High-Throughput mesure et de classification de P organique dans les échantillons environnementaux

L’objectif général de cette procédure est de classer le phosphore organique hydrolysé par des enzymes dans des extraits de sol ou des échantillons de fumier. Pour ce faire, on extrait d’abord les échantillons avec une solution d’hydroxyde de sodium EDTA et on ajuste le pH des extraits. Ensuite, incubez ces extraits ajustés avec deux solutions enzymatiques différentes.

Sur une plaque à 96 puits, la dernière étape consiste à mesurer l’orthophosphate libéré par enzyme à l’aide de la colorimétrie bleu de molybdène. En fin de compte, la plupart des formes natives de phosphore monoester et de phosphore diaster de l’orthophosphate peuvent être classées dans des échantillons de sol ou de fumier en fonction de la libération différentielle d’orthophosphate par la méthode d’hydrolyse enzymatique. Cette méthode peut être réalisée à peu de frais dans n’importe quel laboratoire standard.

Le principal avantage qu’il présente par rapport aux méthodes existantes telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire du phosphore 31 est qu’il peut mesurer le potentiel des enzymes natives du sol à libérer de l’orthophosphate à partir de composés organiques de pois à l’avenir. Par conséquent, les données obtenues par cette méthode peuvent aider à prévoir la fertilité du sol ou le potentiel de libération de quantités nocives d’orthophosphate disponible pour les algues. Ajouter 30 millilitres de la solution d’hydroxyde de sodium à 0,25 molaire à deux grammes d’échantillon humide ou séché dans un tube conique de 50 millilitres.

Incuber avec agitation pendant 16 heures à température ambiante. Centrifugez les échantillons 3000 fois G pendant 30 minutes, puis transférez 100 microlitres dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre qui contient déjà un tampon d’acétate. L’échantillon ajusté a un volume total d’un millilitre et un pH de 5,0.

Préparez deux solutions mères contenant 0,5 unité par millilitre de phosphatase acide dans 10 millilitres d’acétate de sodium 0,1 molaire fraîchement préparé, pH cinq. Ajoutez maintenant la nucléase lyophilisée reconstituée NP one de Penicillium Citron dans l’un des tubes de 10 millilitres de stocks de phosphatase acide jusqu’à une concentration finale de 2,5 unités NP une par millilitre doucement mélangée en inversant plusieurs fois, centrifugez les deux solutions enzymatiques à 3000 fois G pendant 30 minutes. Afin de construire une courbe d’étalonnage, commencez par ajouter un millilitre d’une solution mère de phosphate de potassium millimolaire dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre et effectuez sept dilutions de céréales de 0,5 millilitre et jetez le premier tube de sorte que la dilution finale varie de 20 al à 0,625 nm de phosphore.

Transférez maintenant les étalons ORTHOPHOSPHATE dans les deux dernières colonnes de la plaque, en commençant par zéro orthophosphate NM dans la rangée A et en terminant par 20 nm d’orthophosphate dans la rangée H jusqu’aux trois premiers puits de la colonne 10. Ajoutez 40 microlitres de solution enzymatique PP plus GP dans les trois puits suivants de la colonne 10. Ajoutez 40 microlitres de PP plus GP plus NP une solution enzymatique.

Enfin, ajoutez 40 microlitres de tampon d’acétate de 100 millimolaires dans les six puits. Maintenant, chacun des six premiers puits de la colonne 10 doit contenir 80 microlitres de solution pour les deux puits suivants. Ajoutez 40 microlitres de solution d’acétate de sodium contenant 10 M de glucose, six phosphates et 40 microlitres de solution enzymatique PP plus GP.

Pour chaque échantillon analysé, répartissez 40 microlitres d’extraits d’échantillons au pH ajusté dans des puits de un à neuf sur un maximum de huit rangées après que tous les échantillons ont été distribués. À l’aide d’une pipette multicanaux, distribuez la solution enzymatique de PP et de GP dans les colonnes un à trois, de PP et de GP et de NP, un dans les colonnes quatre à six et un tampon d’acétate de sodium de 0,1 molaire dans les colonnes sept à neuf. Effectuez cette étape rapidement pour vous assurer que tous les échantillons bénéficient d’un temps d’incubation équivalent.

Couvrez la plaque à 96 puits avec un couvercle et incubez les échantillons, les solutions enzymatiques, les contrôles et la courbe d’étalonnage exactement une heure à 37 degrés Celsius dans de l’eau désionisée. Préparez 50 millilitres de chacune des quatre solutions mères. A doit être préparé quotidiennement à l’aide d’une pipette multicanaux rapidement.

Ajoutez 25 microlitres de SDS, 100 microlitres de solution A, 20 microlitres de solution B et 50 microlitres de solution C à tous les puits de la 96. Plaque de puits, couvrez la plaque et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Enfin, mesurez l’absorbance à 850 nanomètres dans n’importe quel lecteur de microplaques accordable en T à l’aide d’une application de tableur.

Tout d’abord, tracez la courbe d’étalonnage du phosphore inorganique avec de zéro à 20 nanomoles de phosphore sur l’axe des x et la moyenne des mesures d’absorbance dupliquée sur l’axe des y, effectuez une régression linéaire et trouvez l’équation de la droite de meilleur ajustement. Ensuite, calculez le phosphore inorganique de fond en faisant la moyenne des valeurs des colonnes un à trois, puis en appliquant la courbe d’étalonnage à l’ensemble de données. Ensuite, pour déterminer le phosphore dérivé de monoesters de phosphore hydrolysés, faites la moyenne des valeurs de l’échantillon en trois exemplaires des colonnes quatre à six et soustrayez la solution d’enzyme de contrôle plus le phosphore inorganique de fond.

Ensuite, pour calculer la teneur en phosphore du phosphore hydrolysé, les DER font la moyenne des valeurs de l’échantillon en trois exemplaires de la colonne sept à neuf et soustraient la solution enzymatique de contrôle plus le phosphore inorganique de fond et le phosphore mono-ester hydrolysé des colonnes quatre à six. Une plaque typique de 96 puits montre les résultats de huit échantillons et une courbe d’étalonnage. Les commandes se trouvent dans la colonne 10.

L’augmentation de l’intensité de la couleur entre les colonnes un à trois et quatre à six est due à l’hydrolyse des composés phosphoreux mono-esters entre les colonnes quatre à six et sept à neuf est due aux composés phosphorés hydrolysés de diamètre. Ici, la méthode d’hydrolyse enzymatique à haut débit a été utilisée pour analyser avec succès la distribution des classes de phosphore dans un hydroxyde de sodium de 0,25 molaire et des extraits EDTA de 0,05 molaire d’un échantillon de sol du Vermont. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les composés natifs d’orthophosphate, de monoester et de pois diaster dans les extraits de sol ou de fumier à l’aide de l’hydrolyse enzymatique.

Cette technique pourrait aider les chercheurs dans les domaines de la chimie de l’environnement et de la gestion des nutriments à explorer le comportement du phosphore organique dans les systèmes de sol ou de fumier.