Haute Sensibilité 5-hydroxyméthylcytosine détection dans le tissu cérébral des souris Balb / C

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser et de quantifier cinq méthylcytosines et cinq hydroxyéthylcytosines au sein d'un locus spécifique de l'ADN génomique. Cela est réalisé en bloquant le groupe hydroxyle de la cinq hydroxyéthylamine, ce qui convertit un site clivable MSP1 en un site non clivable. Dans une deuxième étape, l'ADN génomique est digéré par les enzymes de restriction MSP1 et HpaII, qui exploitent leurs sensibilités différentielles à la méthylation pour identifier les sites de cinq hydroxyéthylcytosine liés au glucose.

Ensuite, une PCR est utilisée afin d'interroger le locus. Les résultats obtenus montrent la présence de cinq hydroxyéthyl cytosine dans un locus spécifique. La PCR quantitative peut être utilisée pour quantifier la quantité de cinq méthyl cytosine et de cinq hydroxyéthyl cytosine.

L'avantage principal de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que le séquençage au bisulfite, est que vous pouvez discriminer entre la cinq-méthylcytosine et la cinq-hydroxyméthylcytosine. Les expériences réalisées aujourd'hui utiliseront Romas Vice Villa. Romas a été un développeur principal de ce kit chez New England Biolabs. Avant le début de ce protocole, purifiez l'ADN génomique à partir de tissu cérébral de B. Sea selon la procédure écrite, dans un tube réaction de 1,5 millilitre. Mélangez l'ADN génomique, l'UDP-glucose, le tampon NEB buffer 4 et suffisamment d'eau libre de nucléase pour obtenir un volume total de 310 microlitres.

Séparez ce mélange réactionnel en deux tubes de 155 microlitres chacun. Ajoutez ensuite 30 unités ou trois microlitres de T four beta gluc cosal transférase dans un tube. Mélangez soigneusement en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas.

Ne pas ajouter le T four BGT au deuxième tube, car il s'agit de la réaction témoin, mais veiller à ajouter trois microlitres d'eau. Incuber les deux tubes à 37 degrés Celsius pendant 12 à 18 heures, durant lesquelles la BGT ajoutera du glucose au groupe hydroxyle des groupes cinq hydroxyéthyl cytosine dans l'échantillon. Pour commencer la digestion par l'enzyme de restriction, prélever 50 microlitres du mélange réactionnel et les répartir dans chacun des trois tubes PCR de 0,2 millilitre étiquetés de un à trois.

Ensuite, aliquoter 50 microlitres du mélange témoin dans chacun des trois tubes en bande PCR étiquetés de quatre à six. Ajouter 100 unités de msp, une dans les tubes un et quatre. Puis ajouter 50 unités de HPA deux dans les tubes deux et cinq et mélanger soigneusement en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas.

Ne rien ajouter aux tubes trois et six, car ils servent de témoins. Incuber les six tubes à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Ensuite, ajouter un microlitre de protéinase K dans chaque tube et incuber à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Enfin, inactiver la protéinase K en incubant à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Cette procédure est démontrée en utilisant l'ampTAC long de NE B pour une PCR en point final. Toutefois, d'autres réactifs et protocoles de PCR peuvent être utilisés dans un tube de réaction PCR de 0,2 millilitre placé sur de la glace.

Ajouter le tampon de réaction TAC long x5, les dNTP, les amorces sens et antisens, l'ADN matrice obtenu précédemment, la polymérase long AMP T ADN et suffisamment d'eau sans nuclease pour obtenir un volume final de 50 microlitres. Mélanger délicatement la réaction si nécessaire, puis rassembler tout le liquide au fond du tube par une courte centrifugation. Transférer les tubes PCR de la glace vers un thermocycleur dont le bloc a été préchauffé à 94 degrés Celsius, puis démarrer le programme de cyclage pour une PCR classique en trois étapes.

Il doit y avoir une étape initiale de dénaturation à 94 degrés Celsius pendant 30 secondes, suivie de 30 cycles de dénaturation à 94 degrés Celsius pendant 15 secondes, d'hybridation à 55 à 65 degrés Celsius pendant 30 secondes et d'élongation à 65 degrés Celsius pendant 20 secondes ou 50 secondes par kb. Ceci doit être suivi d'une élongation finale unique à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Une PCR en temps réel peut également être réalisée pour quantifier les quantités de cinq méthylcytosine et de cinq hydroxyméthylcytosine.

Veuillez vous référer au manuel du produit disponible sur nb.com pour des informations spécifiques. Une comparaison de cinq quantités d'hydroxyéthyl aine au locus 12 a été réalisée à l'aide de la PCR en point final et de la PCR en temps réel ; quatre échantillons différents de tissus murins BSY ont été analysés, incluant le cerveau, le foie, le cœur et la rate.

La variation du cinq hydroxyéthylcytosine est apparente dans la bande de gel encadrée des échantillons PCR en point final à des fins comparatives. Les données de PCR en temps réel ont été normalisées par rapport à l'ADN non coupé et une courbe standard a été utilisée pour déterminer le nombre de copies. Les échantillons ont été normalisés en divisant le nombre de copies des échantillons par le nombre de copies du témoin non digéré.

Ici, la variation de la cinq hydroxyéthylcytosine peut être observée en comparant les barres jaunes. Quelques remarques sur la réalisation de la technique. Il est essentiel que toutes les réactions enzymatiques soient menées à terme. Pour la BGT, il est important que vous laissiez toute la nuit afin de pouvoir isoler complètement tous les sites d'ADN pour Ms.P un, et pour HEPA deux, il est important que vous laissiez au moins quatre heures lors de ces réactions pour vous assurer d'atteindre la complétion.

Enfin, nous fournissons des contrôles d'ADN et des contrôles d'amorces afin que vous puissiez réaliser des réactions témoins en parallèle.