Name: Application de cartographie et de Enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte Drosophile SNC (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez la méthode FINGR pour affiner l'expression Gal4 dans le système nerveux central de Drosophila. Cette technique permet une cartographie précise des circuits neuronaux et une analyse clonale tissu-spécifique.

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Nous remercions un fonds interne de l&#39;Université de l&#39;Oklahoma (BZ) et une subvention de la NSF (IOS-1025556, BZ et RAB) pour soutenir la Fondation, RAB, XP, AAO, MLW, CAS, et cette recherche. Une subvention du NIH (RO1 NS060878, BZ) partiellement pris en charge RAB. RAB reconnaît une NRSA NIH (T32 NS07292) de formation subvention accordée à l&#39;Université Brandeis, et une subvention du NIH (RO1 GM21473) a décerné à Jeffrey Hall à Brandeis, pour soutenir les premières étapes de cette étude. Nous remercions Jeffrey Hall pour ses encouragements continus pour ce projet. Nous remercions le Dr Kristin Scott pour nous avoir fourni avec la baignoire P&gt; GAL80 contrainte&gt;.

1. Souches de drosophile <ol><li> Gal4 conducteur: GMR-Gal4, qui exprime Gal4 de cellules photoréceptrices. </li><li> Lignes SAMU SAMU-MJD78Q (ou UAS-polyQ), ce qui provoque la dégénérescence neuronale dans les cellules exprimant Gal4. UAS-GFP, qui exprime la GFP dans les cellules exprimant Gal4. </li><li> Lignes FLP ey-FLP, qui exprime FLP dans les photorécepteurs et en sous-ensembles de régions cérébrales. HE-FLPx2 lignes, qui sont enhancer-trap lignes contenant deux copies du FLP (FLP-IRES-FLP). Nous avons généré ~ 1000 HE-FLP lignes (Bohm et al., 2010), dont l'expression schémas ne sont pas encore caractérisés. Ici, nous décrivons la caractérisation du profil d'expression de sélectionner HE-FLPx2 chez la mouche système central larvaire et adulte nerveux central (SNC). </li><li> Reporter FLP yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997), qui relève du modèle d'expression de l'ET-FLPx2 travers actine P&gt; Gal4; UAS-GFP sur FLP-médiée excision par recombinaison des&gt; CD2. </li><li> Deux complémentaires GAL80-conversion des outils Baignoire P&gt; GAL80&gt; (Gordon &amp; Scott, 2009), la construction flip-out, qui exprime de manière constitutive GAL80 dans tous les tissus piloté par un promoteur de la tubuline forte. Sur FLP médiée recombinaison&gt; GAL80 est retournée sortir et GAL80 expression est terminée seulement en ET-FLPx2 exprimant tissus. Baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 (Bohm et al., 2010), le flip-de construire, qui n'exprime pas GAL80 dans des conditions normales. GAL80 expression est allumé par le promoteur de la tubuline seulement dans l'ET-FLPx2 exprimant des tissus dans lesquels FLP éjecté arrêter&gt; et des culbutes dans GAL80. </li><li> Mouches pour tester l'activité FLP dans les yeux composés GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 (Bohm et al, 2010.), Qui a dégénéré et les yeux dépigmentées. En exprimant FLP cellules photoréceptrices, l'expression polyQ est éteint suivantes GAL80 flip-in. GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) baignoire P&gt; GAL80&gt;, qui a les yeux normaux. En exprimant FLP cellules photoréceptrices, l'expression polyQ est allumé suivantes GAL80 flip-out. </li></ol> 2. Réactifs Tampon phosphate salin (PBS, 1X), pH 7,4. 4% de paraformaldéhyde (PFA), dilué dans du PBS de 16% PFA, EM grade (Cat # 15710, sciences de la microscopie électronique, Hatfield, PA) PBT, 1XPBS contenant 0,1% de Triton X-100 (Sigma) Anti-Elav (MAB, 9F8A9; études développementales hybridomes Banque, Université de l'Iowa), les taches de tous les neurones de la drosophile. Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies hybridomes Banque, Université de l'Iowa) taches cellules gliales chez la drosophile. Alexa 594 poulets contre les anticorps de souris secondaire (Invitrogen) 3. Cartographie du modèle d'expression des lignes FLPx2 enhancer-trap (* étapes critiques) <ol><li> Recueillir les femelles vierges de la yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP en ligne et croix pour les hommes de chaque HE-FLPx2 lignes. Le premier sert un journaliste GFP pour l'expression tissulaire de l'ET-FLP. </li><li> * Disséquer errance 3 ème stade F1 larves, conservent le SNC (par exemple, le cerveau et la moelle nerveuse ventrale, VNC) et la paroi du corps, fixer pendant 1 heure à 4% PFA sur la glace, laver 3x avec PBS glacé suivie par lave 3X avec PBT. Dissection <ol><li> Retirer errance 3 ème stade F1 larves et les placer dans un plat propre Sylgard (35 mm x 10 mm boîte de Petri remplie de 2 grammes de Sylgard - mélangés selon les instructions de fabrication). <ol><li> Enlevez les débris alimentaires avec le pinceau </li></ol></li><li> Remplir le plat avec glacée 1XPBS et le placer sur la glace pour anesthésier les larves </li><li> Tenir les crochets d'une larve de la bouche avec une paire de pinces et de saisir la cuticule à proximité de la spiracle étendre antérieure avec une autre paire de pinces et le zeste de la cuticule vers l'extrémité postérieure. Le CNS sera joint à la bouche des crochets avec les glandes salivaires, l'intestin, et les disques imaginaux. </li><li> Retirer l'excès de tissus et de disques imaginaux entourant le SNC. </li><li> Transférer la SNC en PBS-remplie 3 bien plat en pyrex. <ol><li> Un siliconé P200 pointe de la pipette peut être utilisé pour éviter le dessèchement des tissus. </li></ol></li><li> Fix pendant 1 heure dans 200 ul de 4% PFA sur la glace. <ol><li> Assurez-vous que le SNC est complètement immergé dans la PFA. <ol><li> Si le SNC flotteurs, ce qui suggère généralement que le SNC n'est pas correctement nettoyée par les tissus environnants. </li></ol></li></ol></li><li> Laver 3x avec PBS glacé suivie de lavages 3X avec PBT. </li></ol></li><li> * Disséquer le SNC de mouches F1 adulte. <ol><li> Anesthésier les mouches avec du CO 2 ou le lieu des mouches contenue dans un flacon vide sur la glace pendant 10 minutes. </li><li> Placez adulte vole dans un plat en verre rempli de EtOH à 95% sur la glace pendant 30 sec. </li><li> Transférer les mouches adultes dans un plat en verre remplis 1XPBS sur la glace. <ol><li> Lavez 3X avec glacée 1X PBS pour éliminer EtOH résiduelles </li></ol></li><li> Placez une mouche dans une Sylga 35mmvaisselle ème rempli glacée PBS 1X </li><li> Placez la face ventrale vers le haut et insérez un stylo petit insecte (broches minutiens 0,1 mm) à mi-chemin à travers l'abdomen. <ol><li> En utilisant une paire de pinces tenir la base des jambes et retirer les jambes avec une autre paire de pinces. </li></ol></li><li> Enlever la cuticule tête <ol><li> Tout en saisissant la trompe avec une paire de pinces, placer un autre sous l'oeil et le zeste de la cuticule vers la ligne médiane dorsale de la tête de la mouche. </li><li> Prenez l'autre œil et retirer la cuticule qui restent de l'autre côté. </li><li> En utilisant une pince forte et / ou d'une aiguille de tungstène aiguisé, enlever le tissu entourant le cerveau trachéale <ol><li> Un mauvais nettoyage de la trachée se traduira par une forte auto-fluorescence, obstruant expression de la GFP, et permettre au cerveau de flotter lors de la fixation </li></ol></li></ol></li><li> Dissection VNC <ol><li> Enlever la cuticule thoraciques <ol><li> À partir de l'extrémité postérieure du thorax, placer deux pinces de chaque côté de l'preepisternum 3 e (ie, en saisissant la base des pattes postérieures). </li><li> Séparez doucement les cuticules loin de la ligne médiane ventrale, répétez cela jusqu'à ce que vous atteigniez la base du cou. </li><li> Écartez doucement les deux moitiés de la cuticule thoraciques exposer la VNC </li></ol></li><li> Retirer ensuite l'abdomen du thorax. Tout en utilisant une paire de pinces pour tenir le thorax à la base la deuxième étape, utiliser une autre paire de pinces pour attraper l'abdomen près du premier sternite abdominal et tirez hors de l'abdomen. </li><li> Pour enlever la VNC du tissu environnant thoracique. Tenez la région humérale avec une paire de forceps et avec une autre paire de pinces à la déchirure douce loin la majorité de la carcasse thoracique. </li><li> A ce stade il doit y avoir un anneau de tissu conjonctif entourant le connectif cervical (cou). En utilisant deux pinces lacrymogènes en dehors de l'anneau. </li><li> Retirez tout excès de tissu entourant le thorax VNC </li></ol></li><li> Transfert du cerveau et VNC pour 9-même en pyrex plat contenant du PBS 1X sur la glace <ol><li> Un siliconé P200 pointe de la pipette peut être utilisé pour éviter le dessèchement des tissus </li></ol></li></ol></li><li> * Correction du SNC adulte pendant 1 heure à 4% PFA sur la glace et lave-glace 3X avec du PBS froid et 3X avec PBT. </li><li> Incuber la préparation pour adultes du SNC ou la CNS larvaire et paroi du corps à 4 ° C pendant la nuit avec des anticorps soit neurones (anti-Elav, 01h10) ou des cellules gliales (anti-Repo. 1:10). Laver la préparation 5X avec PBT. </li><li> Incuber à la préparation des adultes ou larves avec Alexa 594 poulets contre la souris anticorps secondaire (1:100) à température ambiante pendant 2 heures, et laver la préparation avec du PBS. </li><li> Montez le SNC larvaire ou adulte sur une diapositive. Afin de préserver la forme naturelle de la SNC, utiliser un anneau en plastique en forme de O (Label Renforcement Clair, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) sur la lame comme un pont mini-pour suspendre la lamelle. </li><li> Examinez la préparation de modèles d'expression de GFP et Elav (ou Repo) sous un microscope à fluorescence. </li></ol> 4. L'application de deux complémentaires GAL80-convertissant les outils de la répression dans les photorécepteurs Gal4 <ol><li> Retournement GAL80 par l'intermédiaire baignoire P&gt; GAL80&gt; (figure 5A). <ol><li> Recueillir les mâles de la GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; GAL80 ligne&gt;. Notez que les yeux composés sont normales dans ces mouches. </li><li> S'accoupler avec ey-FLP vierges. </li><li> Recueillir les mouches F1 et d'examiner le phénotype des yeux. </li></ol></li><li> Retournement GAL80 en via baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 (figure 5B). <ol><li> Recueillir GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 mouches mâles et examiner le phénotype des yeux. Remarque dégénérés et les yeux dépigmentées dans ces mouches par rapport aux souches de type sauvage (Canton-S) </li><li> S'accoupler avec ey-FLP vierges; </li><li> Recueillir les mouches F1 et d'examiner le phénotype des yeux. </li></ol></li><li> Sélectionnez HE-FLPx2 lignes avec une expression dans les cellules photoréceptrices </li></ol> Étapes 4.1 et 4.2 peuvent être répétées en utilisant ET-FLPx2 lignes qui expriment FLP dans un sous de cellules photoréceptrices. Alternativement, soit le GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 mouches ou GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; GAL80&gt; mouches peuvent être croisées pour chaque HE-FLPx2 lignes à l'écran des lignes qui expriment FLP dans les cellules photoréceptrices. Valuable HE-FLPx2 lignes sont celles qui ne FLP exprimer dans un sous-ensemble ou cellules photoréceptrices unique (figure 6). 5. Les résultats représentatifs Le profil d'expression d'un particulier HE-FLPx2 ligne peut être facilement examiné et documenté dans les larves F1 ou mouches adultes issus du croisement entre yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP vierges et HE-FLPx2 hommes (figure 1) . Typiquement, trois à cinq répétitions des animaux F1 sont disséqués et examinés pour déterminer la reproductibilité du modèle de l'expression du FLP (Bohm et al., 2010). (Figure 3 &amp; 4). Les résultats présentés dans la figure 7 illustrent l'efficacité de GAL80 flip-dans et flip-out des systèmes dans la répression intersectionnelle de Gal4 suivantes FLP médiée recombinaison. La baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 de construire ne semble pas avoir toute expression qui fuient des GAL80 (basé sur la dégénérescence uniforme et dépigmentation des photorécepteurs), et pourtant il est efficace à 100% dans le retournement GAL80 avec l'aide de eyFLP pour réprimer GMR- Gal4 et restaurer l'œil aux apparences normales (figure 7A). Au contraire, baignoire P&gt; GAL80&gt; entièrement réprime GMR-Gal4 avant l'introduction de eyFLP. Après GAL80 flip-out, GMR-Gal4 disques SAMU-polyQ d'expression, conduisant à dégénérer et les yeux dépigmentée (Fig. 7B). Dans cet exemple, nous avons utilisé une FLP pan-photorecetor au Plan «circuits» le photorécepteur, mais n'a pas examiné les conséquences comportementales. En utilisant des approches similaires avec behaviorally pertinentes Gal4 lignes, nous avons cartographié une partie du CCAP-Gal4 circuit de régulation d'expansion dans l'aile des mouches adultes (Bohm et al., 2010). Nous croyons que la méthode FINGR seront précieuses pour aider notre compréhension de la base neuronales du comportement. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. . Examiner le schéma d'expression d'une HE-FLPx2 ligne Le profil d'expression FLP (ovales bleu) à partir d'une ligne de HE-FLPx2 peut être déterminé en traversant une HE-FLPx2 mâle (en haut à gauche) avec une actine P&gt; CD2&gt; Gal4; SAMU- GFP vierge (en haut à droite). Ubiquitous actine P&gt; Gal4 expression dans la femelle parentale est entravée par l'insertion de la FRT (triangles gris) séquence CD2 flanqué. Dans la descendance F1, FLP accise de la séquence du CD2, permettant d'actine P&gt; Gal4 de conduire UAS-GFP expression. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Modèle de l'expression d'une ligne de HE-FLPx2 dans le système larvaire et adulte nerveux central. Ces images montrent le SNC (moelle nerveuses du cerveau et ventrale, VNC) disséqué de la progéniture produite à partir de l'accouplement yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP aux parents de l'ET-173A FLPx2 ligne. En recombinant les&gt; CD2&gt; cassette, FLP active actine P&gt; GAL4 expression (l'expression conséquente de UAS-GFP). Ainsi, le modèle GFP rapports FLP cellules exprimant. Le panneau A montre le schéma d'expression alors que les larves de FLP panneau B montre le profil d'expression des adultes en 173A ligne. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Caractérisation des types de cellules qui expriment flippase dans ET-FLPx2 Line # 688A. Un, Une image composite d'une larve fixée F1 3 ème stade teinté d'anti-REPO d'un croisement entre ET-FLPx2 ligne # 688A et une ligne GFP rapports flippase. BD, un fort grossissement (Zeiss Plan-Apochromat 63x huile) vue prise de l'extrémité postérieure d'un VNC à partir d'un 3 ème stade des larves. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Caractérisation des types de cellules dans le corps de champignons de l'ET-FLPx2 Ligne n ° 150. AC, Une image à fort grossissement (63x immersion dans l'huile) du corps de champignons à partir d'une larve fixée F1 au 3ème stade teinté d'anti-REPO. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Illustration de GAL80 Stratégies de prise de contrôle et Flip-out. A. Dans la stratégie de flip-out, la tubuline promoteur axée GAL80 (baignoire P&gt; GAL80&gt;) est constitutivement actif, résultant dans la répression de la GMR-Gal4 et un phénotype oculaire de type sauvage (yeux rouges). Cette répression est éliminé par l'introduction de FLP (violet), qui sera retourner GAL80 sortir (au milieu, rouge) et permettre GMR-Gal4 de conduire SAMU-polyQ expression. Il en résulte une dégénérescence des cellules photoréceptrices (illustré par des points blancs dans l'œil). B. Dans la réciproque de la stratégie précédente, la tubuline promoteur axée GAL80 expression est interrompu par FRT (triangles gris) flanqué "stop" codon. En l'absence de GAL80, GMR-Gal4 se lie à la SAMU-polyQ provoquant une dégénérescence neuronale dans les photorécepteurs (illustré par des points blancs dans l'œil). En franchissant les GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 mâles avec des femelles vierges qui expriment FLP dans les cellules photoréceptrices, FLP (violet) va catalyser la recombinaison à des sites FRT, excisant le "stop" codon (milieu, rouge), permettant ainsi GAL80 expression et répression de la GMR-Gal4. Cette réserve la neurodégénérescence dans les cellules photoréceptrices (illustrée par le manque de white points dans l'œil). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. L'application de la méthode de retournement FINGR GAL80 à l'aide de l'ET-FLPx2 Line # 688A descendance F1 d'un croisement entre ET-FLPx2 ligne # 688A vierge pour GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP&gt; GAL80 masculins. L'absence de pigment dans le milieu de l'oeil représente l'expression ommatidies FLP en ligne # 688A. Dans ce domaine GAL80 suppression de GMR-Gal4 été soulagé permettant Gal4 de conduire SAMU-polyQ. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Figure 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 7"> Figure 7. L'application de la méthode de retournement FINGR GAL80 dans ou hors de croiser Gal4 dans les photorécepteurs. A. La baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 flip-dans le système restreint GAL4 expression dans une manière FLP-dépendante. En GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 mouches, les cellules photoréceptrices sont dégénérées et dépigmentées (mouche à gauche). Après l'introduction de eyFLP, GAL80 est exprimée dans les cellules photoréceptrices, résultant en une répression complète de la GMR-Gal4, qui à son tour éteint la polyQ expression et produit des mouches aux yeux normaux (mouche de droite). B. La baignoire P&gt; GAL80&gt; Flip -out système fonctionne de la manière opposée comme la baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 flip-dans le système. Baignoire P&gt; GAL80&gt; constitutivement réprime GAL4 et supprime l'expression de polyQ (à gauche volée, avec des yeux normaux). Après l'introduction de eyFLP, GAL80 est retournée à partir de cellules photoréceptrices, soulageant la suppression de la GMR-Gal4 et en tournant sur la polyQ expression. Cela conduit à mouches avec dégénèrent et les yeux dépigmentées (mouche de droite).

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<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
</ol>

Le système Gal4/UAS a été largement et utilisé avec succès par Drosophilists pour diverses études biologiques (Marque &amp; Perrimon, 1993; Duffy, 2002). À ce jour, la communauté mouche a généré des milliers de promoteur à moteur et enhancer-trap Gal4 lignes. Une des grandes forces de la méthode FINGR est qu&#39;il est compatible avec le système Gal4/UAS, ce qui permet d&#39;élargir considérablement la puissance de Gal4 dans des études chez la drosophile. Une application importante de la méthode FINGR est de circuits neuronaux sous-jacents d&#39;affiner le comportement travers Gal4/Gal80 intersection. Ces comportements peuvent inclure, mais ne sont pas limités à, l&#39;apprentissage et la mémoire, la parade nuptiale, le sommeil et le rythme circadien. La méthode FINGR peut également être utilisé pour cartographier les neurones essentiels qui sont sujettes à la neurodégénérescence dans la modélisation des maladies neurodégénératives humaines comme la maladie d&#39;Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et les maladies de Parkinson. De même, des foyers de neurones ou circuits neuronaux cruciale pour la cocaïne médiation, l&#39;alcool et la toxicomanie d&#39;autres pourraient être cartographiés à l&#39;aide de la méthode FINGR. Il convient de noter que Gal4s conditionnelle (Osterwalder et al, 2001;.. Roman et al, 2001) pourrait être utilisé avec la méthode FINGR afin d&#39;obtenir le contrôle temporel des circuits neuronaux et les comportements. Modification de la GAL80-conversion d&#39;outils en utilisant un GAL80 sensibles à la température (TS GAL80, McGuire et al., 2003) peut produire baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 ts ou baignoire P&gt; GAL80 ts&gt;, ajoutant flexibilités supplémentaires temporelle dans la manipulation du circuit. Au-delà du système nerveux, la méthode FINGR est également applicable à restreindre Gal4 expression dans des sous-ensembles de cellules si c&#39;est l&#39;aile ou la jambe. Les lignes HE-FLPx2 sera une ressource précieuse pour tous les biologistes s&#39;intéressent à la drosophile FRT / FLP-analyse clonale (Xu &amp; Rubin, 1993), y compris MARCM (Lee &amp; Luo, 1999). Il est également prévu que certaines HE-FLPx2 lignes peuvent remplacer heatshock-FLP pour produire des clones reproductibles et répétés des analyses morphologiques et comportementales. Comme enhancer-trap Gal4 lignes, la plupart des HE-FLPx2 lignes sont peu susceptibles d&#39;être exprimé spécifiquement dans les cellules de son intérêt. La plupart des lignes vont exprimer FLP dans les cellules d&#39;intérêt et dans d&#39;autres cellules ou de tissus ainsi. Cependant, le manque de &quot;spécificité tissulaire» des deux Gal4 et ET-FLPx2 ne sera pas une préoccupation majeure pour la méthode FINGR aussi longtemps que leur zone de chevauchement est souhaitable pour une expérience particulière. FINGR est conçue pour transformer deux «grands» systèmes en un raffiné. Les méthodes illustrées dans ces protocoles sont plutôt standard et doit être reproductible. Les principales étapes mises en garde qui requièrent son attention sont la sélection et l&#39;utilisation du fixateur. Fixateurs autres que l&#39;IFP doit être évitée car ils vont étancher signal de la GFP. Nous avons également noté que le plat de dissection ne doit pas être utilisé pour la fixation au PFA afin d&#39;éviter la possibilité que l&#39;expression FLP ne sera pas fiable rapportés par la GFP.

application de cartographie et de enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte drosophile snc

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

La méthode binaire Gal4 / UAS est puissant pour le gène et la manipulation de circuits neuronaux chez la drosophile. Pour la plupart des études neurobiologiques, cependant, l&#39;expression de Gal4 est rarement tissu-spécifique suffisante pour permettre la corrélation précise du circuit avec affichage de comportement. Pour surmonter cet obstacle majeur, nous avons récemment développé la méthode FINGR pour parvenir à une plus restrictive Gal4 expression dans le tissu d&#39;intérêt. La méthode FINGR a trois composantes: 1) le système traditionnel Gal4/UAS; 2) un ensemble de FLP / FRT médiée GAL80 outils de conversion, et 3) enhancer-trap FLP (HE-FLP). Gal4 est utilisé pour définir les circuits primaires de neurones d&#39;intérêt. Parure du Gal4 avec un SAMU-effectrices, telles que SAMU-MJD78Q ou SAMU-Shi ts, régule l&#39;activité neuronale, qui est à son tour, se manifeste par des modifications dans le comportement voler. Avec un supplément de SAMU-rapporteur comme UAS-GFP, le circuit neuronal impliqué dans le comportement spécifique peut être simultanément mappé pour l&#39;analyse morphologique. Pour Gal4 lignes avec une expression large, Gal4 expression peut être restreinte en utilisant deux complémentaires GAL80-conversion outils: baignoire P&gt; GAL80&gt; (&#39;flip out ») et le bain à P&gt; arrêter&gt; GAL80 (« flip »). Enfin, les enquêteurs peuvent se tourner GAL80 allumé ou éteint, respectivement, avec l&#39;aide de tissu-spécifique HE-FLP. Dans le flip-en mode, GAL80 va réprimer l&#39;expression de Gal4 où Gal4 et HE-FLP se croisent. Dans le mode flip-out, GAL80 soulagera Gal4 la répression dans les cellules qui se chevauchent Gal4 et FLP. Les deux approches permettent la restriction du nombre de cellules dans le circuit de Gal4-défini, mais dans une tendance inverse. La méthode FINGR est compatible avec la vaste collection de Gal4 lignes dans la communauté voler et extrêmement polyvalent pour l&#39;analyse clonale traditionnelle et pour la cartographie du circuit neuronal. Dans ce protocole, nous démontrons la cartographie des profils d&#39;expression FLP dans certaines HE-FLPx2 lignes et l&#39;efficacité de la méthode dans les cellules photoréceptrices FINGR. Le principe de la méthode FINGR devraient également être applicables à d&#39;autres organismes modèles génétique dans lequel Gal4/UAS, GAL80 et FLP / FRT sont utilisés.

Nous décrivons une flippase induite intersectionnelle Gal80/Gal4 répression (FINGR) méthode, permettant tissu-spécifique FLP pour déterminer les profils d&#39;expression GAL80. Partout où Gal4 et le chevauchement FLP, Gal4 expression est activée (GAL80 flippé) ou désactiver (GAL80 basculé dans). La méthode FINGR est polyvalente pour l&#39;analyse clonale et la cartographie des circuits neuronaux.

Application de cartographie et de Enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte Drosophile SNC

La méthode binaire Gal4/UAS est puissante pour la manipulation des gènes et des circuits neuronaux chez la drosophile. Cependant, pour la plupart des études neurobiologiques, Gal4...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'affiner l'expression de GAL4 à l'aide d'une lipase spécifique aux tissus et d'outils de conversion GAL80. Ceci est réalisé en générant une collection de lignées transgéniques de drosophiles porteuses d'un piège à enhanceurs Philippe et en déterminant le profil d'expression de la lipase dans le système nerveux central (SNC) pour chaque lignée. À l'aide d'une immunochimie avec un rapporteur GFP et des rapports GFP, il est possible de distinguer l'expression gliale de l'expression neuronale afin de croiser l'expression de GAL4 dans des lignées d'intérêt, à savoir les lignées ET flip, chez les drosophiles contenant un outil de conversion GAL80 dans la descendance.L'analyse clonale peut être utilisée pour étudier l'affinement de l'expression de GAL quatre, par exemple dans l'œil. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que des lignées basées sur des promoteurs d'enhancer, associées à des outils de conversion GAL 80, peuvent être utilisées conjointement avec une large collection de lignées GAL quatre déjà disponibles au sein de la communauté des chercheurs sur la drosophile. De plus, ce concept peut être étendu à d'autres organismes modèles émergents utilisant le système GAL quatre UAS, comme le poisson-zèbre.Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans la cartographie des circuits neuronaux sous-tendant le comportement. Bien que ce protocole démontre l'utilisation de la base flip dans un sous-ensemble de cellules photoréceptrices, la méthode intersectionnelle peut être appliquée à l'analyse d'autres tissus, y compris les tissus non neuronaux. À mesure que davantage de lignées de pièges activateurs d'enhanceurs de lipase seront caractérisées.Le système Gal4 aux États-Unis est une technique importante largement utilisée par les biologistes travaillant sur la drosophile. Un inconvénient majeur de la plupart des lignées Gal4 est qu’elles s’expriment de manière trop étendue pour être utilisées dans la cartographie du comportement cérébral à l’aide des méthodes *fingering*. Il n’est pas possible d’ajuster finement l’expression de Gal4 dans les tissus d’intérêt avant d’utiliser un transgène ET-flip afin de restreindre partiellement l’expression des lignées Gal4.Il est d'abord utile de connaître le profil d'expression du transgène ET flip x deux au stade tardif du développement des larves et chez les adultes afin de visualiser l'expression de flip a dans le SNC. Mettez en place un croisement entre des mâles portant le transgène d'intérêt ET t flip X deux et des femelles vierges possédant un rapporteur GFP pour l'expression de et flip. Récoltez les larves F1 de troisième stade errant pour la dissection. Placez-les dans une boîte de Petri propre et éliminez tous les débris à l'aide d'un pinceau, puis rincez la boîte une fois avec du PBS 1x.Remplissez maintenant la boîte avec du PBS glacé une fois pour anesthésier les larves afin d'accéder au SNC. Saisissez le crochet buccal de la larve à l’aide d’une pince. Saisissez la cuticule près de la sphère antérieure étendue et retirez-la vers l’arrière. Le SNC reste attaché au crochet buccal, ainsi que quelques autres structures.Maintenant, à l’aide de pinces, retirez toutes les structures excédentaires entourant le SNC pendant que vous disséquez le système nerveux central. Transférez-les individuellement dans une boîte de Pétri Pyrex de trois pouces remplie de PBS. Une fois que tous les SNC ont été disséqués, fixez-les en les immergeant complètement dans 200 microlitres de PFA à 4 % sur de la glace. Si un SNC flotte, cela signifie qu'il n'a pas été entièrement débarrassé de tous les tissus environnants. Dans ce cas, utilisez une pince pour replonger le SNC dans le fixateur après 15 minutes de fixation, lavez le tissu 3 fois avec du PBS glacé, puis effectuez trois nouveaux lavages avec du PBT glacé. Le tissu est alors prêt à être observé en microscopie, marqué par des anticorps, ou stocké dans du PBT à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.Coloration à partir du même croisement utilisé pour collecter les larves afin de récolter les adultes F1 avant la dissection. Plonger cinq à dix mouches dans de l'éthanol à 95 % refroidi pendant 30 secondes pour éliminer la cire présente à la surface de la cuticule. Pour éliminer l'éthanol, laver les adultes trois fois avec du PBS à une fois refroidi sur glace, puis après le troisième lavage, transférer l'un d'eux dans une boîte de culture de 35 millimètres en silicagel remplie de PBS à une fois refroidi sur glace afin de préparer un adulte pour la dissection.Placez-le avec le côté ventral vers le haut et insérez une épingle minion au milieu de l'abdomen. Commencez la dissection en utilisant une pince pour retirer les pattes. Ensuite, retirez la cuticule de la tête en fixant celle-ci au niveau des propodèmes et en décollant simultanément la cuticule depuis la partie inférieure de l'œil vers le sommet de la tête.À l'aide de pinces aiguisées, retirez soigneusement et éliminez les tissus entourant le cerveau, car ces tissus présentent une forte autofluorescence et provoquent la flottaison du cerveau pendant la fixation. Le cerveau ne constitue qu'une partie du SNC adulte. L'autre partie est le cordon nerveux ventral ou VNC situé dans le thorax, qui doit également être disséqué.Commencez par retirer la cuticule thoracique en fixant la mouche à la base de la patte postérieure et en tirant délicatement la cuticule thoracique jusqu'à la base du cou. Ensuite, pour exposer le cordon nerveux ventral, écartez doucement les deux moitiés de la cuticule thoracique. Enfin, détachez l'abdomen du thorax en fixant la mouche à la base de la deuxième patte et en tirant l'abdomen depuis la région proche du premier sternite abdominal.Quatrièmement, nettoyez le CVM en le maintenant au niveau de la région humérale et en détachant délicatement les tissus entourant le CVM. Déchirez l'anneau de tissu conjonctif entourant la commissure cervicale et continuez à éliminer les tissus excédentaires tout en prélevant le cerveau. Transférez ensuite le cerveau et le CVM, en forme de poires, dans une boîte Pyrex de neuf puits contenant du PBS à 1 fois refroidi, maintenu sur de la glace.Pour fixer les tissus adultes, les immerger dans du PFA à 4 % sur de la glace pendant 15 minutes. Procéder ensuite à trois lavages au PBS glacé et à trois lavages au PBT. Les tissus sont alors prêts à être observés ou marqués par des anticorps afin d'analyser avec précision l'expression du transgène.Il est utile de marquer le SNC avec des marqueurs neuronaux ou gliaux afin de fournir un référentiel. Commencez par incuber le tissu à quatre degrés Celsius toute la nuit avec des anticorps dirigés contre les neurones ou les cellules gliales. Le jour suivant, lavez le prélèvement cinq fois avec du PBT et incubez-le avec l'anticorps secondaire fluorescent à température ambiante pendant deux heures. Enveloppez la plaque dans du papier d'aluminium pour éviter la photodégradation de l'anticorps une fois l'incubation terminée.Lavez le prélèvement avec du PBS et montez-le intégralement sur une lame. Utilisez un anneau en plastique OSHA pour éviter que le tissu ne soit écrasé par la lame de couverture. Le système nerveux est désormais prêt à être examiné pour les profils d'expression de la GFP et de LL au microscope fluorescent.Typiquement, trois à cinq réplicats sont analysés pour déterminer la reproductibilité du patron d'expression de flip. Le patron d'expression de flip dans la lignée flip peut être utilisé conjointement avec d'autres transgènes afin de modifier l'expression du répresseur GAL quatre GAL 80. La modification de l'expression du répresseur GAL 80 constitue une méthode efficace pour induire des changements.Dans l'expression GAL quatre, une méthode consiste à éliminer l'expression de GAL 80 grâce à un transgène ; l'expression de GAL 80 inactivant GAL quatre, qui sinon induirait une dégénérescence oculaire dans tout l'œil. La lignée ET flip portant le numéro 6 88 A est utilisée ici afin d'évaluer l'efficacité de l'outil de conversion GAL 80 dans un sous-ensemble de photorécepteurs chez les descendants F1, en comparant le phénotype oculaire à celui des souches parentales. L'apparition d'une quelconque déformation oculaire ou dépigmentation confirme que le patron d'expression du flip est présent dans les photorécepteurs et que l'élimination de GAL 80 a été réussie.Une stratégie complémentaire non redondante consiste à induire l'expression de GAL 80 à l'aide de la même ligne de recombinaison d'intérêt. Cette stratégie est très similaire à l'autre, mais maintenant la pigmentation et la dégénérescence sont supprimées chez la descendance F1. Dans flip X deux.Expression des photorécepteurs Une fois la dissection du SNC maîtrisée, elle peut être réalisée en environ cinq minutes chez les adultes et en une minute chez les larves, si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important d'utiliser des pinces fines pour enlever la trachée et les tissus environnants, tant chez les adultes que chez les larves C et Ss. Il est essentiel d'utiliser une boîte de dissection exempte de fixateur. Le choc thermique par inversion est actuellement utilisé pour générer aléatoirement des clones.En revanche, l'« enhancer trap flip » permet de générer des clones reproductibles, facilitant ainsi l'analyse morphologique et comportementale. Un autre avantage de la méthode du « finger » est qu'il est possible de restreindre davantage les patrons d'expression de GAL4 en utilisant des lignées supplémentaires basées sur l'« enhancer trap flip » et d'autres lignées gal. Un inconvénient de la configuration « tubulin stop GAL80 » est que certaines combinaisons de GAL4 et d'effecteurs UAS, telles que LAG4 et UAS-KIR, ne sont pas compatibles car elles entraînent la mort des mouches.Ce problème peut être facilement surmonté en utilisant un effecteur conditionnel UAS, tel que UAS Shiri Ts, qui permet d'examiner un comportement à des températures restrictives, comme prévu. Toutes les lignées de lipase issues d'un piège à enhanceurs n'exprimeront pas des niveaux de lipase suffisamment élevés pour être utiles. Néanmoins, la technique du doigt décrite ici offre une nouvelle approche aux chercheurs travaillant sur Drosophila pour affiner l'analyse des mosaïques, que ce soit pour les circuits du développement ou pour le comportement.

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Découvrez la méthode FINGR pour affiner l'expression Gal4 dans le système nerveux central de Drosophila. Cette technique permet une cartographie précise des circuits neuronaux et une analyse clonale tissu-spécifique.

Application de cartographie et de Enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte Drosophile SNC

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