High-Throughput mesure et de classification de P organique dans les échantillons environnementaux

L'objectif général de cette procédure est de classer le phosphore organique hydrolysé par des enzymes dans des extraits d'échantillons de sol ou de fumier. Cela est réalisé en extrayant d'abord les échantillons à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium et d'EDTA, puis en ajustant le pH des extraits. Ensuite, incuber ces extraits ajustés avec deux solutions enzymatiques différentes.

Dans une plaque de 96 puits, la dernière étape consiste à mesurer l'orthophosphate libéré par l'enzyme à l'aide de la colorimétrie au bleu de molybdène. En fin de compte, la plupart des formes natives de phosphore provenant d'orthoesters monoesters et de diesters peuvent être classifiées dans des échantillons de sol ou de fumier en fonction du relâchement différentiel de l'orthophosphate par la méthode d'hydrolyse enzymatique. Cette méthode peut être réalisée à moindre coût dans tout laboratoire standard.

L'avantage principal qu'elle présente par rapport aux méthodes existantes, comme la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du phosphore 31, est qu'elle permet de mesurer le potentiel des enzymes natives du sol à libérer de l'orthophosphate à partir de composés organiques de pois à l'avenir. Ainsi, les données obtenues grâce à cette méthode peuvent aider à prévoir la fertilité du sol ou le potentiel de libération par le sol de quantités nocives d'orthophosphate disponible pour les algues. Ajoutez 30 millilitres de la solution d'hydroxyde de sodium 0,25 molaire à deux grammes d'échantillon humide ou sec dans un tube conique de 50 millilitres.

Incuber avec agitation pendant 16 heures à température ambiante. Centrifuger les échantillons à 3000 ×g pendant 30 minutes, puis transférer 100 microlitres dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant déjà du tampon acétate. L'échantillon ajusté a un volume total d'un millilitre et un pH de 5,0.

Préparez deux solutions mères contenant 0,5 unité par millilitre de phosphatase acide dans 10 millilitres d’acétate de sodium 0,1 molaire fraîchement préparé à pH cinq. Ajoutez ensuite la nuclease NP un lyophilisée reconstituée provenant de Penicillium Citron dans l’un des tubes de 10 millilitres de solution mère de phosphatase acide, pour obtenir une concentration finale de 2,5 unités de NP un par millilitre, en mélangeant délicatement par retournements successifs. Centrifugez les deux solutions enzymatiques à 3000 ×g pendant 30 minutes. Afin d’établir une courbe d’étalonnage, commencez par ajouter un millilitre de solution mère de phosphate de potassium un millimolaire dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre, puis effectuez sept dilutions sérielles de 0,5 millilitre en éliminant le premier tube, de sorte que la gamme finale de dilutions s’étende de 20 µL à 0,625 nm de phosphore.

Transférez maintenant les étalons d'ORTHOPHOSPHATE dans les deux dernières colonnes de la plaque, en commençant par 0 nm d'orthophosphate en ligne A et en terminant par 20 nm d'orthophosphate en ligne H, dans les trois premiers puits de la colonne 10. Ajoutez 40 microlitres de solution d'enzyme PP plus GP dans les trois puits suivants de la colonne 10. Ajoutez 40 microlitres de solution d'enzyme PP plus GP plus NP.

Enfin, ajouter 40 microlitres de tampon acétate 100 millimolaire dans les six puits. À présent, chacun des six premiers puits de la colonne 10 doit contenir 80 microlitres de solution vers les deux puits suivants. Ajouter 40 microlitres de solution d'acétate de sodium contenant 10 M de glucose, six phosphate et 40 microlitres de solution enzymatique PP plus GP.

Pour chaque échantillon testé, répartir 40 microlitres d'extraits d'échantillons ajustés au pH dans les puits un à neuf de jusqu'à huit rangées après avoir réparti tous les échantillons. Utiliser une pipette multipuits pour répartir la solution enzymatique PP plus GP dans les colonnes un à trois, PP plus GP plus NP dans les colonnes quatre à six, et du tampon acétate de sodium 0,1 molaire dans les colonnes sept à neuf. Effectuer cette étape rapidement afin de garantir un temps d'incubation équivalent pour tous les échantillons.

Couvrez la plaque de 96 puits avec un couvercle et incubez les échantillons, les solutions d'enzymes, les témoins et la courbe d'étalonnage exactement une heure à 37 degrés Celsius dans de l'eau déionisée. Préparez 50 millilitres de chacune des quatre solutions mères. La solution A doit être préparée quotidiennement à l'aide d'une pipette multipuits rapidement.

Ajouter 25 µL de SDS, 100 µL de solution A, 20 µL de solution B et 50 µL de solution C dans tous les puits de la plaque 96 puits. Couvrir la plaque et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Enfin, mesurer l'absorbance à 850 nanomètres à l'aide d'un lecteur de microplaque réglable sur toute longueur d'onde, en utilisant une application tableur.

Tout d'abord, tracez la courbe de calibration du phosphore inorganique en portant de 0 à 20 nanomoles de phosphore sur l'axe des abscisses et la moyenne des mesures d'absorbance en double sur l'axe des ordonnées, effectuez une régression linéaire et déterminez l'équation de la droite de régression. Ensuite, calculez le phosphore inorganique de fond en faisant la moyenne des valeurs des colonnes une à trois, puis en appliquant la courbe de calibration au jeu de données. Pour déterminer ensuite le phosphore issu de l'hydrolyse des monoesters de phosphore, faites la moyenne des valeurs en triple des échantillons des colonnes quatre à six et soustrayez la solution témoin d'enzyme ainsi que le phosphore inorganique de fond.

Ensuite, pour calculer la teneur en phosphore à partir du phosphore hydrolysé, les DER font la moyenne des valeurs des échantillons en triple exemplaire des colonnes sept à neuf et soustraient la solution enzymatique témoin, ainsi que le phosphore inorganique de fond et le phosphore monoester hydrolysé provenant des colonnes quatre à six. Une plaque type de 96 puits présente les résultats pour huit échantillons et une courbe d'étalonnage. Les témoins se trouvent dans la colonne 10.

L'augmentation de l'intensité de la couleur entre les colonnes une à trois et quatre à six est due aux composés de phosphore de monoesters hydrolysés ; entre les colonnes quatre à six et sept à neuf, elle est due aux composés de phosphore de diesters hydrolysés. Ici, la méthode d'hydrolyse enzymatique à haut débit a été utilisée pour analyser avec succès la répartition des classes de phosphore dans des extraits d'un échantillon de sol du Vermont contenant de l'hydroxyde de sodium 0,25 molaire et de l'EDTA 0,05 molaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer les composés de phosphate orthophosphate natif, de monoesters et de diesters dans des extraits de sol ou de fumier à l'aide de l'hydrolyse enzymatique.

Cette technique pourrait aider à ouvrir la voie aux chercheurs dans les domaines de la chimie environnementale et de la gestion des nutriments pour explorer le comportement du phosphore organique dans les systèmes de sol ou de fumier.