Physiologiques, caractérisation morphologique et neurochimiques des neurones modulée par le Mouvement

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer la réponse physiologique de neurones individuels pendant le mouvement, puis de caractériser davantage la morphologie et la neurochimie de ces neurones. Cela est réalisé en anesthésiant d'abord l'animal et en le préparant chirurgicalement. L'étape suivante consiste à enregistrer électrophysiologiquement la réponse intracellulaire de neurones individuels pendant le mouvement.

Après avoir perfusé l'animal et traité le cerveau, la dernière étape consiste à visualiser et analyser la réponse physiologique et la morphologie neuronale. En définitive, les techniques d'enregistrement neuronal intracellulaire, d'immunochimie et d'analyse se combinent pour montrer les modulations du potentiel de membrane de neurones individuels pendant le mouvement. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la culture cellulaire est que les connexions neuronales et les entrées synaptiques sont préservées, et que les neurones ne sont ni exautotomisés ni placés dans un milieu artificiel. La veille de l'expérience, injecter un traceur neuronal, tel que la peroxydase de raifort, dans les régions cibles périphériques afin de marquer rétrogradement les motoneurones.

Le lendemain, anesthésiez le rat et placez-le sur un tapis chauffant, rasez la peau recouvrant le crâne postérieur à l’aide d’un tondeur pour animaux en utilisant une technique aseptique. Pratiquez une incision le long de la face interne de la cuisse, insérez une canule dans la veine fémorale pour une anesthésie supplémentaire. Insérez une autre canule dans l’artère fémorale afin de surveiller la pression artérielle.

Enfin, insérez une canule dans la trachée. Ensuite, placez le rat dans un cadre stéréotaxique. Effectuez une craniotomie pour exposer le cervelet, en prenant soin d'éviter le gros sinus veineux situé juste sous la jonction entre les os pariétaux et l'os interpariétal.

Ensuite, recouvrez la surface du cerveau avec de l'huile minérale chauffée. Collez maintenant la mandibule à une tige reliée à un vibreur électromagnétique. Le mouvement de la mandibule est contrôlé par des signaux de commande envoyés au vibreur depuis un générateur de signaux.

Placez ensuite une électrode de mise à la terre sous la peau adjacente à la craniotomie. Pour préparer les électrodes intracellulaires, tirez et remplissez des microélectrodes avec une solution colorante IDE ou au bromure de tétraéthylammonium. L'impédance de l'électrode est de 60 à 80 mégaohms pour les axones de grand diamètre et de 80 à 150 mégaohms pour les axones afférents petits et les interneurones.

Ensuite, placez l'électrode microscopique dans l'étage de tête de l'électromètre à l'aide d'une petite lunette fixée en position derrière la tête de l'animal. Visualisez l'électrode microscopique à travers l'oculaire rouge intégré 20 x de la lunette. La zone cible se situe à environ 0,5 millimètre du bord inférieur du colliculus inférieur.

Créez maintenant une petite ouverture dans la pie-mère afin de localiser précisément la surface du cerveau. Surcompensez le rétrocontrôle de la capacité de sorte que, lorsque l'électrode touche le cerveau, un signal de rétroaction soit produit. Avancez l'électrode jusqu'à ce qu'elle pénètre dans le cerveau.

L'étape suivante consiste à activer le déplacement répété de la mandibule. Ensuite, à l'aide d'un moteur pas à pas, avancer l'électrode dans le cerveau. Lorsqu'un contact neuronal est indiqué par une chute soudaine du potentiel continu et une activité synaptique en cours, arrêter l'avancement de l'électrode.

Lorsque la pénétration est jugée stable, initier des mouvements rampants et maintenus ainsi que des mouvements sinusoïdaux des mâchoires. Enregistrer la réponse neuronale et caractériser le neurone en fonction de sa réponse. Ensuite, pour cartographier le champ récepteur du neurone, utiliser une sonde émoussée afin d'explorer la peau autour de la tête et la cavité intra-orale.

Explorer la réponse du neurone à d'autres stimuli, tels que la contraction musculaire ou des stimuli nocifs. Lorsque les enregistrements sont terminés, injecter un à quatre nanoampères de courant continu pendant une durée totale d'injection de 15 à 70 nanoampères-minute. Surveiller la pénétration de l'électrode et interrompre l'injection de courant.

Si le potentiel membranaire devient plus positif que moins 30 millivolts, la prochaine étape consiste à découper le tissu cérébral. Après l'euthanasie et la perfusion de l'animal, retirez le cerveau. Ensuite, effectuez des coupes de 50 à 100 microns selon un plan frontal, sagittal ou horizontal.

Pour visualiser la relation entre le neurone sensoriel marqué et divers neurones moteurs, traitez le tissu à l'H-R-P-D-A-B ou au Texas red, selon le tissu ; des analyses supplémentaires peuvent être réalisées à l'aide d'un microscope fluorescent ou confocal ou d'un logiciel quantitatif de colocalisation. Si nécessaire, un traitement immuno-chimique peut être effectué pour la synaptophysine afin de localiser précisément les synapses au sein des neurones marqués. Cette figure montre un neurone du tronc cérébral qui a été injecté avec de l'IDE après une caractérisation électrophysiologique.

En fonction de la réponse neuronale pendant le mouvement, ce neurone peut être identifié comme un neurone afférent du fuseau musculaire secondaire. Le contour brun indique l'emplacement du noyau moteur du trijumeau. Cette figure montre la réponse physiologique d'un neurone sensoriel lors d'un déplacement de la mâchoire.

La réponse du neurone est représentée sous forme de fréquence de décharge instantanée. Notez que la réponse imite de près le déplacement mandibulaire, ce qui indique que ce neurone particulier fournit une rétroaction sensorielle liée à la position de la mandibule. Cette figure montre un neurone sensoriel qui a répondu lors de la palpation musculaire.

Le neurone a été coloré à l'ide après un traitement immuno-chimique. Les batonnets synaptiques apparaissant comme des gonflements rouges sont observés en co-localisation avec la synaptophysine jaune. Le vert est une coloration au colorant fluorescent.

Cette figure est une animation d'un axone d'un neurone afférent primaire du fuseau musculaire. Plusieurs coupes optiques du neurone marqué ont été utilisées pour générer l'animation. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la microscopie électronique, la microscopie confocale, ou le marquage neuronal antérograde ou rétrograde peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les caractéristiques ultrastructurales du neurone, la colocalisation des neurotransmetteurs avec les terminaisons synaptiques et la connectivité neuronale.