Application de cartographie et de Enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte Drosophile SNC

L’objectif global de l’expérience suivante est d’affiner l’expression de GAL quatre en utilisant de la lipase spécifique des tissus avec des outils de conversion GAL 80. Ceci est réalisé en générant une collection de lignées de mouches transgéniques Philippe enhancer trap et en déterminant le modèle d’expression de la lipase dans le SNC dans chaque ligne. À l’aide d’un rapporteur GFP, l’immunochimie et les rapports GFP peuvent différencier le GL de l’expression neuronale pour croiser l’expression de GAL quatre dans les lignes d’intérêt, les lignes ET inverser les lignes à travers les mouches contenant un outil de conversion GAL 80 dans la descendance.

L’analyse clonale peut être utilisée pour analyser le raffinement de l’expression de GAL quatre, par exemple dans l’œil. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les lignes basées sur le jeu de piste d’amélioration ainsi que les outils de conversion GAL 80 peuvent être utilisés avec une collection rapide de l’alliance GAL quatre déjà disponible dans la communauté des mouches. De plus, ce concept peut être étendu à d’autres organismes modèles émergents de GALI quatre UAS, tels que le poisson zèbre.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la cartographie des circuits neuronaux sous-jacents au comportement. Bien que ce protocole démontre l’utilisation de la base inversée dans un sous-ensemble de cellules photoréceptrices, la méthode intersectionnelle peut être appliquée à l’analyse d’autres tissus, y compris les tissus non neuronaux. Au fur et à mesure que le piège améliorateur est caractérisé : les lignées de lipase sont caractérisées.

La goutte quatre US est une technique importante largement utilisée par les biologistes des mouches. Une mise en garde de la plupart des quatre lignes de GAL est qu’elle est exprimée trop largement pour être utilisée pour la cartographie du comportement cérébral à l’aide des méthodes du doigt. Il n’est pas possible d’affiner l’expression de GAL quatre dans les T-shirts d’intérêt Avant d’utiliser un transgène ET flip pour restreindre partiellement l’expression des lignes d’expression de GAL quatre.

Il est d’abord utile de connaître le modèle d’expression du transgène ET flip x deux dans la lave en développement avancé et chez les adultes pour visualiser l’expression de flip a Dans le SNC mettre en place un croisement entre les mâles avec le transgène ET t flip X deux d’intérêt et les femelles vierges hébergeant un rapporteur GFP pour l’expression et flip de la descendance. Recueillir les larves errantes du troisième stade F1 pour les disséquer. Placez-les dans un plat de protection en S propre et retirez tous les débris avec un pinceau et rincez le plat une fois avec du PBS.

Maintenant, remplissez le plat de glace une fois PBS pour anesthésier les larves pour accéder au SNC d’une lave, tenez son crochet buccal avec une paire de pinces. Saisissez la cuticule près de la sphère antérieure qui s’étend et retirez-la. Le SNC reste attaché au crochet buccal avec d’autres structures.

Maintenant, avec des pinces, retirez toutes ces structures en excès entourant le SNC pendant que vous disséquez le SNC. Transférez-les individuellement dans un plat en Pyrex rempli de PBS. Une fois que tous les SNC sont disséqués, fixez-les en les immergeant complètement dans 200 microlitres de 4 % de PFA sur de la glace.

Si un SNC flotte, il n’a pas été complètement nettoyé de tous les tissus environnants. Si cela se produit, utilisez une paire de pinces pour immerger à nouveau le SNC dans le fixateur après une fixation de 15 minutes, lavez le tissu avec du PB S3 glacé, puis lavez le tissu trois fois de plus avec du PBT glacé. Le tissu est maintenant prêt à être imagé ou marqué par des anticorps ou stocké dans du PBT à quatre degrés Celsius pour plus tard.

Coloration du même croisement que celui utilisé pour faire collecter les larves F1 adultes avant la dissection. Immergez cinq à 10 mouches et refroidissez à 95 % d’éthanol pendant 30 secondes pour enlever la cire à la surface de la cuticule. Pour éliminer l’éthanol, lavez les adultes trois fois avec du PBS glacé et après le troisième lavage, transférez l’un d’eux dans un plat de protection sil de 35 millimètres rempli de PBS glacé une fois pour préparer un adulte à la dissection.

Placez-le ventral vers le haut et insérez une goupille de minion à mi-chemin de l’abdomen. Commencez à disséquer à l’aide d’une pince pour retirer les pattes. Ensuite, retirez la cuticule de la tête en fixant la tête au niveau des accessoires et en décollant simultanément la cuticule du dessous de l’œil vers le haut de la tête.

À l’aide d’une pince affûtée, retirez, suivez vos tissus entourant le cerveau car vos tissus ont une forte autofluorescence et font flotter le cerveau pendant la fixation. Le cerveau n’est qu’une partie du SNC adulte. L’autre partie est le cordon nerveux ventral ou VNC dans le thorax et elle doit également être disséquée.

Tout d’abord, retirez la cuticule thoracique en fixant la mouche à la base de la patte arrière et en tirant doucement sur la cuticule thoracique jusqu’à la base du cou. Deuxièmement, pour exposer le VNC, étalez doucement les deux moitiés de la cuticule thoracique. Troisièmement, retirez l’abdomen du thorax en le fixant à la base de la deuxième patte et en retirant l’abdomen près de la première nuit de brassage abdominal.

Quatrièmement, nettoyez le VNC en le fixant dans la région humérale et en arrachant doucement le tissu entourant le VNC. Déchirez l’anneau de tissu conjonctif entourant le conjonctif cervical et continuez à retirer l’excès de tissu pendant que vous collectez le cerveau. Et VNC les transfère sous forme de poires dans un plat en Pyrex rempli de neuf fois réfrigéré que PBS a gardé sur de la glace.

Pour fixer les tissus adultes, plongez-les dans 4 % de PFA sur de la glace pendant 15 minutes. Suivez le bain avec trois lavages PBS glacés et trois rondelles PBT. Le tissu est maintenant prêt à être imagé ou marqué par des anticorps afin d’analyser l’expression des transgènes avec précision.

Il est utile de marquer le SNC avec des marqueurs neuronaux ou gliaux pour fournir un cadre de référence : commencer par incuber le tissu à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec des anticorps dirigés contre les neurones ou la glie le lendemain. Lavez la préparation cinq fois avec du PBT et incubez avec l’anticorps secondaire fluorescent à température ambiante pendant deux heures. Enveloppez la plaque et la feuille pour éviter le photoblanchiment de l’anticorps à la fin de l’incubation.

Lavez la préparation avec du PBS et montez la préparation entière sur une lame. Utilisez un anneau en plastique OSHA pour éviter que le tissu ne soit écrasé par la lamelle. Le système nerveux est maintenant prêt à être examiné au microscope fluorescent pour détecter les profils d’expression de la GFP et de la LL.

En général, trois à cinq répétitions sont examinées pour déterminer la reproductibilité du motif d’expression inversé. Le modèle d’expression de flip dans le flip, une ligne peut être utilisée avec d’autres transgènes pour changer la façon dont le répresseur GAL 80 est exprimé. La modification de l’expression du répresseur GAL 80 est une méthode efficace pour effectuer des modifications.

Dans l’expression de GAL quatre, une méthode consiste à inverser l’expression de GAL 80 avec le transgène L’expression de GAL 80 inactive GAL quatre, ce qui entraîne autrement une dégénérescence oculaire dans tout l’œil. Le hash ET flip line 6 88 A est utilisé ici pour évaluer l’efficacité de l’outil de conversion GAL 80 dans un sous-ensemble de photorécepteurs de la descendance F1, comparer le phénotype de l’œil au phénotype de l’œil des souches parentales. Toute apparition de déformation oculaire ou de dépigmentation confirme que le motif d’expression du flip est présent dans les photorécepteurs et que le flipout GAL 80 a réussi.

Une stratégie complémentaire non redondante consiste à inverser l’expression GAL 80 en utilisant la même ligne d’intérêt. Cette stratégie est très similaire à l’autre, mais maintenant la pigmentation et la dégénérescence de l’ID dans la descendance F1 sont supprimées. Dans le flip X deux.

Une fois maîtrisée, la dissection du SNC peut être effectuée en environ cinq minutes pour les adultes et une minute pour les larves si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser des pinces tranchantes pour enlever la trachée et le tissu entourant à la fois l’adulte et le Libre C et Ss.It est important d’utiliser une boîte sans fixateur pour la dissection. Le retournement de choc thermique est actuellement utilisé pour générer des clones aléatoires.

En revanche, l’inversion du piège enhancer permet de générer des clones reproductibles, ce qui facilite l’analyse morphologique et comportementale. Une autre force de la méthode du doigt est que l’on peut restreindre davantage les quatre modèles d’expression de GAL en utilisant des lignes supplémentaires basées sur le retournement de piège anan et d’autres lignes de gal. Une faiblesse de la configuration de la tubuline stop GAL 80 est que certaines combinaisons d’effecteurs GA quatre et UAS tels que LAG quatre et U-A-S-K-I-R ne sont pas compatibles car elles tuent les mouches.

Ce problème peut être facilement surmonté en utilisant un effecteur UAS conditionnel, tel que UAS Shiri Ts, qui permet d’examiner un comportement à des températures restrictives comme prévu. Toutes les lignées de lipase n’exprimeront pas des niveaux suffisamment élevés de lipase pour être utiles. Néanmoins, la technique du doigt décrite ici offre une nouvelle approche aux chercheurs sur la drosophile pour affiner l’analyse de la mosaïque, que ce soit pour les circuits de développement ou le comportement.