Name: Fabrication dhydrogels pour les systèmes de culture Micropatterned neuronaux utilisant la photolithographie dynamique projection de masque (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: Apprenez à créer des systèmes de culture neuronale microstructurés par photolithographie dynamique avec DMD. Cette méthode utilise des hydrogels photo-réticulables pour étudier la viabilité cellulaire et la croissance des neurites.

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Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire du professeur Anthony Windebank pour partager leur expertise sur les DRG dissection et la culture, ainsi que le professeur Chen Shaochen des discussions utiles sur la configuration de la DMD. Cette recherche a été financée en partie par l&#39;Université Tulane et des subventions du Conseil des régents en Louisiane (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) et le NIH (NS065374).

1. Configuration DMD <ol><li> Le conseil DMD, guide de lumière UV (avec collimateur) et objectif 4x sont tous montés à la verticale sur une table anti-vibrations. </li><li> Le guide de lumière UV devrait être ajusté afin que la lumière frappe le miroir array à un angle de 45 ° par rapport au plan des miroirs, et 24 ° en dessous du plan des miroirs (figure 1). </li><li> L'objectif est monté de telle sorte que la distance de la DMD de la lentille de l'objectif correspond à la longueur focale associée à la lentille. </li><li> Un microscope inversé est placé sous la lentille de l'objectif, tel que la lumière réfléchie par le concentré DMD peut être visualisée à travers le microscope. La distance entre la lentille de l'objectif à la surface de polymérisation doit correspondre à environ la distance de travail de la lentille. La scène sur le microscope peut alors être utilisé pour ajuster finement cette distance à focaliser l'image. Cette distance peut varier en fonction de la surface de polymérisation choisi. </li></ol> 2. Construit hydrogel double pour des cultures d'explants de tissus L'adhérence A. explant DRG <ol><li> Enduire les murs de 6 puits revêtues de collagène inserts de culture cellulaire (Corning) avec Rain-X, en prenant soin d'éviter la membrane elle-même. (Sinon, un stylo barrière hydrophobe peut être utilisé.) </li><li> Inserts Hydrater la nuit avec 1,5 mL de milieu d'adhérence dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. L'adhérence est moyenne milieu neurobasal avec 10% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine, 0.5mm L-glutamine, et 20 ug / ml de NGF. </li><li> Récolte des ganglions de la racine dorsale embryonnaire (DRG) de chiots E-15 chez le rat. GHM devrait être plaqué sur revêtues de collagène de 6 puits inserts, autant que quatre par plaquette. </li><li> Incuber inserts pendant 2 heures pour permettre l'adhésion DRG à la membrane. </li></ol> Photopolymérisation B. masque dynamique Un dispositif micromiroirs numériques (DMD) est une matrice 1024 x 768 de miroirs individuels, semblable à celui de téléviseurs à projection, ce qui reflète la lumière de façon sélective basée sur la position miroir. Pour nos besoins, le DMD est utilisée pour l'ultraviolet motif (UV) sur des hydrogels photoréticulables, la création de géométries hydrogel spécifiables d'une manière simple et rapide. La figure 1 illustre la configuration de la voie la DMD et la lumière UV. Bien que notre DMD est une unité autonome, l'appareil peut également être intégré pour une utilisation avec de nombreux microscopes existants. <ol><li> Retirez tous les excès de liquide d'insertion, et ajouter 500 ul de milieu de polymérisation à l'intérieur de l'insert. Milieu de polymérisation contient du PEG à 10% (1000 MW) et de 0,5% Irgacure 2959 dissous dans un milieu de neurobasal complété avec 20 ug / ml de NGF et de Pen 1% / Strep. </li><li> Placer l'insert sous le dispositif DMD sur une lame de Rain-X en verre traité. </li><li> Charger l'image appropriée en noir et blanc pour être utilisé comme un "photomasque" sur le DMD, grâce à l'utilisation du programme inclus GUI ALP-3 de base. Pour nos besoins, une forme bifurcation a été choisi pour permettre la mise en œuvre de systèmes d'orientation des neurites. </li><li> En utilisant un microscope inversé pour la visualisation, d'aligner les explants de tissu à l'emplacement approprié sur le photomasque utilisant une source de lumière visible se reflétant sur la DMD. </li><li> Mettez la source de lumière visible pour la source de lumière UV, et d'éclairer la solution de PEG jusqu'à réticulation est suffisante. (Pour les conditions indiquées et 5,0 Watts / cm 2 d'incident sur ​​le DMD, la réticulation peut être complétée en aussi peu que 55 secondes.) Répétez l'opération pour tous les GHM quatre sur l'insert. </li><li> Laver chaque insérer trois fois avec du DPBS stérile et 1% de Pen-Strep. </li><li> Ajouter un milieu de croissance de 1,5 ml sous les inserts de culture cellulaire, et permettent d'équilibrer dans un incubateur pendant 30 minutes. Le milieu de croissance est moyen neurobasal contenant B-27 à 2%, 1% Pen / Strep, 0.5mm L-glutamine et 20 ug / ml de NGF. </li></ol> C. hydrogel secondaire Puramatrix <ol><li> Pour des applications neuronales, Puramatrix 1% est dilué conformément aux instructions du fabricant à 0,15% en H 2 O stérile et complété avec 1 ug / ml de laminine soluble. </li><li> Tous les médias en excès doit être retiré de la PEG vides, qui contiennent les explants DRG, en utilisant un applicateur de coton stérile pointe, Kimwipe, ou micropipette. </li><li> Puramatrix est ajouté à la vides PEG avec une micropipette, afin de combler l'espace vide, sans débordement. Selon le volume de vide, généralement ~ 1 ul est utilisé par la construction. </li><li> Puramatrix commence le processus d'auto-assemblage immédiatement après le contact avec une solution salée physiologique, à savoir le PEG enflée, mais de 1,5 mL de milieu de croissance est ajouté au-dessous de l'insert et placés dans l'incubateur pendant une heure afin d'assurer la gélification totale. </li><li> Initialement, Puramatrix est légèrement acide, donc changer le support après une heure pour permettre le pH à s'équilibrer. </li><li> Changements des médias sont priés environ toutes les 48 heures. Veillez à ce que tous les médiasajouté en dessous de l'insert, pour protéger l'intégrité de Puramatrix mécaniquement faible. </li></ol> Agarose <ol><li> Pour des applications neuronales, l'agarose est dilué à une solution à 1% en milieu de croissance et placé dans un bain d'eau à 60 ° C jusqu'à ce que l'agarose dissout complètement (~ 1 h). La solution est alors complété par 1 ug / ml de laminine soluble. </li><li> Tous les médias en excès doit être retiré de la PEG vides. </li><li> L'agarose est ajouté à la PEG vides afin de combler l'espace vide, sans débordement. Selon le volume de vide, généralement ~ 1 ul est utilisé par la construction. </li><li> 1,5 ml de milieu de croissance est pré-frais (8 ° C) dans une plaque à 6 puits, et les inserts d'agarose contenant sont transférés aux médias réfrigérée et maintenue dans un réfrigérateur à 8 ° C pendant au moins trois minutes pour permettre à l'agarose gel. </li><li> Enfin, les inserts sont transférés à 1,5 mL de milieu de croissance pré-chauffée (37 ° C) et maintenu dans l'incubateur à 37 ° C, avec les changements de supports nécessaires toutes les 48 heures. </li></ol> 3. Double encapsulation cellulaire Hydrogel 3D Encapsulation hydrogel double est appropriée lorsque vous utilisez un gel de l'auto-assemblage. Le gel photoréticulables, dans ce cas, le PEG, sert de support structurel pour la présentation géométrique du gel de l'auto-assemblage, par exemple Puramatrix ou d'agarose. Certaines de ces méthodes, en particulier le type de gel et le choix du photomasque, dépendra de l'application particulière désirée. <ol><li> Charger un masque approprié sur la DMD. Pour notre survie cellulaire d'application, nous avons simplement choisi une présentation cylindrique de Puramatrix à l'aide de l'imagerie des cellules. Les chercheurs qui étudient la signalisation cellulaire pourraient être intéressés à une géométrie parcellaire pour permettre la diffusion de molécules chimiotactiques. De plus, une approximation grossière d'une artère a été montré pour représenter une éventuelle application à la recherche des vaisseaux sanguins. </li><li> Traiter les murs d'un insert de culture cellulaire de polyester avec Rain-X, et les placer sous DMD sur Rain-X lame revêtue. </li><li> Ajouter 500 ul de milieu de polymérisation à l'insert. Provoquer réticulation PEG par l'exposition à la lumière UV pendant 55 secondes. </li><li> Laver trois fois avec du DPBS stérile et 1% de Pen-Strep. </li><li> Retirez tous les supports vides en excès de la PEG. </li><li> Isoler les cellules à la densité désirée dans une pastille. Des précautions doivent être prises pour éliminer tous les moyens à partir du culot cellulaire avant de les mélanger, comme Puramatrix commence l'auto-assemblage immédiatement après le contact avec une solution saline. Suspendre l'intérieur des cellules Puramatrix 0,15% dilué dans H 2 O stérile complété avec 10% de saccharose. </li><li> Injecter l'Puramatrix / cellule / saccharose mélange à l'intérieur des vides dans le PEG. </li><li> Ajouter 1,5 mL de milieu de croissance en dessous de l'insert, et de permettre au gel de l'intérieur incubateur pendant une heure. </li><li> Changer les médias après une heure, et ~ toutes les 48 heures après. </li></ol> 4. Simple encapsulation cellulaire Hydrogel 3D Une encapsulation hydrogel unique serait approprié pour toute situation où les cellules peuvent être examinées à l'intérieur d'un hydrogel photoréticulables. <ol><li> Charger un masque approprié sur la DMD. Pour les études de survie cellulaire, nous avons de nouveau choisi un masque de base circulaire, pour représenter un cylindre. Masques similaires à celles indiquées dans la méthode 4 pourrait de nouveau être appliquée pour le champ de recherche approprié. </li><li> Traiter un insert de culture cellulaire de polyester avec Rain-X, et les placer sous DMD sur Rain-X lame revêtue. </li><li> Cellules à toute concentration désirée peut être ajouté directement à la solution de PEG 10%, en mélangeant bien pour assurer une distribution homogène. </li><li> Ajouter 500 ul de milieu de polymérisation à l'insert. Provoquer réticulation PEG par l'exposition à la lumière UV pendant 55 secondes. </li><li> Laver trois fois avec du DPBS stérile et 1% de Pen-Strep. </li><li> Remplir avec un milieu de croissance au-dessous et au-dessus de l'insert, en changeant tous les 2 jours ~. </li></ol> 5. Mince polymérisation du film d'hydrogel <ol><li> Charger un masque approprié sur la DMD. </li><li> Traiter un revêtus de collagène insert de culture cellulaire de polyester avec Rain-X, et les placer sur Rain-X lame revêtue. </li><li> Ajouter milieu de polymérisation suffisant pour simplement couvrir le fond de l'insert (~ 250-300 uL pour les inserts plaque à 6 puits). Autoriser les médias à travers la membrane d'insertion pour 30-45 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer l'excès de milieu de polymérisation l'insert avec une micropipette ou Kimwipe. Ajouter une quantité suffisante d'UV-transparente d'huile pour recouvrir complètement le fond de l'insert. Autoriser l'insertion de s'asseoir pendant 15-30 minutes à température ambiante, assez longtemps pour que l'huile pour former une couche distincte au-dessus du milieu de polymérisation saturer la membrane d'insertion. </li><li> Placer l'insert et de glisser sous la DMD. Provoquer réticulation PEG par l'exposition à la lumière UV. En raison de la minceur de la couche de PEG, la réticulation peut être complétée en aussi peu que 15 secondes à 5,0 W / cm 2 d'incident sur ​​la DMD. </li><li lavez les trois fois avec du dpbs insertion st et de pen-strep. la persistance d r huileux est une pr un doux tel que le tween peut ajout au tampon lavage.><li> Magasin de l'insert dans une plaque de 6 puits de culture de tissu. Ajouter un milieu de croissance pour les cellules en suspension, dans la concentration désirée, et la pipette un volume suffisant de la suspension cellulaire dans l'insert de culture cellulaire afin d'obtenir la densité cellulaire désirée. Ensuite, ajoutez un milieu de croissance assez en dessous de la insérez complètement à maintenir la viabilité des cellules (~ 1,5 ml). </li><li> Après 48 heures se sont écoulées, se laver les trois insérer des fois avec du DPBS stérile et 1% de Pen-Strep pour déloger les cellules non collées. Changer les médias environ une fois toutes les 48 heures. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Exemples d'hydrogel double constructions contenant des explants DRG sont présentés dans la figure 2. Remarquez que la migration cellulaire et l'extension des neurites est limitée à la région de cellules permissives de l'hydrogel double construire. La figure 3 représente cellules dissociées de la même encapsulée à l'intérieur du construit hydrogel double. En raison de la nature dynamique du photomasque DMD, la géométrie disponibles pour l'encapsulation est seulement limité par les dimensions et la résolution de l'optique. Encapsulation des cellules est également possible à l'intérieur d'un hydrogel seule photopolymérisables, PEG, et un test de viabilité vivants / morts a été réalisée, comme en témoigne la figure 4. Encapsulation dans le PEG est destinée uniquement à titre d'exemple, que le PEG ne représentent pas un environnement idéal pour des cellules neurales. Par conséquent, la viabilité cellulaire réalisé dans nos constructions PEG est compréhensible faible. Enfin, des exemples de l'utilisation des films minces de PEG comme une couche à motif contraignant pour l'adhésion cellulaire sur les inserts de culture cellulaire sont présentés dans la Figure 5. En outre, les exemples de possibles «mauvais» résultats sont proposés dans la Figure 6. Les résultats ne représentent qu'une petite fraction des utilisations possibles des méthodes développées dans notre laboratoire. Ils sont destinés à démontrer la facilité, une polyvalence et la viabilité de notre approche, et pourrait être traitée comme une «preuve de principe» pour les chercheurs à développer leurs propres adaptations possibles. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Illustration schématique de la voie de lumière utilisée pour la photolithographie. En médaillon: La lumière UV illumine le DMD à un angle de 45 °, et 24 ° en dessous du plan du tableau miroir. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Étiqueté la croissance et la prolifération des DRG hydrogel contenant des constructions double. JC) les images qui illustrent les constructions polymérisé PEG (gris) avec neurites étiquetés avec Bêta III tubuline (vert), les noyaux de cellules DAPI colorés (bleu). Les explants DRG sont contenues dans Puramatrix et situés dans les régions circulaire du modèle, avec des neurites croissante vers la bifurcation (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Construit hydrogel contenant Double cellules marquées à la calcéine AM, un marqueur de cellules vivantes, après 48 heures dans un milieu de croissance. JC) PEG formes variées, remplies de Puramatrix contenant dissocié neurones DRG (~ 5x10 3 cellules / ml). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Hydrogel simple construction contenant des cellules vivantes étiquetés avec calcéine AM (vert) et les cellules mortes étiquetés d'éthidium homodimère-1 (rouge) après 24 heures dans un milieu de croissance (5x10 3 cellules / ml). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> PEG cellulaire Figure 5. Restrictives polymérisé comme un film mince en utilisant un "modèle de test« de façon sélective adhèrent cellules dissociées à la membrane de collagène revêtement de supports perméables. A, B) Les cellules vivantes sont marquées après 48 heures avec AM calcéine (vert), tandis que les cellules mortes sont étiquetés avec éthidium homodimère-1 (rouge). Adhésion cellulaire minimale se produit dans la zone contenant le film PEG mince. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Images représentant des résultats indésirables. A) polymérisation partielle du PEG, conduisant à une PEG inutilisable construire. Polymérisation incorrecte peut se produire en raison de la présence d'un ménisque dans le milieu pré-polymère, des quantités insuffisantes de milieu de polymérisation, l'exposition aux UV insuffisante ou inadéquate attention de l'optique. B) l'image dépeignant polymérisé construit PEG (gris) avec neurites étiquetés avec Bêta III tubuline (vert), les noyaux de cellules DAPI colorés (bleu). Les neurites ont pu croître en dehors des canaux PEG motifs. Cela se produit souvent dans la condition qui déborde Puramatrix sur le dessus de la partie PEG pendant l'injection.

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Le procédé décrit ici pourrait être utilisée par tout enquêteur cherchant simple et reproductible des systèmes de culture cellulaire. Théoriquement, en raison de la grande variété d&#39;hydrogels photopolymérisables disponibles, l&#39;environnement pourrait être adapté pour permettre une utilisation avec n&#39;importe quel type cellulaire, y compris les explants de tissu ensemble. De plus, le système dual d&#39;hydrogel permet de contrôler spatiale améliorée dans la présentation de l&#39;auto-polymérisant hydrogels, qui ont tendance à former des formes amorphes sur leurs propres. Le résultat &quot;2.5D&quot; construit hydrogel micropatterned fournir une matrice 3D de croissance neuronal présenté dans une configuration 2D qui permet facilement l&#39;évaluation microscopique. Le substrat sur lequel les gels sont polymérisés peuvent également être variés, permettant un meilleur contrôle de la conception expérimentale. Nos méthodes sont optimisées pour une utilisation avec des supports de cellules perméables culture, comme nous avons vu la viabilité améliorée (figure 4) par rapport à la polymérisation sur des lames de verre (données non présentées). Toutefois, les surfaces de polymérisation d&#39;autres peuvent être plus applicable pour différentes applications: fabrication sur lames de verre utilisées dans les expériences de la microfluidique ou formations agrégat de cellules, par exemple. Notre expérience avec ces systèmes de culture a conduit à l&#39;identification des domaines potentiels de la difficulté. Tout d&#39;abord, les techniques de soin sont nécessaires pour maintenir la stérilité des constructions. En raison de la nature encombrante de la configuration de la DMD, il est difficile d&#39;opérer étapes de polymérisation dans des conditions stériles. Pour lutter contre ce problème, l&#39;étape de rinçage décrit dans les méthodes sont utiles, et les antibiotiques doivent être utilisés dans tous les médias. De plus, l&#39;épaisseur et la forme finales de la construction polymérisé est fortement dépendante du comportement des fluides du mélange de pré-polymère, et la présence d&#39;un ménisque peut se traduire par des constructions de gel qui sont trop minces ou incomplète polymérisé (figure 6). Deux mesures peuvent être prises pour minimiser la formation d&#39;un ménisque intérieur inserts de culture cellulaire. Pour hydrogels épais (&gt; 200 um), une simple couche de Rain-X autour de la paroi intérieure de l&#39;insert est suffisant. Cependant, comme décrit brièvement ci-dessus, pour les constructions minces (&lt;200 um), une couche d&#39;huile est nécessaire pour minimiser à la fois le ménisque et nient trempe oxygène de la polymérisation radicalaire. Résolution a été trouvé à être dépendante de l&#39;épaisseur, avec une diminution de la taille caractéristique réalisé avec des gels plus épais. La résolution a également varié selon que la fonction a représenté un relief positif ou négatif dans l&#39;hydrogel. Toutefois, nous avons obtenu une résolution suffisante pour des constructions avec des tailles de fonction minimale sur l&#39;échelle de ~ 100 um en utilisant des objectifs de microscope seulement comme une optique de focalisation. Nos expériences ont montré que les constructions à double hydrogel décrit ici représentent une excellente base pour la formation de base in-vitro des modèles de croissance des neurites et d&#39;orientation. La technique employée micropatterning est une adaptation des méthodes existantes 18,19, mais notre set-up a souligné un simple à mettre en œuvre la conception et a été optimisé pour la production de constructions hydrogel double sur inserts de culture cellulaire; inserts de culture cellulaire ont été essentiels pour améliorer la viabilité des cellules ainsi que réticulation autour d&#39;explants de tissus préalablement adhérentes. La portée des résultats présentés est limité par les intérêts de notre laboratoire, mais nous croyons que les méthodes décrites dans cette publication sera utile aux chercheurs la recherche d&#39;un relativement bon marché, méthode rapide et facile à utiliser pour la fabrication de culture cellulaire 3D modèles.

<table><tbody><tr><td>Dispositif numérique de micromiroirs</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>Support perméable revêtu de collagène Transwell</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>Aussi appelé insert de culture cellulaire dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Support perméable en polyester Transwell</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>Aussi appelé insert de culture cellulaire dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Milieu Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance nerveux</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Supplément B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>Huile</td><td>Utilisation d'huile de canola et d'huile de silicone</td><td></td><td>Doit être transparente aux UV et minimiser la formation de ménisque +/-</td></tr><tr><td>OmniCure Série 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication d&#39;hydrogels pour les systèmes de culture micropatterned neuronaux utilisant la photolithographie dynamique projection de masque

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

De plus en plus, les environnements à motifs de culture de cellules deviennent une technique pertinente pour étudier les caractéristiques cellulaires, et de nombreux chercheurs croient en la nécessité pour les environnements en 3D pour représenter des expériences in vitro qui permettent de mieux imiter les qualités de vivo 1-3. Des études dans des domaines tels que le cancer de recherche 4, 5 neurones d&#39;ingénierie, physiologie cardiaque 6, et interactions cellule-matrice 7,8 ont montré le comportement des cellules diffère considérablement entre les cultures traditionnelles et les constructions monocouche 3D. Les hydrogels sont utilisés comme des environnements 3D en raison de leur variété, la polyvalence et la capacité à adapter la composition moléculaire grâce à la fonctionnalisation 9-12. De nombreuses techniques existent pour la création de constructions que des cellules de soutien des matrices, y compris électrofilage 13, timbres élastomère 14, impression jet d&#39;encre 15, 16 photopatterning additif, photomasque statiques de projection-lithographie 17, et microstéréolithographie masque dynamique 18. Malheureusement, ces méthodes impliquent de multiples étapes de production et / ou équipements ne sont pas facilement adaptables à la cellule conventionnelle et méthodes de culture tissulaire. La technique employée dans ce protocole s&#39;adapte aux deux dernières méthodes, en utilisant un dispositif de micromiroirs numériques (DMD) pour créer des masques dynamiques de réticulation géométriquement spécifiques poly-(éthylène glycol) (PEG) hydrogels, induite par UV polymérisation initiée par les radicaux libres. Le résultat &quot;2.5D&quot; structures offrent un environnement contraint 3D pour la croissance neuronale. Nous employons une approche bi-hydrogel, où PEG sert une structure cellulaire région restrictive fourniture d&#39;une autre cellule, mais informes permissive d&#39;auto-assemblage de gel fait à partir de Puramatrix ou d&#39;agarose. Le processus est un moyen rapide simple d&#39;une fabrication étape qui est hautement reproductible et facilement adaptable pour une utilisation avec les méthodes classiques de culture cellulaire et des substrats. Explants de tissus entiers, tels que ganglions de la racine dorsale embryonnaire (DRG), peuvent être incorporés dans les constructions d&#39;hydrogel double pour les essais expérimentaux tels que la croissance des neurites. En outre, les cellules dissociées peuvent être encapsulés dans l&#39;hydrogel photoréticulables ou auto polymérisant, ou de manière sélective collé à la membrane cellulaire support perméable à l&#39;aide restrictive photopatterning. Utilisation de la DMD, nous avons créé des constructions hydrogel jusqu&#39;à ~ 1 mm d&#39;épaisseur, mais en couches minces (&lt;200 um) des structures de PEG ont été limités par la trempe d&#39;oxygène de la réaction de polymérisation radicalaire. Nous avons ensuite développé une technique utilisant une couche d&#39;huile au dessus du liquide de polymérisation qui a permis à la structure fine de polymérisation PEG. Dans ce protocole, nous décrivons la création rapide de systèmes d&#39;hydrogel 3D pour la production de cellules neurales microfabriqué et cultures de tissus. Les constructions d&#39;hydrogel double démontré ici représentent polyvalent des modèles in vitro qui peuvent s&#39;avérer utiles pour les études en neurosciences impliquant la survie cellulaire, la migration et / ou la croissance des neurites et d&#39;orientation. Par ailleurs, comme le protocole peut travailler pour de nombreux types d&#39;hydrogels et les cellules, les applications potentielles sont à la fois varié et vaste.

Des techniques simples sont décrites pour la production rapide de systèmes de culture microfabriqué neurones en utilisant un dispositif micromiroirs numériques pour la lithographie masque de projection dynamique sur réguliers des substrats de culture cellulaire. Ces systèmes de culture peut être plus représentatif de l&#39;architecture biologique naturel, et les techniques décrites peuvent être adaptées pour de nombreuses applications.

Fabrication d&#39;hydrogels pour les systèmes de culture Micropatterned neuronaux utilisant la photolithographie dynamique projection de masque

De plus en plus, les environnements de culture cellulaire structurés deviennent une technique pertinente pour étudier les caractéristiques cellulaires, et de nombreux chercheurs sont convaincus de la ...

L'objectif général de cette procédure est de créer un système de culture cellulaire à double hydrogel microstructuré pour des études neuronales. Cela est réalisé en premier lieu en ensemencant des implants tissulaires, tels que des ganglions de la racine dorsale embryonnaires, sur des inserts de culture cellulaire perméables. Ensuite, un micro motif est créé dans un hydrogel photoactivable par réticulation à l'aide d'un dispositif micro-miroir numérique ou DMD agissant comme masque photo dynamique.Cela est suivi par l'ajout du gel hydrophile auto-assemblant comme Pure, qui peut contenir une suspension de cellules dissociées. Un temps d'incubation approprié est nécessaire avant l'analyse cellulaire. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant la viabilité des cellules neuronales et la croissance des neurites à travers des configurations géométriques spécifiques définies par la DMD.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'une masse photo dynamique peut être rapidement créée, modifiée et projetée à distance afin de s'adapter à presque tout type de substrat, comme des inserts perméables pour la culture cellulaire. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les systèmes neuronaux, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes qui pourraient bénéficier de contraintes géométriques spécifiques, tels que la signalisation cellulaire, la migration cellulaire, le contact entre cellules ou la morphogenèse, pour n'en citer que quelques-uns. Les lampes UV du tableau DMD, le guide et l'objectif de quatre fois sont tous montés verticalement sur une table d'isolation vibratoire.Un microscope inversé est placé sous l'objectif de manière à ce que la lumière focalisée réfléchie par le DMD puisse être visualisée à travers le microscope. Pour plus de détails sur l'installation du DMD, veuillez consulter le protocole écrit associé. Préparez d'abord les six inserts de culture cellulaire revêtus de collagène pour recevoir les explants X : enduisez les parois des inserts de culture cellulaire avec Rain X, en prenant soin de ne pas appliquer Rain X directement sur la membrane elle-même.Ensuite, ajouter 1,5 millilitre de milieu aian dans les inserts et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, après avoir récolté les ganglions de la racine dorsale embryonnaires à partir de ratons E 15, déposer jusqu'à quatre DRG sur chaque insert de plaque de six puits revêtu de collagène et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin de permettre l'adhésion des DRG à la membrane.Après la période d'incubation, les ganglions rachidiens seront prêts pour la photopolymérisation. Un dispositif numérique de micro-miroirs est un réseau composé de 1024 × 768 micro-miroirs individuels, qui réfléchissent sélectivement la lumière en fonction de la position de chaque miroir. Dans cette procédure, le dispositif est utilisé pour projeter une lumière ultraviolette selon un motif défini sur des hydrogels photoactivables, créant ainsi des géométries d'hydrogel spécifiques de manière simple et rapide.Bien que notre DMD soit une unité autonome, l'appareil peut également être intégré à de nombreux microscopes existants. Commencez par retirer les plantes DRGX de l'incubateur, puis aspirez tout liquide excédentaire présent dans l'insert. Ajoutez ensuite 500 microlitres de milieu de polymérisation à l'intérieur de l'insert.Transférez les inserts avec les plantes DRGX sur une lame en verre rainurée et placez la lame sous le DMD. Utilisez le programme d'interface graphique utilisateur de base ALP pour charger l'image en noir et blanc qui servira de masque photographique sur le DMD. Dans ce cas, une forme bifurquée a été choisie afin de permettre la mise en œuvre de systèmes de guidage des neurites à l’aide d’un microscope inversé et d’une source de lumière visible DI.Alignez l'explant tissulaire à l'emplacement approprié sur le masque photo en utilisant la lumière réfléchie par le DMD comme guide. Ensuite, remplacez la source de lumière visible par une source de lumière UV. Illuminez le milieu de polymérisation à l'intérieur de la culture cellulaire.Insérez jusqu'à ce que la réticulation du PEG soit complète. Répétez pour chaque ganglion rachidien sur l'insert. Lavez ensuite chaque insert trois fois avec du tampon phosphate salin stérile contenant 1 % de pénicilline-streptomycine.Enfin, ajouter 1,5 millilitre de milieu de croissance sous les inserts de culture cellulaire et laisser équilibrer dans une étuve à culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Pendant la période d'incubation, soniquer la matrice pure pendant 30 minutes. Pour solubiliser les peptides, diluer la solution fournie à 1 % jusqu'à 0,15 % dans de l'eau stérile et compléter avec un microgramme par millilitre de laminine soluble.Après 30 minutes, retirez les cultures de l'incubateur et aspirez tout excès de milieu à partir de l'insert. Ensuite, tout en visualisant le vide au microscope, aspirez le milieu à l'intérieur de la zone vidée dans la construction en PEG contenant le DRGX, puis aspirez environ un microlitre de la solution matricielle pure dans le vide autour de l'explant X. Veillez à ce que la matrice pure ne déborde pas du vide du picot.Ensuite, pipeter 1,5 millilitre de milieu de croissance sous l'insert et placer au four à culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Pour assurer une saturation totale après ce délai, remplacer le milieu de croissance, puis remettre les cultures dans l'incubateur. Le milieu de croissance est remplacé toutes les 48 heures de culture.Des exemples de constructions de double hydrogel contenant des explants de DRGX sont présentés ici. Les explants de DRGX ont été marqués pour les marqueurs de croissance et de prolifération. La construction de PEG polymérisé apparaît en gris, les NEURITES du GDR marquées avec la tubuline bêta trois apparaissent en vert et la coloration au DPI révèle les noyaux cellulaires en bleu.Remarquez que la migration cellulaire et l'extension des réticulations sont limitées à la région perméable aux cellules du construct bifonctionnel à base d'hydrogel. L'encapsulation par double hydrogel est appropriée lorsqu'on utilise tout gel auto-assemblable ou tout gel réticulable par la lumière. Dans ce cas, le PEG sert de support structurel à la présentation géométrique du gel auto-assemblable.Par exemple, matrice pure ou aris. Le type de gel et le choix du masque photo dépendront de l'application souhaitée. Traitez les parois d'un insert pour culture cellulaire en polyester avec du rain X comme cela a été démontré précédemment.Transférez l'insert sur une lame revêtue de rain X et placez-la sous le DMD. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu de polymérisation à l'insert. Chargez le masque approprié sur le DMD pour cette expérience de survie.Une présentation cylindrique de matrice pure est utilisée pour faciliter l'imagerie des cellules. Exposer l'insert à la lumière UV pendant 55 secondes pour induire la réticulation des crampons après la réticulation. Laver le vide nouvellement formé avec du DPBS stérile et du 1 % pen strep.Utilisez une micropipette ou un applicateur stérile en coton pour éliminer tout liquide excédentaire du vide. Préparez du Matrixx pur en le soumettant à une sonication pendant 30 minutes, diluez-le à 0,15 % dans de l'eau stérile, complété par un microgramme par millilitre de laminine soluble et 10 % de saccharose. Ensuite, récupérez les cellules à cultiver par centrifugation.Aspirez soigneusement le milieu du culot cellulaire et resuspendez le culot à une concentration d'environ cinq fois 10 à la puissance trois cellules par millilitre dans la solution de matrice pure à 0,15 %. Il est essentiel d'aspirer complètement tout le milieu du culot cellulaire, car la matrice pure commence l'auto-assemblage dès son contact avec une solution saline. Ensuite, pipetez environ un microlitre du mélange cellulaire de matrice pure supplémenté dans l'espace vide du plot.Ce volume est généralement suffisant pour remplir l'espace vide sans déborder, en ajoutant 1,5 millilitre de milieu de croissance sous l'insert. Ensuite, placer l'hydrogel secondaire matriciel pur dans l'incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure afin de garantir une gélification complète. Au terme de cette période, aspirer le milieu et ajouter du milieu frais sous l'insert, en prenant soin de ne pas endommager le matériau matriciel pur, mécaniquement fragile.Replacer les cultures dans l'incubateur de culture tissulaire et changer le milieu toutes les 48 heures. Voici des exemples de neurones du ganglion de la racine dorsale vivants encapsulés à l'intérieur de diverses constructions de double hydrogel. Après 48 heures en milieu de croissance, les cellules ont été marquées au calcium, un marqueur de cellules vivantes qui apparaît en vert.Ici, en raison de la nature dynamique du masque photo de DMD, la géométrie disponible pour l'encapsulation n'est limitée que par les dimensions et la résolution de l'optique. Une encapsulation unique dans un hydrogel convient lorsque les cellules peuvent être examinées à l'intérieur d'un hydrogel photo-polymerisable, similaire à la culture cellulaire en polyester. Insérez avec une lame rainée X et placez-la sous le DMD sur une lame recouverte de rainure X.Comme précédemment, pipetez les cellules à cultiver directement dans le milieu de polymérisation à la concentration souhaitée et mélangez soigneusement pour assurer une distribution homogène. Ensuite, pipetez 500 microlitres du mélange cellulaire dans le milieu de polymérisation dans l'insert. Choisissez le masque approprié et chargez-le sur le DMD afin d'induire la réticulation du PEG par exposition à la lumière UV pendant 55 secondes.Pour les études de survie cellulaire, un masque circulaire de base est utilisé pour représenter un cylindre. Rincez l'insert trois fois avec du DPBS stérile contenant 1 % de pénicilline-streptomycine, puis ajoutez 1,5 millilitre de milieu de croissance sous l'insert et une quantité suffisante de milieu de croissance au-dessus pour immerger complètement l'insert. Incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, avec des changements de milieu tous les 48 heures. Voici un exemple de neurones corticaux dissociés vivants encapsulés à l'intérieur de PEG. Les cellules vivantes sont marquées au calcium AM et apparaissent en vert, tandis que les cellules mortes sont marquées à l'homodimère Ahy 1 et apparaissent en rouge.L'encapsulation dans le PEG ne doit être considérée que comme un exemple, car le PEG ne constitue pas un environnement idéal pour les cellules neuronales. La géométrie choisie représente un moyen simple d'étudier la viabilité cellulaire, mais pourrait être adaptée à un large éventail de structures. Des hydrogels en couche mince peuvent être utilisés pour générer des motifs spécifiques de restriction cellulaire.De nouveau, traitez l'insert en polyester pour culture cellulaire avec du rain X comme précédemment et placez-le sur une lame traitée au rain X. Ensuite, pipetez de 250 à 300 microlitres de milieu de polymérisation dans le fond de l'insert pour culture cellulaire traité. Ce volume suffit juste à recouvrir le fond de l'insert. Incubez à température ambiante pendant 30 à 45 minutes pour permettre au milieu de pénétrer la membrane de l'insert, puis aspirez le milieu excédentaire de l'insert à l’aide d’une micropipette.Ensuite, pipeter une quantité suffisante d'huile transparente aux UV au fond de l'insert pour recouvrir complètement la zone. Incuber l'insert à température ambiante pendant 15 à 30 minutes, un délai suffisant pour que l'huile forme une couche distincte au-dessus du milieu de polymérisation. Pour saturer la membrane de l'insert, charger un masque approprié sur le DMD.Après avoir placé l'insert et la lame sous le DMD, induire la réticulation par photoactivation aux rayons UV. Laver l'insert trois fois avec du DPBS stérile contenant 1 % de pénicilline-streptomycine, puis transférer l'insert dans une plaque de culture tissulaire à six puits. Récolter et mettre en pellet les cellules à cultiver. Aspirer le milieu et resuspendre le culot cellulaire dans du milieu de croissance à la concentration souhaitée, comprise entre 10⁴ et 10⁶ cellules par millilitre.Ensuite, pipeter un volume suffisant de la suspension cellulaire à l'intérieur de l'insert de culture cellulaire pour obtenir la densité cellulaire souhaitée. Ajouter suffisamment de milieu de croissance sous l'insert pour maintenir complètement la viabilité cellulaire. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone après 48 heures d'incubation.Lavez l'insert trois fois avec du DPBS stérile contenant 1 % de pénicilline-streptomycine pour détacher les cellules non adhérentes. Ajoutez ensuite un milieu de croissance frais dans les puits. Replacez la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire et effectuez un changement de milieu toutes les 48 heures.Ici, le PEG restrictif pour les cellules a été polymérisé sous forme de film mince à l’aide d’un motif test permettant d’adhérer sélectivement les cellules dissociées à la membrane recouverte de collagène des supports perméables. Les cellules ont été marquées après 48 heures d’incubation. Les cellules vivantes marquées avec le calcéine AM apparaissent vertes, tandis que les cellules mortes sont marquées avec l’hétérodimère d’ethidium et apparaissent rouges.On peut observer qu'une aianisation cellulaire minimale se produit dans la zone contenant leur fine couche de PEG. Ceci constitue un exemple de résultat indésirable. Une polymérisation partielle du PEG a produit une structure de PEG inutilisable.Une polymérisation inappropriée peut survenir en raison de la présence d'un ménisque dans le milieu pré-polymère, de quantités insuffisantes de polymérisation, de milieu, d'une exposition insuffisante aux UV ou d'un mauvais réglage du focus des optiques. Ceci constitue un exemple d'encapsulation tridimensionnelle médiocre par double hydrogel de culture végétale A-D-R-G-X. Sur cette image, on observe que les neurites visibles en vert ont pu croître à l'extérieur des canaux de plots structurés.Cela se produit souvent si la matrice pure déborde sur la partie PEG lors de l'injection. Suivre cette procédure. D'autres méthodes classiques comme le patch-clamp ou l'immunohistochimie peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que l'électrophysiologie ou l'expression phénotypique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la lithographie par projection de masque dynamique pour définir la présentation géométrique de systèmes d'hydrogels simples ou doubles destinés à l'étude de cultures cellulaires neuronales.

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