Fabrication d'hydrogels pour les systèmes de culture Micropatterned neuronaux utilisant la photolithographie dynamique projection de masque

L’objectif général de cette procédure est de créer un système de culture cellulaire à double hydrogel à micro-motifs pour les études neuronales. Ceci est accompli en plaquant d’abord des implants tissulaires tels que des ganglions embryonnaires de la racine dorsale sur des inserts de culture cellulaire perméables. Ensuite, un micro-motif est créé dans un hydrogel photo-réticulable à l’aide d’un dispositif numérique à micro-miroir ou DMD comme masque photo dynamique.

Ceci est suivi par l’ajout de l’hydrogel auto-assemblé comme pur, qui peut contenir une suspension de cellules dissociées. Un temps d’incubation approprié est nécessaire avant l’analyse cellulaire. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la viabilité des cellules neuronales et la croissance des neurites à travers des configurations géométriques spécifiques définies par le DMD.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’une photomasse dynamique peut être rapidement créée, modifiée et projetée à distance pour s’adapter à presque tous les substrats tels que les inserts de culture cellulaire perméables. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des systèmes neuronaux, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes qui pourraient bénéficier de contraintes géométriques spécifiables telles que la signalisation cellulaire, la migration cellulaire, le contact de cellule à cellule ou la morphogenèse, pour n’en nommer que quelques-uns. Le panneau DMD, le guide de lumières UV et la lentille quatre fois objectif sont tous montés verticalement sur une table d’isolation des vibrations.

Un microscope inversé est placé sous la lentille de l’objectif de sorte que la lumière focale réfléchie par le DMD puisse être visualisée à travers le microscope. Pour plus de détails sur la configuration de DMD, veuillez consulter le protocole écrit ci-joint. Tout d’abord, préparez les six inserts de culture cellulaire bien enrobés de collagène pour recevoir X explan cultures recouvrez les parois des inserts de culture cellulaire avec de la pluie x, en prenant soin de ne pas appliquer de pluie X sur la membrane elle-même.

Ajoutez ensuite 1,5 millilitre de média aïan dans les inserts et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, après la récolte des ganglions embryonnaires de la racine dorsale de E 15, les petits rats plaquent jusqu’à quatre DRG sur chaque enduit de collagène. Six. Bien insérer et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour permettre au DRG d’adhérer à la membrane.

Après la période d’incubation, les DRG seront prêts pour la photopolymérisation. Un dispositif numérique à micro-miroir est un réseau de 1024 par 768 miroirs individuels, qui réfléchit sélectivement la lumière en fonction de la position du miroir. Dans cette procédure, le DMD est utilisé pour modeler la lumière ultraviolette sur des photo-CRO, des hydrogels reliables, créant ainsi des géométries d’hydrogel spécifiables de manière simple et rapide.

Bien que notre DMD soit une unité autonome, l’appareil peut également être intégré pour une utilisation avec de nombreux microscopes existants. Tout d’abord, récupérez les plantes DRGX de l’incubateur, aspirez tout excès de liquide de l’insert. Ajoutez ensuite 500 microlitres de milieu de polymérisation à l’intérieur de l’insert.

Transférez les inserts avec les plantes DRGX sur une lame de verre imperméable et placez la diapositive sous le DMD. Utilisez le programme d’interface utilisateur graphique de base ALP trois pour charger l’image en noir et blanc qui sera utilisée comme masque photo sur le DMD. Dans ce cas, une forme bifurquante a été choisie pour permettre la mise en œuvre de systèmes de guidage de neurites à l’aide d’un microscope inversé et d’une source de lumière visible DI.

Alignez l’explan de tissu avec l’emplacement approprié sur le masque photo en utilisant la lumière réfléchie par le DMD comme guide. Ensuite, remplacez la source de lumière visible par une source de lumière UV. Illuminez le milieu de polymérisation à l’intérieur de la culture cellulaire.

Insérer jusqu’à ce que la réticulation du PEG soit terminée. Répétez l’opération pour chaque DRG sur l’insert. Ensuite, lavez chaque insert trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate dcos stérile contenant 1 % de pénicilline streptomycine.

Enfin, ajoutez 1,5 millilitre de milieu de croissance sous les inserts de culture cellulaire et laissez équilibrer dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Pendant la période d’incubation, sonicer la matrice pure pendant 30 minutes. Pour solubiliser les peptides, diluez la solution à 1 % fournie à 0,15 % dans de l’eau stérile et complétez avec un microgramme par millilitre de laminine soluble.

Après 30 minutes, retirez les cultures de l’incubateur et aspirez tout le milieu en excès de l’insert. Ensuite, tout en visualisant le vide au microscope, aspirez le milieu de l’intérieur de la zone vide dans la construction PEG contenant la pipette d’explan DRGX autour d’un microlitre de solution matricielle pure dans le vide autour de l’explan X. Assurez-vous que la matrice pure ne déborde pas du vide de cheville.

Ensuite, pipetez 1,5 millilitre de milieu de croissance sous l’insert et placez-le dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Pour assurer la totalisation après cette période, remplacez le milieu de culture, puis retournez les cultures dans l’incubateur. Le milieu de culture est remplacé toutes les 48 heures de culture.

Des exemples de constructions d’hydrogel double contenant des plantes DRGX sont présentés ici. Les plantes DRGX ont été étiquetées pour leurs marqueurs de croissance et de prolifération. La construction PEG polymérisée apparaît grise, les DRG NEURITES marqués à la tubuline bêta-trois apparaissent vertes et les noyaux cellulaires de coloration DPI sont bleus.

Notez que la migration cellulaire et l’extension réactive sont limitées à la région permissive cellulaire de la construction à double hydrogel. L’encapsulation double hydrogel est appropriée lors de l’utilisation de tout gel auto-assemblé, le gel photo-réticulable. Dans ce cas, le PEG sert de support structurel pour la présentation géométrique du gel auto-assemblé.

Par exemple, matrice pure ou aris. Le type de gel et le choix du masque photo dépendront de l’application souhaitée. Traitez les parois d’un insert de culture cellulaire en polyester avec de la pluie X comme démontré précédemment.

Transférez l’insert sur une diapositive enduite de pluie X et placez-la sous le DMD. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de média de polymérisation dans l’insert. Chargez le masque approprié sur le DMD pour cette expérience de survie.

Une présentation cylindrique de matrice pure est utilisée pour faciliter l’imagerie des cellules. Exposez l’insert à la lumière UV pendant 55 secondes pour induire la réticulation des chevilles après la réticulation. Lavez le vide nouvellement formé avec du DPBS stérile et du streptocoque à 1 %.

Utilisez une micro-pipette ou un applicateur stérile à embout en coton pour retirer tout excès de liquide du vide. Préparez Matrixx pur de Sonicate pendant 30 minutes, dilué à 0,15 % dans de l’eau stérile, complété par un microgramme par millilitre de laminine soluble et 10 % de saccharose. Ensuite, granulez les cellules à cultiver par centrifugation.

Aspirez soigneusement le milieu de la pastille cellulaire et remettez la pastille en suspension à une concentration d’environ cinq fois 10 pour les trois cellules par millilitre dans la solution matricielle pure à 0,15 %. Il est essentiel que tout le milieu soit aspiré à partir de la pastille de cellule, car la matrice pure commence à s’auto-assembler au contact d’une solution saline. Ensuite, pipetez environ un microlitre du mélange de cellules matricielles pures supplémentées dans le vide de la cheville.

Ce volume est généralement suffisant pour remplir l’espace vide sans faire déborder la pipette de 1,5 millilitres de milieu de croissance sous l’insert. Ensuite, placez l’hydrogel secondaire à matrice pure dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure pour assurer une gélification totale après cette période, aspirez le milieu et ajoutez du milieu frais sous l’insert. En prenant soin de ne pas endommager la matrice pure mécaniquement faible.

Remettez les cultures dans l’incubateur de culture tissulaire et changez de milieu toutes les 48 heures de culture. Voici des exemples de neurones DRG vivants encapsulés dans une variété de constructions d’hydrogel doubles. Après 48 heures dans un milieu de croissance, les cellules ont été marquées avec du calcium am, un marqueur cellulaire vivant qui apparaît vert.

Ici, en raison de la nature dynamique du masque photo DMD, la géométrie disponible pour l’encapsulation n’est limitée que par les dimensions et la résolution de l’optique. Une encapsulation d’hydrogel unique est appropriée lorsque les cellules peuvent être examinées à l’intérieur d’un hydrogel photoréticulable fidèle à la culture cellulaire de polyester. Insérez avec rain X et placez-le sous le DMD sur une diapositive enduite de pluie X.

Comme précédemment, pipetez les cellules à cultiver directement dans le milieu de polymérisation à la concentration souhaitée et mélangez bien pour assurer une distribution homogène. Ensuite, pipetez 500 microlitres du mélange de cellules moyennes de polymérisation dans l’insert. Choisissez le masque approprié et chargez-le sur le DMD induisant une réticulation PEG par exposition à la lumière UV pendant 55 secondes.

Pour les études de survie cellulaire, un masque circulaire de base est utilisé pour représenter un cylindre qui lave l’insert trois fois avec du DPBS stérile et 1 % de streptocoque, puis pipette 1,5 millilitres de milieu de croissance sous l’insert et suffisamment de milieu de croissance sur le dessus pour immerger complètement l’insert à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec des changements de milieu toutes les 48 heures. Voici un exemple de neurones corticaux dissociés en direct encapsulés à l’intérieur d’une cheville. Les cellules vivantes sont marquées avec du calcium am et apparaissent vertes tandis que les cellules mortes sont marquées avec un homodimère ahy et apparaissent rouges.

L’encapsulation dans le PEG n’est qu’un exemple, car le PEG ne représente pas un environnement idéal pour les cellules neurales. La géométrie choisie représente un moyen simple d’étudier la viabilité cellulaire, mais pourrait être adaptée à un large éventail de structures. Les hydrogels à couche mince peuvent être utilisés pour générer des motifs spécifiques de cellules restreintes.

Encore une fois, traitez l’insert de culture cellulaire en polyester avec de la pluie X comme précédemment et placez-le sur une lame traitée à la pluie X. Ensuite, pipetez 250 à 300 microlitres de milieu de polymérisation dans le fond de l’insert de culture cellulaire traité. Ce volume est suffisant pour couvrir le fond de l’insert, incuber à température ambiante pendant 30 à 45 minutes pour permettre au milieu de pénétrer dans la membrane de l’insert, aspirer l’excès de milieu de l’insert avec une micro pipette.

Ensuite, pipetez une quantité suffisante d’huile transparente UV dans le fond de l’insert pour couvrir complètement la zone. Incuber l’insert à température ambiante pendant 15 à 30 minutes, ce qui est assez long pour que l’huile forme une couche distincte au-dessus du milieu de polymérisation. En saturant la membrane d’insertion, chargez un masque approprié sur le DMD.

Après avoir placé l’insert et glissé sous le DMD, induire la réticulation de la cheville par exposition à la lumière UV. Après le lavage, lavez l’insert trois fois avec du DPBS stérile et une sangle de stylo à 1 %, transférez l’insert dans une plaque de culture tissulaire à six puits et granulez les cellules à cultiver. Aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de croissance à la concentration souhaitée entre 10 à quatre et 10 à six cellules par millilitre.

Ensuite, pipetez un volume suffisant de suspension cellulaire à l’intérieur de l’insert de culture cellulaire pour obtenir la densité cellulaire souhaitée. Ajoutez suffisamment de milieu de croissance sous l’insert pour maintenir complètement la viabilité cellulaire. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone après 48 heures d’incubation.

Lavez l’insert trois fois avec du DPBS stérile et du streptocoque à 1 % pour déloger les cellules non aérées. Ajoutez ensuite un milieu de croissance frais dans les puits. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire et effectuez des changements de milieu toutes les 48 heures.

Ici, le PEG restrictif cellulaire a été polymérisé sous forme de film mince à l’aide d’un motif de test pour faire adhérer sélectivement les cellules dissociées à la membrane recouverte de collagène de supports perméables. Les cellules ont été marquées après 48 heures d’incubation. Les cellules vivantes marquées avec calc am apparaissent vertes tandis que les cellules mortes sont marquées avec l’homodimère d’atérium un et apparaissent en rouge.

On peut voir qu’un minimum d’aian cellulaire se produit dans la zone contenant leur mince film PEG. Il s’agit d’un exemple de résultat indésirable. La polymérisation partielle du PEG a rendu inutilisable une construction peg

Une polymérisation incorrecte peut se produire en raison de la présence d’un ménisque dans le milieu prépolymère, de quantités insuffisantes de polymérisation, de milieu, d’une exposition insuffisante aux UV ou d’une mauvaise focalisation de l’optique. Il s’agit d’un exemple d’une mauvaise encapsulation 3D à double hydrogel de la culture végétale A-D-R-G-X. Sur cette image, on peut voir que les neurites visibles en vert ont pu se développer en dehors des canaux de cheville à motifs.

Cela se produit souvent si la matrice pure déborde sur la partie PEG pendant l’injection. En suivant cette procédure. D’autres méthodes standard telles que le clampage par patch ou l’immunohistochimie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que l’électrophysiologie ou l’expression phénotypique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la photolithographie à projection de masque dynamique pour spécifier la présentation géométrique des systèmes d’hydrogel simples ou doubles pour l’étude des cultures de cellules neuronales.