Chromatographie d'affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

Cette expérience est conçue pour identifier les protéines liant les lipides et analyser l'interaction entre les lipides et les protéines dans un environnement membranaire défini. Les protéines de la fraction membranaire d'un homogénat cellulaire sont incubées avec des vésicules lipidiques fraîchement préparées à partir de phosphatidylsérine et de céramide. Le mélange réactionnel est ensuite complété par des billes magnétiques conjuguées à la protéine X, afin d'ancrer les protéines associées aux vésicules lipidiques sur les billes magnétiques. Ensuite, les complexes protéines-vésicules lipidiques sont purifiés par tri cellulaire activé par champ magnétique.

Pour identifier la protéine liée au lipide mise en évidence par les résultats, utilisez un immunobuvardage SDS-PAGE afin de montrer la purification Lyx des formes endogènes et recombinantes de la PKC atypique ainsi que d'un domaine spécifique de liaison à la céramide exprimé dans des cellules MDCK. Le principal avantage de cette nouvelle technique par rapport aux méthodes existantes telles que le ELISA ou la spectroscopie de résonance plasmonique de surface pour l'étude des interactions de liaison, réside dans le fait que l'interaction lipide-protéine s'effectue dans un environnement similaire à une membrane, et que les protéines liantes peuvent être purifiées et analysées. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic des maladies impliquant des lipides, car dans ces pathologies, l'interaction physiologique lipide-protéine est altérée.

Pour certaines de ces maladies, les protéines cibles ne sont même pas connues et doivent être identifiées. Pour concevoir une thérapie à base de lipides, commencez par des SLV préparés à partir d'un mélange séché d'amounts équimolaires de phosphatidylsérine et de C16-céramide dans 100 microlitres de tampon sical. Soniquez pendant une heure après avoir ajouté 300 microlitres de tampon iCal, supplémenté avec 0,1 millimolaire de chlorure de manganèse, centrifugez les échantillons à 12 000 ×g pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius, puis resuspendez le culot de gros vésicules lipidiques dans 100 microlitres de tampon sical. Ajoutez un nanomolaire de colorant fluorescent vibrant cm DII et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure pour faciliter la visualisation de la fraction SLV après séparation maximale. Récupérez un culot rose de phosphate coloré au vibrant cm DAI, au céramide syrien, aux SLV par centrifugation et resuspendez dans 100 microlitres de tampon tris.

Ensuite, pour préparer un lysat cellulaire sans détergent, soniquer les cellules dans 300 microlitres de tampon hypertonique composé de 10 millimolar de tris, chlorure d'hydrogène contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase, puis centrifuger. Pour éliminer les débris membranaires, ajouter maintenant le lysat cellulaire clair à la suspension physique des lipides et incuber le mélange pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Étant donné que les lysats cellulaires peuvent contenir des membranes endogènes portant de la phosphatidyléthanolamine, il est recommandé d'éliminer ces membranes du lysat par des étapes supplémentaires de centrifugation.

Compléter le mélange réactionnel avec 20 microlitres d'un tampon de liaison XNV et 50 microlitres d'une solution contenant des billes magnétiques conjuguées à un XNV ; incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius, puis effectuer le tri cellulaire activé par champ magnétique selon les recommandations du protocole du fabricant. Ensuite, surveiller la fluorescence vive du CM DII dans les fractions de flux et d'élution à l'aide d'un lecteur de fluorescence pour microplaque afin de déterminer la présence et la quantité de lésions lipidiques dans un dosage par compétition d'anticorps. Pour vérifier la spécificité de la réaction de liaison de la PKC avec les vésicules de céramide phospho-sérine, incuber un microgramme d'anticorps polyclonal de lapin anti-PKC Zêta avec un lysat cellulaire pendant une heure à quatre degrés Celsius, suivi d'une incubation avec les vésicules lipidiques.

Continuer avec l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE et immunotransfert de la liaison protéique aux sérines phosphorylées du phosphate de céramide dans l'éluate maximal pour la reconstitution in vitro d'un complexe de polarité lipide-protéine. Commencer par la préparation d'un culot rose de vésicules de phosphate de sérine-céramide marquées au CM-DII coloré, comme indiqué précédemment. Résuspendre les vésicules dans 100 microlitres de tampon TRI, supplémenté avec 100 micromolaire de γS-GTP, 1 millimolaire de GDP et une combinaison de protéines recombinantes d'intérêt. Incuber ensuite la réaction à 4 degrés Celsius pendant trois heures. Ajouter ensuite 5 microlitres d'une solution mère 20 x d'un tampon X in V et 50 microlitres de billes magnétiques conjuguées à X in V.

Incuber le mélange sous agitation douce pendant encore 30 minutes à quatre degrés Celsius. Poursuivre le tri magnétique activé de cellules NX NV selon les recommandations du protocole du fabricant afin de faciliter la précipitation. Compléter la fraction d'élution avec 10 microgrammes d'albumine e pure.

Concentrez les protéines par précipitation au flue de Weyl. La phase inférieure est constituée de chloroforme-méthanol enrichi en cm dii vibrant. L'interphase brunâtre contient les billes magnétiques et les protéines précipitées.

Quantifiez les vésicules lipidiques ellu par détection du cm dii rose et vif dans la phase organique de chloroforme-méthanol de la réaction de weyl flu. Utilisez des quantités équivalentes de vésicules lipidiques pour normaliser les quantités de protéine entre les échantillons et analysez par électrophorèse SDS-PAGE. Immuno-buvardage.

Un lysat sans détergent de cellules MDCK exprimant la PKC Zetta en pleine longueur, liée à l'extrémité C-terminale à une protéine fluorescente verte ou à un domaine de liaison au céramide. L'extrémité C-terminale de la PKC Zetta a été incubée avec de la sérine phosphorylée.

Des vésicules de céramide après élution de la colonne max, les protéines ont été analysées par immunotransfert. Le fragment liant le céramide C 20 Zeta, l'EGFP et la PKC Zeta en pleine longueur ont été récupérés dans l'EIF de la colonne max, ce qui est conforme à la spécificité et à l'efficacité de la procédure lyx. Le témoin négatif EGFP, qui ne s'est pas fixé au phosphate, ainsi que nos vésicules de céramide syriennes, n'étaient pas détectables dans l'EIF.

Lorsque Linx est combiné à d'autres méthodes telles que l'électrophorèse SDS-PAGE, le transfert western ou l'analyse protéomique, des questions supplémentaires peuvent être abordées, comme par exemple quels sont les protéines présentes dans le complexe protéique liant les lipides. Depuis son développement, LabX a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la recherche sur les lipides uniques pour explorer l'apoptose induite par la céramide ainsi que la polarité cellulaire dans les cellules souches neuronales et les cellules épithéliales.