Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

L’objectif global de cette procédure est de visualiser des granulocytes neutrophiles vivants et des réseaux d’ADN extracellulaire dans un poumon récemment infecté par un agent pathogène fongique. Tout d’abord, les souris qui sont positives pour l’EGFP dans leur population de neutrophiles sont infectées par du candia qui est également marqué par fluorescence. Ensuite, l’infection se développe pendant sept heures, après quoi l’animal infecté est sacrifié.

Ensuite, les poumons de l’animal infecté sont remplis d’agros à faible fusion pour faciliter le sectionnement par beome. Enfin, une tranche épaisse du tissu pulmonaire infecté est acquise via le viome et les neutrophiles pulmonaires. Les réseaux d’ADN et les éléments fongiques sont imagés.

En fin de compte, des images fixes haute résolution ou des séquences vidéo de granulocytes dans des tissus pulmonaires vivants peuvent être obtenues grâce à la microscopie multicolore à deux photons. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux technologies existantes est que les cellules immunitaires responsables de l’élimination de l’infection peuvent être observées directement dans l’environnement naturel. Cela peut être fait pendant le processus de formation du filet et de destruction fongique, et permet ainsi une analyse beaucoup moins artificielle de la physiologie des neutrophiles.

J’ai inventé cette technique lorsque Mathias m’a agacé avec ses questions brûlantes concernant la pertinence in vivo de mes résultats in vitro antérieurs, et je présenterai cette technique dans les prochaines minutes pour générer des kedia gonflés du moule environnemental. Aspergilus fumigatus. Ajoutez cinq millilitres de milieu à une plaque de culture cellulaire à six puits, puis transférez deux fois 10 à la septième, en laissant reposer CEDIA sur la plaque, et incubez les spores pendant sept heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone dans une installation BSL deux.

Après la période de gonflement, marquer les spores par fluorescence en ajoutant 10 microlitres de solution de tige blanche calcior dans chaque puits après un mélange doux. Incuber la plaque pendant 15 minutes supplémentaires dans les mêmes conditions pour récolter les spores marquées par fluorescence, placez une crépine à cellules de 70 micromètres sur un tube conique de 50 millilitres. Prélevez les spores de la plaque à l’aide d’une pipette, puis faites passer la solution de milieu à travers le simulateur de cellules dans le tube.

Ensuite, faites tourner les cellules à 900 G pendant cinq minutes à température ambiante et jetez le support. Ensuite, lavez les spores avec 10 millilitres de PBS dans les mêmes conditions de centrifugation. Remettre en suspension la pastille de spores dans deux millilitres de PBS et déterminer le nombre total de canadia gonflée par contre-spin cellulaire sur la suspension de spores à nouveau dans les mêmes conditions de centrifugation qu’avant et après, retirer soigneusement le résus surnageant.

Suspendez le kedia sédimenté à une concentration finale d’un fois 10 aux sept cellules pour 100 microlitres de PBS pour préparer la souris à l’infection avec la solution de spores, l’animal est anesthésié et la sédation est confirmée par l’absence de réponse au pincement des orteils. Dans cette vidéo, des souris lys EGFP, qui portent EGFP sous le promoteur du lysozyme et ont donc des neutrophiles positifs à l’eeg FP, sont utilisées cinq minutes après l’administration de l’anesthésie et la confirmation de la sédation à l’aide d’une bande élastique pour suspendre une souris narcotique sur un biseau par ses dents sous une lampe à col de cygne. À l’aide d’une pince, tirez la langue d’un côté et insérez un cathéter veineux à demeure de calibre 22 dans la trachée de l’animal.

Après l’insertion réussie de ce tube, utilisez une micro-pipette de 100 microlitres pour administrer 100 microlitres de suspension de spores. Ensuite, pour améliorer la répartition des particules fongiques dans tout le poumon, ventilez mécaniquement l’animal infecté pendant deux minutes avec un petit respirateur pour animaux à une fréquence respiratoire de 250 respirations par minute et à un volume d’inhalation de 300 microlitres par respiration. Enfin, retirez le cathéter et remettez la souris dans sa cage pendant sept heures pendant que l’infection progresse.

Observez la récupération de l’animal toutes les cinq minutes jusqu’à ce qu’il soit à nouveau ambulatoire, juste avant la fin de la période d’infection. Faites fondre 20 millilitres d’agros à bas point de fusion au micro-ondes et maintenez-le au chaud afin que l’agros ne se solidifie pas avant d’être injecté. Réfrigérez également une bouteille de PBS à quatre degrés Celsius dans le réfrigérateur à ce moment-là.

À la toute fin de la période d’infection, l’animal est euthanasié. Utilisez des aiguilles pour fixer la souris à un tapis de préparation en silicone et ouvrez soigneusement la poitrine à l’aide d’une paire de ciseaux et de pinces pour exposer les poumons et les voies respiratoires supérieures. En commençant par l’épiglotte exposée, insérez un autre cathéter veineux à demeure de calibre 22 dans la trachée.

À l’aide d’une aiguille à coudre, un fil à coudre standard est superposé autour de la trachée en préparation de l’étape de remplissage agricole ultérieure du poumon. Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre avec les aros préchauffés et administrez la solution à travers le cathéter pour en remplir les poumons. Dès que les poumons sont remplis, attachez la trachée avec le fil à coudre préparé tout en retirant le cathéter et mettez l’animal entier dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Une fois que l’aros s’est solidifié, en commençant par la trachée, excisez tout le poumon de la poitrine ouverte et lavez-le avec le PBS pré-refroidi à l’aide d’une paire de ciseaux pointus. Retirez le lobe pulmonaire droit. Séchez brièvement le bas du lobe sur une feuille de papier de soie, puis fixez le lobe à un bloc de préparation vibram à l’aide d’une goutte d’adhésif pour tissu pendant une minute.

Ensuite, installez le bloc dans la chambre de coupe du vibrato, puis remplissez la chambre avec le PBS pré-refroidi. Réglez le rasoir sur une vibration moyenne avec un réglage d’entraînement médial et coupez une section transversale horizontale du poumon. Placez ensuite la moitié supérieure du tissu pulmonaire tranché à l’envers dans une boîte de Pétri en plastique de cinq centimètres de diamètre.

Fixez le tissu pulmonaire à la boîte de Pétri en plaçant une rondelle plate dessus. Remplissez le plat avec 10 millilitres de PBS et ajoutez 10 microlitres de colorant cytoxine. Enfin, installez la parabole contenant le tissu pulmonaire sous l’objectif du microscope afin que le tampon puisse être réchauffé par un capteur de température contrôlé par un chauffage à 37 degrés Celsius pour l’imagerie.

Différentes zones le long de la dissection R balayent jusqu’à 400 micromètres de profondeur en utilisant une longueur d’onde d’éclairage de 800 nanomètres détectant la fluorescence verte de 530 nanomètres et la fluorescence rouge de 580 nanomètres, ainsi que la deuxième génération d’harmoniques ou signal SHG. Dans le conseil bleu, la fluorescence à une émission de 400 à 470 nanomètres avec des détecteurs de balayage externes non DS ou NDD montrés ici en bleu est le signal SHG de la structure du tissu alvéolaire d’un poumon non infecté d’une souris C 57 black six. Notez le tissu fibreux au bas de la tranche pulmonaire par rapport à l’organisation clairement alvéolaire dans les zones actives de respiration au sommet du poumon.

Dans cette figure, le signal cyt talk des noyaux de cellules pulmonaires ouverts lors de la préparation de la tranche pulmonaire est visualisé en rouge. Cette figure montre une superposition des deux canaux avec un gros plan de la zone encadrée du tissu montré ici. Ici. Le signal SHG bleu indique les structures alvéolaires et fongiques présentes dans une tranche pulmonaire d’une souris noire C 57 six infectée sept heures auparavant par l’afluite.

Sur cette figure, le signal de parole Cyt rouge montre non seulement les noyaux des cellules pulmonaires ouverts lors de la préparation de la tranche pulmonaire, mais aussi les filets d’ADN ici. Une superposition des deux canaux peut être vue dans ce graphique agrandi de la zone encadrée de la figure précédente. Les zones distinctes des masses fongiques, des alvéoles et des structures en filet sont indiquées respectivement par les lettres FA et N, la structure fongique combinée et le SHG du tissu alvéolaire bleu.

Le signal de conversation cyt des noyaux cellulaires et des filets rouges, ainsi que de nombreux neutrophiles infiltrant dans les poumons. Le vert peut être visualisé ici dans une tranche de tissu pulmonaire d’une souris lys EGFP. Sept heures après l’infection par les neutrophiles de la déesse afu en vert, on peut voir migrer et phagocyter les éléments fongiques en bleu dans les poumons infectés par les aspers, comme le montre le time-lapse.

Microscopie à deux photons d’une tranche de poumon vivant. Sept heures après l’infection, les noyaux cellulaires et les structures en filet sont représentés en rouge. Le temps réel de l’expérience est indiqué en bas à droite et la barre d’échelle est indicative de 50 micromètres.

Maintenant, cette méthode peut donner un aperçu des infections fongiques. Il pourrait également être appliqué à d’autres systèmes tels que les infections virales ou bactériennes, et il pourrait également donner un aperçu de la fonction d’autres cellules immunitaires résidentes à l’intérieur des poumons.