Physiologiques, caractérisation morphologique et neurochimiques des neurones modulée par le Mouvement

Une technique est décrite pour quantifier la réponse physiologique au in vivo des neurones de mammifères pendant le mouvement et de corréler la physiologie du neurone avec une morphologie neuronale, le phénotype neurochimique et microcircuits synaptique.

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer la réponse physiologique des neurones uniques pendant le mouvement et de caractériser davantage la morphologie et la neurochimie de ces neurones. Ceci est accompli en anesthésique et en préparant chirurgicalement l’animal. L’étape suivante consiste à enregistrer électrophysiologiquement la réponse intracellulaire des neurones individuels pendant le mouvement.

Après avoir pénétré l’animal et traité le cerveau, la dernière étape consiste à visualiser et à analyser la réponse physiologique et la morphologie neuronale. En fin de compte, les techniques d’enregistrement neuronal intracellulaire, d’immunochimie et d’analyse se combinent pour montrer les modulations du potentiel membranaire des neurones uniques pendant le mouvement. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la culture cellulaire, est que les connexions neuronales et les entrées synaptiques sont préservées, et que les neurones ne sont pas ex-autotomisés ni placés dans des milieux artificiels. La veille, l’expérience injecte un traceur neuronal, tel que le radis de cheval, la peroxydase dans les régions cibles périphériques pour rétrograder les motoneurones.

Le lendemain, anesthésez le rat et placez-le sur un coussin chauffant, rasez la peau, recouvrant le crâne postérieur avec une tondeuse à animaux en utilisant une technique aseptique. Faites une incision le long de l’intérieur de la cuisse, insérez une canule dans la veine fémorale pour une anesthésie supplémentaire. Insérez une autre canule dans l’artère fémorale pour surveiller la pression artérielle.

Enfin, insérez une canule dans la trachée. Ensuite, placez le rat dans un cadre stéréotaxique. Effectuez une craniotomie pour exposer le cervelet en faisant attention d’éviter le gros sinus veineux situé directement sous la jonction entre les os pariétals et interpariétaux.

Ensuite, couvrez la surface du cerveau avec de l’huile minérale réchauffée. Collez maintenant la mandibule à une tige couplée à un vibrateur électromagnétique. Le mouvement de la mandibule est contrôlé par des signaux de commande envoyés au vibrateur par un générateur de signaux.

Ensuite, placez une électrode de mise à la terre sous la peau adjacente à la craniotomie. Pour se préparer aux électrodes intracellulaires, tirez sur les micro-électrodes avec un test de solution de colorant IDE ou Domine à tige tétraéthyle. L’impédance de cette électrode est de 60 à 80 méga ohms pour les axones de grand diamètre et de 80 à 150 méga ohms pour les petits axones afférents et les interneurones.

Ensuite, placez la microélectrode dans la tête de l’électromètre à l’aide d’un petit télescope fixé derrière la tête de l’animal. Visualisez la micro-électrode à travers le redle 20 x fermé du télescope. La zone cible est d’environ 0,5 millimètre de dorlotage par rapport au bord inférieur du colliculus inférieur.

Faites maintenant une petite ouverture dans la pie-mère pour permettre une localisation précise de la surface du cerveau. Surcompenser la rétroaction capacitive de sorte que lorsque l’électrode touche le cerveau, un signal de rétroaction est produit. Avancez l’électrode jusqu’à ce qu’elle pénètre dans le cerveau.

L’étape suivante consiste à activer le déplacement répété de la mandibule. Ensuite, à l’aide d’un moteur pas à pas, faites avancer l’électrode dans le cerveau. Lorsqu’un empalement neuronal est indiqué par une chute soudaine du potentiel DC et une activité synaptique continue, arrêtez d’avancer l’électrode.

Lorsque la pénétration est jugée stable, amorcez la rampe et les mouvements de maintien et de mâchoire sinusoïdale. Enregistrer la réponse neuronale et caractériser le neurone en fonction de sa réponse. Ensuite, pour cartographier le champ récepteur du neurone, utilisez une sonde émoussée pour explorer la peau autour de la tête et de la cavité intrabuccale.

Explorer la réponse du neurone à d’autres stimuli tels que la contraction musculaire ou les stimuli nocifs. Lorsque les enregistrements sont terminés, injectez un à quatre nanoamplis, courant continu pour une injection totale de 15 à 70 nanoampères minutes. Surveillez la pénétration de l’électrode et arrêtez l’injection de courant.

Si le potentiel membranaire devient plus positif que moins 30 millivolts, l’étape suivante consiste à sectionner le tissu cérébral. Après avoir euthanasié et perfusé l’animal, retirez le cerveau. Ensuite, coupez des sections de 50 à 100 microns dans le plan frontal, sagittal ou horizontal.

Pour visualiser la relation entre le neurone sensoriel marqué et une variété de motoneurones, traitez le tissu pour H-R-P-D-A-B ou Texas red, selon le tissu, des analyses supplémentaires peuvent être effectuées avec un microscope fluorescent ou confocal ou à l’aide d’un logiciel de colocalisation quantitative. Comme vous le souhaitez, un traitement immunochimique peut être effectué pour la synaptophysine afin de localiser avec précision les synapses dans les neurones marqués. Cette figure montre un neurone du tronc cérébral qui a été injecté avec l’IDE après caractérisation électrophysiologique.

Sur la base de la réponse neuronale pendant le mouvement, ce neurone peut être identifié comme un neurone afférent du fuseau musculaire secondaire. Le contour brun indique l’emplacement du noyau moteur du trijumeau. Cette figure montre la réponse physiologique d’un neurone sensoriel lors du déplacement de la mâchoire.

La réponse du neurone est représentée par une fréquence de décharge instantanée. Notez que la réponse imite étroitement le déplacement mandibulaire, indiquant que ce neurone particulier fournit une rétroaction sensorielle liée à la position mandibulaire. Cette figure montre un neurone sensoriel qui a réagi pendant le sondage musculaire.

Le neurone a été coloré à l’ide suite à un traitement immunochimique. Les bâtons synaptiques apparaissant comme des gonflements rouges sont vus co-localisés avec la synaptophysine jaune. Le vert est une tache de missile fluorescent.

Cette figure est une animation d’un axone à partir d’un neurone afférent primaire du fuseau musculaire. Plusieurs sections optiques du neurone marqué ont été utilisées pour générer l’animation. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’électromicroscopie, la microscopie confocale et le marquage neuronal de grade antérieur ou rétrograde peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les caractéristiques ultra-structurelles de la colocalisation neuronale des neurotransmetteurs avec les bns synaptiques et la connectivité neuronale.