una volta acquisita padronanza, la preparazione può essere completata in meno di 90 minuti e i dati possono essere raccolti per diverse ore successive a questa procedura. Altri metodi, come l'analisi cinematica o le registrazioni di singole cellule, possono essere eseguiti in un animale che si comporta in modo quasi integro dopo lo sviluppo di questa tecnica.Questa tecnica ha aiutato i ricercatori nel campo del controllo motorio a rispondere a domande su come singoli arti generino schemi locomotori flessibili e adattabili.

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