Name: Chromatographie daffinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Découvrez la chromatographie d'affinité lipidique médiée par tri cellulaire magnétique pour analyser les interactions protéines-lipides dans un environnement membranaire. Cette méthode permet d'identifier les protéines liant les lipides avec une pertinence physiologique améliorée.

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Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH et de R01NS046835 R01AG034389, et le Mars des dix sous de subventions 6FY08-322. Un merci tout spécial est consacré à Mme Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) qui a aidé énormément avec sa perspicacité dans la technologie MACS. Miltenyi a généreusement fourni le matériau utilisé pour la démonstration de l&#39;expérimentation à aucun coût. Je suis également reconnaissant au Dr Wang Guanghu (Medical College of Georgia / Géorgie Université des sciences de la santé, Augusta, Géorgie) qui a généré le PKCζ exprimant des lignées cellulaires. Soutien par l&#39;Institut de médecine moléculaire du Medical College of Georgia / Géorgie Health Sciences University (sous direction du Dr Lin Mei) est également reconnu.

1. Présentation La chromatographie d'affinité lipidique des vésicules à médiation à l'aide de tri magnétique de cellules activées (LIMACS) technique a été développée dans notre laboratoire afin d'isoler les complexes protéiques associés aux céramides 1-3. A l'origine, les vésicules lipidiques ont été faites de céramide et de la phosphatidylsérine, qui a permis de MACS en utilisant des particules magnétiques conjuguées à l'annexine V (très affine à la phosphatidylsérine) pour isoler les vésicules et de leurs protéines associées. Nous avons utilisé la technique LIMACS pour la reconstitution in vitro d'un complexe de polarité céramide-associés et l'isolement de céramide des protéines de liaison à partir de lysats cellulaires 3. LIMACS peut être modifiée à l'aide d'autres partenaires d'interaction pour l'isolement des vésicules (par exemple, glycolipide-specifc lectines ou des anticorps de lipides). 2. Procédures expérimentales Préparation des vésicules lipidiques et Tests aPKCBinding <ol><li> Les vésicules lipidiques sont obtenus à partir de mélanges secs de quantités équimolaires de phosphatidylsérine (105 mg) et C16-céramide (85 mg) en suivant les procédures modifiées pour la préparation des liposomes grande 1,4-7. </li><li> Les mélanges de lipides sont ensuite resuspendues et soniquées pendant 1 h dans 100 ul de tampon de la vésicule constituée de 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) et NaCl 150 mM. </li><li> Après l'ajout de 300 ul de tampon de la vésicule supplémenté avec 0,1 mM de MnCl2, les échantillons sont centrifugés à 12000 g μ pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Le culot (vésicules lipidiques de grande taille) est resuspendu dans 100 ul de tampon de la vésicule et incubées avec 1 nmol de Vybrant CM-dii pendant 1 h à 37 ° C pour visualiser la fraction vésiculaire après la séparation MACS. Vybrant CM-Dii est un colorant rouge fluorescent spécifique intégrant dans les membranes lipidiques. </li><li> Un détergent sans lysat cellulaire est préparée par sonication / homogénéisation des cellules dans 300 ul de tampon hypotonique (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) avec la protéase et les inhibiteurs de phosphatase) suivie par l'enlèvement des débris membranaires par centrifugation. Une étape de centrifugation à 100000 g pendant 1 h doit être ajoutée pour éviter toute contamination du lysat cellulaire avec des membranes contenant endogènes phosphatidylsérine. </li><li> Le lysat clarifié est ajouté à la suspension de vésicules lipidiques, et le mélange est incubé pendant 2 h à 4 ° C. </li><li> Le mélange réactionnel est complété avec 20 pi de 20x annexine V tampon de liaison et 50 ul d'une solution contenant des billes magnétiques conjuguées à l'annexine V suivie d'une incubation pendant 1 h à 4 ° C. </li><li> MACS est effectuée selon les instructions du fabricant (Miltenyi Biotec, Inc) du protocole. La présence et la quantité de vésicules lipidiques est déterminée par la surveillance de la Vybrant CM-dii fluorescence dans les fractions accréditives et d'élution en utilisant un lecteur de microplaques à fluorescence. </li><li> La corrélation linéaire entre la quantité de lipides vésiculaires et l'intensité de fluorescence des vésicules liés Vybrant CM-Dii est vérifiée par quantitative haute performance chromatographie sur couche mince (HPTLC) du mélange lipidique appliquée à l'annexine V-Macs. </li><li> La spécificité de la réaction de liaison des protéines aPKC ou autres pour les vésicules de céramides / phosphatidylsérine est vérifiée par un test de compétition des anticorps en utilisant 1 ug d'anti-PKCζ anticorps polyclonal de lapin à incuber le lysat cellulaire pendant 1 h à 4 ° C avant l'incubation avec les vésicules lipidiques. </li><li> La protéine de liaison à la céramide / phosphatidylsérine vésicules dans l'éluat MACS est analysé par SDS-PAGE et immunoblotting. </li></ol> Dans le complexe in vitro de polarité entre protéines et lipides <ol><li> La reconstitution in vitro d'un complexe de polarité entre protéines et lipides est réalisée suivant la procédure LIMACS comme décrit dans la section précédente. En bref, la phosphatidylsérine (420 ug) et C16-céramide (107 mg) est séché par un solvant organique. </li><li> Les lipides séchés sont remises en suspension sous sonication dans 500 ul de tampon de la vésicule (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl). </li><li> Cinq ul de 10 mM MnCl2, 1 pl de Vybrant CM-dii, et 500 ng d'PKCζ (humaine recombinante) est ajouté et le mélange réactionnel incubés agitation undergentle pendant 60 min à 4 ° C. </li><li> Vybrant CM-dii teinté phosphatidylsérine / céramide vésicules sont récupérées par centrifugation à 12000 xg pendant 60 min à 4 ° C. </li><li> Le culot (rose) est resuspendu dans 100 ul de tampon Tris et complété avec γS-GTP (100 uM), le PIB (1 mM), TPS-Par6 (100 ng), ou GST-Cdc42 (500 ng) et encore incubées pendant 3 h à 4 ° C (toute autre combinaison de protéines recombinantes d'intérêt peuvent être utilisés ici). </li><li> Annexine V-tampon (5 pi d'une solution 20x stock) et l'annexine V conjuguée à des billes magnétiques (50 pi) sont ajoutés et le mélange réactionnel incubées sous agitation douce pendant encore 30 min à 4 ° C. </li><li> Annexine V-MACS est effectué suivant le protocole du fournisseur comme décrit précédemment. </li> La fraction d'élution (1 ml) est complétée par 10 ug d'ovalbumine pure que l'aide de précipitation. La protéine est concentrée par Wessel-Flügge précipitations et analysées par SDS-PAGE/immunoblotting comme décrit précédemment 8. <li> Le montant de vésicules lipidiques élue est quantifiée par la détection de Vybrant CM-DII (rose) dans le bio (chloroforme / méthanol) la phase de la réaction de précipitation Flügge Wessel. La quantité de protéines analysées est normalisée sur des quantités égales de vésicules lipidiques. </li></ol> 3. Résultats D'épuration des LIMACS PKCζ-EGFP et le domaine céramide contraignante C20ζ-EGFP Un lysat sans détergent de cellules MDCK exprimant toute sa longueur PKCζ C-terminale liée à la protéine fluorescente verte (FLζ-EGFP) ou un domaine de liaison dans la céramide C-terminale de PKCζ (C20ζ-EGFP) a été incubée avec la phosphatidylsérine / vésicules céramide tant décrites dans des procédures expérimentales. Après élution de la colonne MACS, les protéines ont été analysées en utilisant des anticorps contre immunoblotting et PKCζ et EGFP pour la détection de la protéine éluée 2. <img src="/files/ftp_upload/2657/2657fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> LIMACS Figure 1. EGFP marquée des PKCζ et son fragment C-terminal C20ζ utilisant phosphatidylsérine / céramide vésicules. Sans détergent lysats de cellules MDCK exprimant l'EGFP (comme un contrôle non contraignant), pleine longueur PKCζ-EGFP, ou la liaison céramide, fragment C-terminal C20ζ-EGFP ont été incubées avec la phosphatidylsérine / vésicules céramide tel que décrit dans la section expérimentale procédures . Après avoir utilisé LIMACS, la protéine a été élue avec un tampon d'échantillon SDS et analysées par SDS-PAGE et immunoblotting. Le panneau de gauche montre que EGFP ne pas se lier à des vésicules conservé avec le annexine V-liée billes magnétiques. Le panneau du milieu et de droite montre que la longueur totale PKCζ-EGFP et C20ζ-EGFP ont été retenus en raison de liant à céramide.

<ol><li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li>
<li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li>
<li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li>
<li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+C%2816%29-ceramide+between+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li>
<li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+%28and+sociology%29+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Symp%22%5BJournal%5D)">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li>
<li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li>
<li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li>
</ol>

Pour tester l&#39;interaction spécifique entre un lipide et sa protéine de liaison est entravée par l&#39;incorporation de lipides dans la membrane cellulaire. La membrane cellulaire est constitué d&#39;un mélange de plusieurs types de lipides et de protéines et il est organisé en microdomaines lipidiques ou radeaux. Par conséquent, la co-purification des microdomaines et les protéines ne peuvent pas distinguer clairement si une protéine se lie directement à un lipide ou est seulement enrichi dans une structure en micro...

Annexine V conjuguée à des billes magnétiques et MACS micro et minicolonnes ont été fournis par Miltenyi Biotec, Inc (Auburn, Californie). Tous les lipides étaient de plus grande pureté et obtenu de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).

chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (limacs): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

L&#39;analyse des interactions protéine lipidique est difficile parce que les lipides sont incorporés dans les membranes cellulaires et donc inaccessible à la plupart des procédures de purification. Comme alternative, les lipides peuvent être enduits sur des surfaces planes que celles utilisées pour des lipides ELISA et spectroscopie de résonance plasmonique. Cependant, les lipides revêtement de surface ne forment pas des structures microdomaines, qui peut être important pour les propriétés des lipides contraignant. De plus, ces méthodes ne permettent pas pour la purification de grandes quantités de protéines se liant à leurs lipides cible. Pour surmonter ces limitations des tests d&#39;interaction protéine de lipides et de lipides pour purifier des protéines de liaison, nous avons développé une nouvelle méthode appelée chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules à médiation à l&#39;aide de tri magnétique de cellules activées (LIMACS). Dans cette méthode, des vésicules lipidiques sont préparées avec les cibles lipidiques et la phosphatidylsérine comme lipide d&#39;ancrage de l&#39;annexine V MACS. Phosphatidylsérine est un phospholipide membranaire cellulaire ubiquitaire qui montre une forte affinité pour l&#39;annexine V. protéines utilisant des billes magnétiques conjuguées à l&#39;annexine V les vésicules lipidiques contenant phosphatidylsérine va se lier à des billes magnétiques. Lorsque les vésicules lipidiques sont incubés avec un lysat cellulaire de la protéine de liaison à l&#39;lipidiques cibles seront également lié aux billes et peuvent être co-purifiée en utilisant MACS. Cette méthode peut également être utilisé pour tester si les protéines recombinantes reconstituer un complexe protéine de liaison à l&#39;lipidiques cibles. Nous avons utilisé cette méthode pour montrer l&#39;interaction de la PKC atypiques (aPKC) avec le céramide sphingolipides et co-purifient réponse apoptose de la prostate 4 (PAR-4), une protéine de liaison à la céramide-aPKC associés. Nous avons aussi utilisé cette méthode pour la reconstitution d&#39;un complexe céramide-associé de la aPKC recombinant avec la cellule de polarité des protéines liées Par6 et Cdc42. Depuis des vésicules lipidiques peuvent être préparés avec une variété de sphingo ou phospholipides, LIMACS propose un test polyvalent pour interactions lipide-protéine dans un environnement lipidique qui ressemble étroitement à celle de la membrane cellulaire. D&#39;autres complexes protéiques des lipides peuvent être identifiés en utilisant une analyse protéomique de protéines liaison aux lipides co-purifiée avec les vésicules lipidiques.

Pour tester l&#39;interaction d&#39;une protéine avec ses cibles lipidiques nous avons utilisé MACS et l&#39;annexine V conjuguée à des billes magnétiques et les vésicules lipidiques synthétisées à partir des lipides cible et l&#39;annexine V-contraignante phosphatidylsérine. Protéines liées à l&#39;lipidiques cibles sont co-purifiés et analysés après élution à partir des perles.

Chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

L'analyse de l'interaction entre lipides et protéines est difficile car les lipides sont intégrés aux membranes cellulaires et sont, par conséquent, inaccessibles à la plupart des méthodes de purification...

Cette expérience est conçue pour identifier les protéines liant les lipides et analyser l'interaction entre les lipides et les protéines dans un environnement membranaire défini. Les protéines de la fraction membranaire d'un homogénat cellulaire sont incubées avec des vésicules lipidiques fraîchement préparées à partir de phosphatidylsérine et de céramide. Le mélange réactionnel est ensuite complété par des billes magnétiques conjuguées à la protéine X, afin d'ancrer les protéines associées aux vésicules lipidiques sur les billes magnétiques. Ensuite, les complexes protéine-vésicules lipidiques sont purifiés par tri cellulaire activé par champ magnétique.Pour identifier la protéine liée au lipide mise en évidence par les résultats, utilisez un immunoblot de type SDS-PAGE afin de montrer la purification Lyx des formes endogènes et recombinantes de la PKC atypique et d'un domaine spécifique de liaison à la céramide exprimé dans des cellules MDCK. Le principal avantage de cette nouvelle technique par rapport aux méthodes existantes telles que le ELISA ou la spectroscopie de résonance plasmonique de surface pour l'étude des interactions par liaison, réside dans le fait que l'interaction lipide-protéine s'effectue dans un environnement similaire à une membrane, et que les protéines liantes peuvent être purifiées et analysées. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic des maladies impliquant des lipides, car dans ces pathologies, l'interaction physiologique lipide-protéine est altérée.Pour certaines de ces maladies, les protéines cibles ne sont même pas connues et doivent être identifiées. Pour concevoir une thérapie à base de lipides, commencez par des SLV préparés à partir d'un mélange séché d'amounts équimolaires de phosphatidylsérine et de C16-céramide dans 100 microlitres de tampon sical. Soniquez pendant une heure après avoir ajouté 300 microlitres de tampon iCal, supplémenté avec 0,1 millimolaire de chlorure de manganèse, centrifugez les échantillons à 12 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, puis resuspendez le culot de gros vésicules lipidiques dans 100 microlitres de tampon sical. Ajoutez un nanomolaire de colorant fluorescent vibrant cm DII et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure pour faciliter la visualisation de la fraction SLV après séparation maximale. Récupérez un culot rose de phosphate coloré au vibrant cm DII, des SLV de syrian-céramide par centrifugation et resuspendez-les dans 100 microlitres de tampon tris.Ensuite, pour préparer un lysat cellulaire sans détergent, soniquer les cellules dans 300 microlitres de tampon hypertonique composé de 10 millimolar de tris, chlorure d'hydrogène contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase, puis centrifuger. Pour éliminer les débris membranaires, ajouter maintenant le lysat cellulaire clair à la suspension physique des lipides et incuber une durée de deux heures à quatre degrés Celsius. Étant donné que les lysats cellulaires peuvent contenir des membranes endogènes portant de la phosphatidyléthanolamine, il est recommandé de débarrasser le lysat de ces membranes par des étapes supplémentaires de centrifugation.Compléter le mélange réactionnel avec 20 microlitres d'un tampon de liaison XNV et 50 microlitres d'une solution contenant des billes magnétiques conjuguées à un XNV ; incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius, puis effectuer le tri cellulaire activé par champ magnétique selon les recommandations du protocole du fabricant. Ensuite, surveiller la fluorescence vive du CM DII dans les fractions de flux et d'élution à l'aide d'un lecteur de fluorescence pour microplaque afin de déterminer la présence et la quantité de lésions lipidiques dans un dosage par compétition d'anticorps. Pour vérifier la spécificité de la réaction de liaison de la PKC avec les vésicules de céramide phospho-sérine, incuber un microgramme d'anticorps polyclonal de lapin anti-PKC Zêta avec un lysat cellulaire pendant une heure à quatre degrés Celsius, suivi d'une incubation avec les vésicules lipidiques.Continuer avec l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE et immunotransfert de la liaison protéique au phosphate de sérine céramide dans l'éluate maximal pour la reconstitution in vitro d'un complexe de polarité lipide-protéine. Commencer par la préparation d'un culot rose de vésicules de phosphate de sérine céramide marquées avec le colorant vibrant cm DII, comme indiqué précédemment. Resuspendre les vésicules dans 100 microlitres de tampon tri, supplémenté avec 100 micromolaire de gamma S GT P, 1 millimolaire de GDP, et une combinaison de protéines recombinantes d'intérêt. Incuber ensuite la réaction à 4 degrés Celsius pendant trois heures. Ajouter ensuite 5 microlitres d'une solution mère 20 x d'un tampon X in V et 50 microlitres de billes magnétiques conjuguées à X in V.Incuber le mélange sous agitation douce pendant encore 30 minutes à quatre degrés Celsius. Poursuivre le tri magnétique activé des cellules NX NV conformément au protocole du fabricant afin de faciliter la précipitation. Compléter la fraction d'élution avec 10 microgrammes d'albumine e pure.Concentrez les protéines par précipitation au flue de Weyl. La phase inférieure est constituée de chloroforme-méthanol enrichi en cm dii vibrant. L'interphase brunâtre contient les billes magnétiques et les protéines précipitées.Quantifiez les vésicules lipidiques ellu par détection du cm dii rose et vif dans la phase organique de chloroforme-méthanol de la réaction weyl flu. Utilisez des quantités égales de vésicules lipidiques pour normaliser les quantités de protéine entre les échantillons et analysez par électrophorèse SDS-PAGE. Immuno-blotting.Un lysat sans détergent de cellules MDCK exprimant la PKC zêta pleine longueur liée à l'extrémité C-terminale à une protéine fluorescente verte ou à un domaine de liaison aux céramides. L'extrémité C-terminale de la PKC zêta a été incubée avec de la sérine phosphorylée.Après l'élution de la colonne Max, les protéines ont été analysées par immunobuvardage. Le fragment liant la céramide C20 Zeta, l'EGFP et la PKC Zeta en longueur entière ont été récupérés dans l'éluat de la colonne Max, ce qui est conforme à la spécificité et à l'efficacité de la procédure lyx. Le témoin négatif EGFP, qui ne s'est pas fixé sur les vésicules de céramide syrienne au phosphate, n'était pas détectable dans l'éluat.Lorsque Linx est combiné à d'autres méthodes telles que l'électrophorèse SDS-PAGE, le transfert western ou l'analyse protéomique, des questions supplémentaires peuvent être abordées, comme par exemple quels sont les protéines présentes dans le complexe de protéines liant les lipides. Depuis son développement, LabX a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la recherche sur les lipides uniques pour explorer l'apoptose induite par la céramide ainsi que la polarité cellulaire dans les cellules souches neuronales et les cellules épithéliales.

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Chromatographie d'affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

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