Caractériser Volatiles bactérienne secondaire à l'aide d'ionisation électrospray spectrométrie de masse (SESI-MS)

L’ionisation par électronébulisation secondaire, la spectrométrie de masse ou CS EMS permet l’analyse des substances volatiles bactériennes sans nécessiter d’échantillon. Prétraitement. L’espace de tête de la culture bactérienne est déplacé par le dioxyde de carbone dans la chambre de réaction cssi. Lorsque les substances volatiles traversent la chambre de réaction SSI, elles traversent le nuage d’électropulvérisation et deviennent ionisées.

Une fois ionisés, les composés volatils sont aspirés dans le spectromètre de masse pour analyse. L’excès de gaz porteur et les substances volatiles bactériennes non réactives sont passés à travers un filtre de 0,22 micron pour éliminer tous les agents bactériens en tant que mesure supplémentaire de protection d’un capot chimique. En fin de compte, ce protocole CSI MS offre des empreintes bactériennes volatiles en quelques minutes.

Nous prévoyons que cette technologie pourrait être utilisée dans de nombreuses applications, y compris l’expiration, l’analyse de l’haleine pour les maladies infectieuses, ou même appliquée aux systèmes alimentaires où nous pourrions être en mesure de détecter rapidement les agents pathogènes qui se trouvent sur ou N dans nos aliments. Cette technique présente plusieurs avantages principaux. Par rapport aux méthodes existantes telles que le tamisage GCMS, le MS et le PT, RM S en premier, les volatils ne nécessitent aucun prétraitement avant l’analyse.

Deuxièmement, il est possible de fragmenter des ions spécifiques dans le mélange volatil, ce qui facilite l’identification des composés. Et troisièmement, c’est rapide. Cela prend généralement moins de cinq minutes.

Pour analyser chaque échantillon, choisissez le récipient approprié pour la culture de votre culture, en tenant compte des exigences de croissance de l’espèce, ainsi que de l’apport efficace des substances volatiles au spectromètre de masse. Dans cette démonstration, nous avons sélectionné des bouteilles de milieu de bûcher standard de 100 millilitres. Les substances volatiles bactériennes sont acheminées vers le spectromètre de masse par un flux de gaz porteur pour assembler le vecteur.

Les conduites de gaz s’adaptent aux bouteilles de culture avec des bouchons filetés qui ont au moins deux orifices de leurre. Insérez les conduites d’entrée et de sortie de gaz à travers les orifices de leurre et bouchez tous les orifices supplémentaires avant de cultiver vos échantillons. Mettez les récipients sous pression et immergez-les dans l’eau pour vérifier s’il y a des fuites.

Les fuites de gaz sont l’une des principales causes de résultats atypiques sous forme de faible ou d’absence. Les signaux ioniques volatils se développent pendant la nuit. Cultures d’e coli, de K 12 et de Pseudomonas aerogen, PAO une à LB Lennox en préparant deux répétitions biologiques pour chaque espèce.

Préparez neuf flacons de culture stériles contenant 50 millilitres de LB Lennox et un flacon non inoculé à utiliser comme inoculation vierge et versez chaque culture de nuit dans deux flacons d’échantillon. En créant des répliques techniques, incubez les cultures et le blanc pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Étant donné que le SSCE est spécialement conçu pour échantillonner des substances volatiles, limitez l’utilisation de produits de soins personnels parfumés avant d’utiliser l’instrument de manière serrée.

Boucher tous les produits chimiques volatils dans le laboratoire et contrôler autant que possible les courants d’air pendant les tests pour éviter la contamination de votre instrument et des conduites de transfert de gaz. Avec des agents biologiques viables, installez des filtres de la taille appropriée des pores dans la conduite de gaz vecteur. Les filtres n’interfèrent pas avec le transfert des substances volatiles vers la chambre de réaction sesi, mais peuvent légèrement affecter l’efficacité du transfert d’aérosols.

Afin de vérifier que l’alimentation en tension est coupée et que le système est déchargé d’électricité, vérifiez que les voyants du fournisseur de tension sont éteints. Assurez-vous que la tension sur le multimètre est nulle et mettez à la terre les fils électriques. À ce stade, installez la solution d’électropulvérisation pour l’analyse.

En mode ions positifs, nous utilisons une solution d’électropulvérisation de 0,1 % d’acide formique, 5 % de méthanol et 94,9 % d’eau Afin d’obtenir une intensité et une stabilité optimales du signal, allumez le gaz porteur de dioxyde de carbone et réglez le débit à deux litres par minute. Appliquez une pression sur le réservoir d’électropulvérisation pour initier l’administration de la solution d’électropulvérisation dans la chambre de réaction à un débit de cinq nanolitres par seconde. Ensuite, allumez l’alimentation en tension et ajustez la tension à 2,5 kilovolts.

La tension appliquée affecte l’intensité ionique du signal et la stabilité du cône d’électrospray Tailor pour nos tensions système comprises entre deux et cinq kilovolts. Fournir les meilleurs résultats en mode d’ions positifs Prudence car à ce stade, les surfaces métalliques de la source d’ionisation sont capables de délivrer un choc dangereux. Configurez maintenant une méthode de réglage pour surveiller le spectre SEMS.

Décochez la case Acquisition multicanal ou MCA. Réglez le temps d’acquisition sur 10 à 15 minutes et lancez l’acquisition des données. Observez les spectres du fond de gaz porteur et ajustez avec précision la tension appliquée pour obtenir un chromatogramme d’ions totaux stable et des balayages reproductibles.

Continuez à recueillir les spectres et un TIC pendant cinq minutes pour vous assurer que l’instrument est stabilisé avec l’instrument assuré. Entrez les paramètres d’acquisition appropriés pour votre expérience. Enregistrer un spectre de fond de gaz porteur pour les expériences futures.

Pour collecter un Spectrum vierge. Dirigez le flux de gaz porteur à travers les conduites de dérivation, puis fixez l’échantillon à blanc avec les vannes fermées aux conduites de transfert de l’instrument. Ouvrez les vannes du flacon d’échantillon et fermez les vannes des conduites de dérivation.

Pour des spectres reproductibles. Laissez le système s’équilibrer pendant 30 secondes, pendant lesquelles l’humidité dans la chambre de réaction se stabilise. Pour vous assurer que le système est équilibré, surveillez le TIC, qui changera au cours de la période d’équilibre suivie de la stabilisation.

Une fois le système équilibré, lancez la collecte du spectre. Une fois le spectre collecté, retirez le flacon d’échantillon en ouvrant d’abord les conduites de dérivation du gaz vecteur. Puis en fermant les vannes d’échantillonnage.

Et enfin, en retirant la bouteille d’échantillon. Rincez le système avec le gaz porteur pendant deux à quatre minutes pour éliminer l’humidité et les composés volatils absorbés des conduites de transfert et éviter le transfert d’échantillon à échantillon. Collectez des données d’empreintes volatiles pour chaque échantillon bactérien, en collectant par intermittence des spectres de blanc supplémentaires pour assurer une soustraction complète des blancs.

Le mode ionique positif empreintes volatiles pour e coli et p aerogène. Cultivé en aérobie à LB, Lennox pendant 24 heures à 37 degrés Celsius sont distincts. Le spectre volatile d’E coli est dominé par l’indu avec un rapport masse/charge de 118, tandis que le spectre de Pseudomonas aerogen contient une plus grande variété de pics protéiques ajoutables.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important que vous enregistriez les paramètres instrumentaux que vous avez optimisés pour votre analyse, tels que la tension appliquée, la composition de la solution d’électropulvérisation et le débit de gaz vecteur. Il est également important que vous conserviez des enregistrements de vos spectres représentatifs afin de pouvoir reproduire vos analyses à l’avenir. N’oubliez pas que travailler avec des bactéries pathogènes et une haute tension peut être extrêmement dangereux.

Par conséquent, des précautions telles que la limitation de l’accès au CMS css pendant l’expérience doivent toujours être prises. Vous devriez donc maintenant être en mesure d’obtenir de manière reproductible un CSS, des spectres EMS pour les substances volatiles bactériennes de votre système. Bonne chance.