Mesure précise et simple de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β en utilisant un dosage de sang total Stimulation

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les cytokines pro-inflammatoires produites dans un test de stimulation du sang total. Tout d'abord, les composants cellulaires du sang total sont isolés du plasma par centrifugation, et les globules blancs sont dénombrés à l'aide d'une coloration au rouge de toluidine. Ensuite, les cellules sont mises en culture et stimulées par du LPS, suivi d'un TP, afin d'induire la production de cytokines par les cellules exprimant des récepteurs de reconnaissance de motifs microbiens. Les surnageants de culture sont ensuite recueillis à des points temporels précis suivant le début de la stimulation.

Enfin, les concentrations en cytokines dans les surnageants sont mesurées à l’aide d’un dosage multiplex sur plaque de 96 puits. Grâce à cette méthode simple, les variations des concentrations de cytokines pro-inflammatoires produites par des cellules stimulées provenant de différents donneurs peuvent être évaluées rapidement. Cette méthode est particulièrement utile pour identifier une maladie inflammatoire médiée par le type I chez des patients présentant une manifestation pathologique anti-inflammatoire, notamment dans les cas où le volume de sang disponible est limité.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes pour la mesure des concentrations en cytokines réside dans le fait que la technologie basée sur Luminex permet la quantification simultanée de plusieurs cytokines tout en utilisant un faible volume d'échantillon. Prélevez des échantillons contenant 10 millilitres ou plus de sang veineux chez les individus atteints, ainsi que chez des témoins sains appariés par âge et sexe, en veillant à ce que les prélèvements soient réalisés dans des tubes vacutainer contenant de l'héparinate de sodium, et n'ajoutez ni EDTA ni tout autre anticoagulant, car ceux-ci interféreraient avec le test. Traitez les échantillons dès que possible après leur collecte. Si nécessaire, les échantillons peuvent être conservés jusqu'à 24 heures à température ambiante, à l'abri de la lumière.

Centrifuger les échantillons de sang à 3000 tr/min pendant 10 minutes à température ambiante, sans frein. Une fois la centrifugation terminée, retirer le plasma du haut des tubes en prenant soin de ne pas perturber la couche de buffy coat contenant les cellules mononucléées. Resuspendre le buffy coat et le culot de globules rouges sous-jacent dans du milieu RPMI sans sérum à température ambiante afin de laver les cellules, en pipetant doucement une à plusieurs fois le mélange.

Ensuite, transférez les cellules du tube de collecte dans un tube conique de 50 millilitres. Complétez le volume à 50 millilitres avec du RPMI et retournez doucement chaque tube pour homogénéiser. Centrifugez les cellules une fois de plus à 3000 tr/min pendant 10 minutes.

Ensuite, aspirez le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire. Répétez cette étape de lavage de deux à quatre fois afin d'éliminer les contaminants et les cytokines liées aux cellules. Une fois les cellules lavées, resuspendez-les dans du RPMI sans sérum jusqu'à un volume total de 20 millilitres. Pour compter les cellules, chargez 20 microlitres d'une mixture un-à-un d'échantillon et d'orange d'acridine dans une chambre de comptage jetable. L'orange d'acridine utilisée à une concentration finale de un microgramme par millilitre ne colore que les leucocytes nucléés, ce qui permet de les différencier des globules rouges.

Ne compter que les cellules D positives une fois le décompte cellulaire effectué. Résuspendre les échantillons dans du RPMI sans sérum afin d'obtenir une concentration finale de 2 millions de cellules par millilitre. Pour chaque échantillon, étiqueter des puits dupliqués d'une plaque 24 puits avec les conditions expérimentales à tester.

Dans ce cas, les conditions sont non stimulées, LPS seul, un TP seul, et LPS plus un TP. Ajoutez un millilitre de cellules diluées dans chaque puits et ajoutez le LPS aux puits appropriés à une concentration finale d'un microgramme par millilitre. Incubez les échantillons à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures et 40 minutes. Après cette période d'incubation initiale, ajoutez le TP à une concentration finale de deux millimolaire dans les puits contenant uniquement le TP et ceux contenant LPS plus le TP. Incubez ensuite les plaques pendant 20 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius.

Une fois la deuxième incubation terminée, transférez les cellules de chaque puits dans des tubes microcentrifugeurs séparés de 1,5 millilitre préalablement étiquetés, centrifugez les échantillons à 10 000 RRP M pendant deux minutes à température ambiante, puis transférez le surnageant de chaque tube dans un nouveau tube EOR préalablement étiqueté. Le surnageant peut être analysé immédiatement pour les cytokines ou conservé congelé afin d'évaluer les concentrations d'IL-1β ou d'autres cytokines. Pour les échantillons, nous utilisons le bio plex pro, cytokine humaine X plex avec le système Bio Plex 200.

Suivant les instructions du fabricant. Dans cette figure, l'analyse de la production d'IL-1β après stimulation de cellules sanguines totales normales par le LPS, l'ATP ou les deux stimuli ensemble montre une réponse au LPS plus à l'ATP, dont l'ampleur dépend du nombre de cellules stimulées. Contrairement aux témoins sains, les tests sur sang total réalisés à partir de patients présentant des pathologies auto-inflammatoires révèlent une production accrue d'IL-1β après stimulation par le LPS, en l'absence d'ATP ajouté de façon exogène. N'oubliez pas que le travail avec des fluides corporels humains tels que le sang peut être extrêmement dangereux, et que des précautions universelles doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.