Etudier Trajectoires Cellule roulant sur les Patterns récepteur asymétrique
13 février 2011
Nous décrivons un protocole d'observer et d'analyser les trajectoires de cellules roulant sur des récepteurs asymétriques des substrats. Les données obtenues sont utiles pour l'ingénierie des récepteurs des substrats pour les sans étiquette de séparation des cellules et l'analyse.
Ce protocole observe et analyse les trajectoires de roulement des cellules sur des motifs asymétriques de récepteurs afin de faciliter la conception de substrats à motifs de récepteurs pour la séparation et l'analyse de cellules sans marquage. Commencez par une impression en contact microscopique de molécules de PEG sur un substrat d'or pour créer des motifs alternés de monocouches auto-assemblées, puis complétez le substrat avec du P-selectine et des récepteurs. Ensuite, insérez le substrat dans la chambre à écoulement. Faites circuler les cellules HL-60 dans la chambre.
Enregistrez une séquence d'images de l'interaction de roulement des cellules HL 60 sur des motifs de P-sélectine et analysez les images converties à partir de la vidéo. Les trajectoires du bord des cellules en roulement, ainsi que la longueur du suivi et les vitesses de roulement sur le plan, dans la région et au niveau du bord peuvent être obtenues à l'aide d'un programme MATLAB. Cette méthode permet de comprendre comment les cellules HO 60 se déplacent sur des motifs de récepteurs asymétriques sous écoulement cisaillant.
Cela peut être appliqué pour quantifier d'autres interactions à la surface des cellules, ainsi que pour l'analyse directe des cellules en observant leurs trajectoires sur des motifs de récepteurs. Et également pour la conception de dispositifs microscopiques de fixation destinés à la séparation des cellules. L'impression par microcontact est utilisée pour créer des motifs alternés de monocouches auto-assemblées de molécules de PEG sur un substrat d'or.
Imprégnez d'abord le tampon en PDMS avec une solution de PEG à cinq millimolaire dans l'éthanol. Séchez la surface pendant 20 minutes. Posez délicatement le tampon sur la surface d'or pendant 40 secondes et assurez-vous qu'il y ait un bon contact entre la surface d'or et le tampon.
Aucune pression excessive n'est requise. Rincez la surface avec de l'éthanol et séchez-la sous un courant d'azote. En utilisant maintenant une chambre de perfusion, incubez les substrats avec une solution de P-sélectine à 15 microgrammes par millilitre pendant trois heures à température ambiante afin de marquer les zones restantes avec la P-sélectine, rincez la chambre, puis comblez les surfaces avec une solution de BSA à un milligramme par millilitre pendant une heure pour bloquer les interactions non spécifiques.
Rincer la surface avec du tampon DPBS avant de réaliser l'expérience de roulement cellulaire. Assembler la chambre à écoulement, puis faire circuler une suspension de 10 puissance 5 cellules par millilitre. Faire circuler les cellules HL-60 sur le motif, les surfaces étant placées dans une chambre à écoulement rectangulaire avec des angles d'inclinaison du motif de récepteurs de 10 degrés.
À température ambiante de 24,5 degrés Celsius. Régler la pompe à seringue pour générer un débit de 75 microlitres par minute, correspondant à une contrainte de cisaillement laminaire de 0,5 dynes par centimètre carré. Ensuite, à l’aide d’un microscope inversé équipé d’une caméra montée, enregistrer le roulement des HL-60.
Interactions avec les adhésines p, les sélectines et les substrats. Utiliser un objectif 4 x à une fréquence d'une image par seconde pendant des durées de 300 secondes. Réaliser trois expériences indépendantes.
Présenter les données sous forme de moyenne et d'écart type des valeurs moyennes obtenues à partir de chaque expérience. Les images au microscope converties à partir de la vidéo de HL 60.Rolling. Les interactions avec les substrats adhésifs p-sélectine montrent des régions claires et sombres correspondant respectivement aux régions du récepteur p-sélectine et aux régions de PEG.
Les trajectoires sont délimitées à l'aide d'un programme MATLAB personnalisé ici. L'angle d'inclinaison du bord était de 10 degrés et la contrainte de cisaillement était de 0,5 dines par centimètre carré. D'autres analyses portent sur la distribution de la longueur de suivi en bordure, la valeur moyenne de la longueur de suivi en bordure, ainsi que sur VE et VP, les vitesses de roulement en bordure et à l'intérieur des bandes.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser les trajectoires cellulaires sur les motifs asymétriques de récepteurs.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Ce protocole observe et analyse les trajectoires de roulement des cellules sur des motifs asymétriques de récepteurs afin de faciliter l'ingénierie de substrats à motifs de récepteurs pour la séparation et l'analyse de cellules sans marquage.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Biomatériaux
- Microfluidique
Contexte
- Le roulement cellulaire est un processus essentiel dans diverses interactions biologiques.
- Des motifs asymétriques de récepteurs peuvent influencer le comportement cellulaire.
- Les techniques sans marquage sont essentielles pour la séparation et l'analyse des cellules.
- La micro-impression par contact est une méthode utile pour créer des substrats structurés.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole permettant d'observer le roulement cellulaire sur des substrats fonctionnalisés par des récepteurs.
- Analyser les trajectoires des cellules roulantes afin d'améliorer la conception des substrats.
- Fournir des informations sur la dynamique du déplacement cellulaire en conditions d'écoulement.
Méthodes utilisées
- Micro-impression par contact de molécules de PEG sur un substrat en or.
- Création de motifs alternés de monocouches auto-assemblées.
- Remplissage rétroactif du substrat avec du P-sélectine et des récepteurs.
- Incorporation d'une chambre d'écoulement et observation de cellules HL-60 roulant sur les motifs.
Résultats principaux
- Des séquences d'images des interactions des cellules HL-60 ont été enregistrées.
- Les trajectoires des cellules roulantes ont été analysées à l'aide de MATLAB.
- Des données sur la longueur de suivi des bords et les vitesses de roulement ont été obtenues.
- Des informations sur le déplacement cellulaire sur des motifs asymétriques de récepteurs ont été fournies.
Conclusions
- Le protocole permet une analyse détaillée de la dynamique du roulement cellulaire.
- Des motifs récepteurs asymétriques peuvent être conçus pour une séparation efficace des cellules.
- Cette méthode contribue à la compréhension du comportement cellulaire en écoulement cisaillant.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La compréhension des trajectoires de roulement des cellules sur des motifs asymétriques de récepteurs permet la conception rationnelle de dispositifs de séparation microfluidiques sans marquage. Ce protocole fournit des données quantitatives sur la longueur de suivi en bordure et la vitesse de roulement sous une contrainte de cisaillement définie, soutenant la modélisation prédictive du comportement cellulaire en écoulement. Ces connaissances réduisent les itérations empiriques en ingénierie de dispositifs destinés aux flux de purification cellulaire et d'analyse phénotypique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des cinétiques de liaison ligand-récepteur sous cisaillement physiologique, apportant des informations pour la validation de cibles dans les voies médiées par l'adhésion.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode sans marquage pour évaluer l'activité fonctionnelle des récepteurs, sans recourir à des marqueurs fluorescents ou à des capteurs génétiques.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives sur la vitesse de roulement cellulaire et la longueur de suivi du bord pour une analyse comparative selon les densités de récepteurs ou les géométries de motifs.
- Valeur opérationnelle : Normalise la préparation des substrats par impression en microcontact et l'intégration dans une chambre à écoulement afin d'obtenir des tests d'adhésion reproductibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet de réduire les risques mécanistiques des stratégies de séparation par adhésion en reliant la conception des motifs de récepteurs aux résultats observables en termes de trajectoire cellulaire.
- Valeur opérationnelle : Permet le criblage de phénotypes cellulaires fondé sur le comportement de roulement, utile pour enrichir des sous-populations dans des modèles précliniques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase de découverte précoce afin de guider le développement de tests et la création d'outils précliniques, en particulier pour les cibles chez lesquelles l'adhésion sous flux constitue un indicateur fonctionnel.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les interactions récepteur-ligand en écoulement cisaillant, clarifiant les contributions mécanistiques au roulement cellulaire.
- Criblage : Fournit des mesures normalisées et quantitatives de l'adhésion, permettant la comparaison de lignées cellulaires ou de modulateurs de récepteurs.
- Analytique : Produit des distributions de la longueur de suivi des bords et de la vitesse de roulement, offrant une base statistique pour la comparaison des conditions.
- Recherche translationnelle : Relie la dynamique de roulement in vitro à l'utilité potentielle dans des dispositifs de séparation cellulaire sans marquage, destinés au traitement d'échantillons précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour évaluer le comportement cellulaire médié par l'adhésion sur plusieurs cibles et types cellulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les mécanismes de séparation par adhésion en quantifiant les paramètres de trajectoire sous cisaillement contrôlé.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à une impression par microcontacts normalisée, un remplissage postérieur des récepteurs et un montage standardisé de la chambre d'écoulement.
- Valeur stratégique : Réduit les risques biologiques en phase avancée du développement de dispositifs en permettant une validation fonctionnelle précoce des motifs de récepteurs.
- Impact sur le portefeuille : Appuie les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant pour les technologies de séparation microfluidiques en fournissant des données empiriques sur la performance des motifs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en micro-impression par contact, en chimie de surface et en contrôle des écoulements en microfluidique.
- Suppose l'accès à une microscopie inversée en champ clair, à une caméra haute vitesse et à des outils de suivi de particules basés sur MATLAB.
- Nécessite une standardisation interéquipes de la fabrication des substrats et de la description des conditions d'écoulement afin d'assurer une reproductibilité multisite.
- L'adaptation à d'autres types cellulaires exige la validation des paires ligand-récepteur et l'optimisation des paramètres de contrainte de cisaillement.
- Est limitée par la nature transitoire des interactions au niveau des bords cellulaires, ce qui restreint la reconstruction complète des trajectoires et impose une analyse segmentée.
