Name: Préparation et utilisation de VIH-1 primaires CD4 + T-cellules comme cellules cibles dans des cellules tueuses naturelles Tests cytotoxiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Apprenez à évaluer la réponse cytotoxique des cellules NK contre les cellules T CD4+ infectées par le VIH-1. Cette méthode utilise l'analyse cytométrique et le test de libération au chrome pour étudier les interactions récepteur-ligand.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III%2FLAV-infected+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li>
<li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li>
<li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li>
<li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li>
<li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+endogenously+infected+CD4%2B+T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li>
<li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells%3A+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li>
<li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li>
</ol>

Une fois fait correctement les analyses décrites dans ce protocole devrait donner une image représentative de la capacité des cellules NK à l&#39;encontre dégranulent et Lyse VIH-1 des cellules infectées (voir figure 5). Dégranulation des cellules NK dans la réponse au VIH des cellules infectées et les cellules NK lyse des cellules infectées par le VIH doit être directement proportionnelle 10. Des résultats fiables pour les deux dosages de cellules NK fonctionnelles pour mesurer les réponses cytotoxiques pour les cellules infectées par le VIH sont dépendants de l&#39;isolement des cellules NK hautement purifié ainsi que d&#39;une population hautement purifiée de cellules infectées. Ayant purifié les cellules NK et le VIH-1 des cellules infectées sont essentielles pour la réalisation d&#39;un effecteur assez précis pour objectif de ratio de cellules. De même, l&#39;élimination des cellules mortes et l&#39;apoptose des populations de cellules cibles est importante avant 51 Cr étiquetage ou l&#39;incubation avec les cellules effectrices. 51 Cr peut être internalisé par les cellules qui subissent l&#39;apoptose comme la présence de cellules mortes ou apoptotiques pendant l&#39;étape de marquage isotopique donnera lieu à un communiqué de haute spontanée et de fausser la lyse% calculé spécifiques. Par ailleurs, la présence de cellules mortes ou apoptotiques peuvent déclencher la dégranulation des cellules NK résultant en des niveaux anormalement élevés d&#39;expression CD107a. Pipetage précis est nécessaire pour retirer les surnageants acellulaires après incubation des cellules NK et les cellules cibles dans les 51 tests de libération de Cr, comme des différences dans le volume de surnageant retiré de chaque répétition et se traduira par haute déviations standard. Des modifications peuvent être apportées à ces protocoles pour évaluer le rôle des récepteurs spécifiques dans le déclenchement de NK NK lyse des cellules infectées par le VIH des cellules en incubant les effecteurs ou les cibles avant de co-culture avec des anticorps antagonistes des récepteurs spécifiques ou ligands 6,11. Cytokine-traitée cellules NK (par exemple, l&#39;IL-2, IL-15) peut être utilisé pour évaluer la fonctionnalité des cellules NK stimulées 12. De même, les anticorps des dosages de cytotoxicité cellulaire dépendante peut être effectuée en utilisant ces protocoles. Anticorps anti-VIH (par exemple, anti-gp120) peuvent être ajoutés à des cellules cibles pour la reconnaissance par les récepteurs des cellules NK CD16 faible affinité Fc 13. Ces tests, bien que mis en place pour mesurer les réponses des cellules NK cytotoxiques pour les cellules infectées par le VIH, peut également être modifiée pour mesurer la capacité des cellules NK à produire des cytokines après la reconnaissance des cellules infectées par le VIH. Bien que nous avons décrit dans ce protocole l&#39;utilisation de cellules in vitro infectées que les cellules cibles, nous avons récemment décrit la génération des cellules cibles de patients infectés par le VIH. Cela nécessite l&#39;isolement des cellules T CD4 + cellules suivie d&#39;une expansion des cellules sur une période de deux semaines après stimulation par des mitogènes, en présence d&#39;interleukine-2 11. Après la période de deux semaines d&#39;expansion, les protocoles décrits dans cet article sont utilisés pour isoler les cellules cibles.

<table><tbody><tr><td>Tubes Vacutainer (héparine de sodium)</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'isolement des cellules T CD4+</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>PBS sans Ca²⁺ ni Mg²⁺</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de séparation des lymphocytes</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline / Streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'expansion des cellules T</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-441</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sans Ca²⁺ ni Mg²⁺ (1x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td></td><td>46-034-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'isolement négatif des cellules NK</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-657</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'isolement positif CD4+</td><td>Invitrogen</td><td>113.31D</td><td></td></tr><tr><td>Kit de suppression des cellules mortes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PacificBlue</td><td>BD Biosciences</td><td>558117</td><td></td></tr><tr><td>CD14 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>325616</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>302328</td><td></td></tr><tr><td>CD56 APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD69 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>CD107a FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;Chromium</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030002MC</td><td></td></tr><tr><td>Tubes pour compteur gamma</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1270-401</td><td></td></tr><tr><td>Compteur gamma automatique 2470</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>2470-0050</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FJ-9-1YR</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation et utilisation de vih-1 primaires cd4 + t-cellules comme cellules cibles dans des cellules tueuses naturelles tests cytotoxiques

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) sont une composante essentielle de la réponse immunitaire innée au virus des cellules infectées. Il est important de comprendre la capacité des cellules NK de reconnaître et de lyser le VIH-1 des cellules infectées parce identifier toute aberration dans la fonction des cellules NK contre les cellules infectées pourrait potentiellement mener à des thérapies qui permettraient d&#39;améliorer leur activité cytolytique. Il est nécessaire d&#39;utiliser infectés par le VIH des cellules T primaires explosions comme cellules cibles infectées plutôt que-lignées de lymphocytes T dans les tests de cytotoxicité. Lignées cellulaires T, même sans infection, sont très sensibles à la lyse des cellules NK. Par ailleurs, il est nécessaire d&#39;utiliser des cellules autologues primaires pour prévenir les grandes classes complexe majeur d&#39;histocompatibilité, je inadéquation entre la cible et de cellules effectrices qui se traduira par la lyse. Les premières études évaluant les réponses des cellules NK cytolytiques primaires aux cellules infectées a échoué à montrer tuant significative de l&#39;1,2 cellules infectées. Cependant, en utilisant le VIH-1 primaires de cellules T comme cellules cibles des cellules NK dans les dosages fonctionnels a été difficile en raison de la présence de cellules non infectées contaminent 3. Cette cellule infectée incompatibles ratio de cellules non infectées se traduira par la variation de tuer des cellules NK entre les échantillons qui peuvent ne pas être dû à la variabilité en fonction des donneurs de cellules NK. Ainsi, il serait bénéfique de travailler avec une population de cellules infectées purifiée afin d&#39;uniformiser l&#39;effecteur à la cible cellulaire ratios entre les expériences 3,4. Ici nous démontrons l&#39;isolement d&#39;une population hautement purifiée de VIH-1 des cellules infectées en prenant avantage de la capacité du VIH-1 à bas moduler CD4 sur les cellules infectées et la disponibilité de kits commerciaux pour enlever les cellules mortes ou mourantes 3-6. Le purifiée infectés primaires de cellules T explosions peuvent ensuite être utilisés comme cibles soit dans une dégranulation ou dosage cytotoxique des cellules NK purifiées que la population effectrice 5-7. Utilisation des cellules NK comme effecteurs dans un essai de dégranulation évalue la capacité d&#39;une cellule NK pour libérer le contenu lytique des lysosomes spécialisés 8 appelées «granules cytolytiques&quot;. Par coloration avec un anticorps conjugué contre le fluorochrome CD107a, une protéine membranaire lysosomale qui devient exprimé à la surface des cellules NK cytolytiques lorsque les granulés fusionner à la membrane plasmique, nous pouvons déterminer quel est le pourcentage de cellules NK dégranulent en réponse à la reconnaissance des cellules cibles. Alternativement, l&#39;activité lytique des cellules NK peut être évaluée dans un essai cytotoxique qui permet la détermination du pourcentage de cellules cibles lysées par la libération de 51 Cr au sein de la cellule cible, en présence de cellules NK.

Des essais de cytotoxicité à mesurer les réponses des cellules tueuses naturelles lytique aux cellules infectées est limitée par la pureté des cellules cibles. Nous démontrons ici l&#39;isolement d&#39;une population hautement purifiée de VIH-1 primaires de cellules T explosions en profitant de la capacité du VIH-1 s à bas moduler CD4.

Préparation et utilisation de VIH-1 primaires CD4 + T-cellules comme cellules cibles dans des cellules tueuses naturelles Tests cytotoxiques

Les cellules Natural Killer (NK) constituent un composant essentiel de la réponse immunitaire innée contre les cellules infectées par des virus. Il est important de comprendre la capacité des cellules NK...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la réponse cytotoxique des cellules NK contre les cellules infectées par le VIH-1. Cela est réalisé en isolant et en infectant d'abord des cellules T CD4-positives provenant de sang veineux, puis en isolant des cellules tueuses naturelles (NK) du même donneur.Ensuite, les lymphocytes T CD4 positifs non infectés sont isolés à partir des cellules infectées. Enfin, les cellules infectées et les cellules NK sont utilisées respectivement comme cibles et effecteurs dans l'un des deux tests permettant d'évaluer la cytotoxicité des cellules NK. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant que les cellules NK peuvent répondre aux cellules infectées par le VIH-1 par la surexpression de CD107a, une expression déterminée par analyse cytométrique en flux, ou par la libération de chrome 51 détectée à l'aide d'un compteur gamma.Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine du VIH-1, telles que : les cellules NK réagissent-elles aux cellules infectées par le VIH-1 ? Quelles interactions récepteur-ligand sont importantes dans les interactions entre cellules NK et cellules T ? Et les protéines virales du VIH-1 modulent-elles la réponse des cellules NK face aux cellules infectées par le VIH-1 ? Après avoir stimulé des cellules T CD4-positives isolées à partir de sang périphérique humain à l’aide de billes couplées à l’anti-CD3 et à l’anti-CD28 pendant 72 heures, dénombrer la population de cellules T obtenue à l’aide d’un hémocytomètre, puis diviser la culture en deux groupes : environ 2 × 10⁶ cellules T dans un tube conique de 15 millilitres destiné au groupe témoin non infecté, et le reste de la suspension de cellules T CD4-positives dans un tube conique de 50 millilitres destiné au groupe d’infection.Centrifuger les deux groupes à 300 ×g à 22 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis aspirer le surnageant. Résuspender les cellules T CD4 positives du tube de 50 millilitres directement dans des fluides de culture contenant des virions, et ajouter de la polybrienne à une concentration finale de 10 milligrammes par millilitre. Ensuite, centrifuger pour infecter les cellules à 1200 ×g pendant deux heures à une température de 20 à 25 degrés Celsius.Ici, les cellules sont infectées par le DHIV trois à une multiplicité de cinq. Une fois l'infection par centrifugation terminée, retirez le surnageant et resuspendez les cellules infectées à une densité de trois fois 10 à la puissance six par millilitre dans du RPMI complet supplémenté en 100 unités par millilitre d'IL deux.Ensuite, cultiver les cellules non infectées et les cellules nouvellement infectées pendant 72 heures dans une plaque de six puits. Si un virus incapable de se répliquer a été utilisé pour infecter les cellules, ou pendant cinq à sept jours si un virus capable de se répliquer a été utilisé, recueillir le surnageant contenant les cultures de lymphocytes T CD4 positifs infectés et centrifuger les cellules à 300 ×g pendant 10 minutes à 22 °C avec freinage ; aspirer le surnageant et resuspendre. Suspendre le culot dans deux millilitres de PBS contenant 2 % de FCS et deux millimolaires de EDTA, puis dénombrer les cellules à l’aide d’un hémocytomètre en utilisant un kit d’isolement CD4 positif.Éliminer les cellules T non infectées CD4 positives. Suivre les instructions du fabricant pour l'isolement des cellules T CD4 positives, à l'exception du fait qu'un rapport de un anticorps anti-CD4 par cellule est utilisé. Ensuite, éliminer les cellules mortes de la population cellulaire purifiée contenant le virus à l'aide d'un kit de suppression des cellules mortes.Suivant les instructions du fabricant, recueillir la population de lymphocytes T vivants et centrifuger les cellules purifiées à 300 G pendant 10 minutes. Avec le frein activé, retirer ensuite le surnageant, resuspendre le culot. Suspender dans un millilitre de RPMI complet et compter les cellules. Les cellules NK provenant du sang périphérique sont d'abord isolées à partir du même donneur que celui des lymphocytes T CD4 positifs.Après une culture nocturne, comptez les cellules NK à l’aide d’un cytomètre hématique, centrifugez-les à 300 ×g pendant 10 minutes avec le frein activé, puis resuspendez les cellules dans du RPMI complet en ajustant la concentration finale à 10⁶ cellules par millilitre. Ensuite, récupérez et centrifugez les suspensions de lymphocytes T purifiés, infectés et non infectés (témoins) à 300 ×g pendant 10 minutes. Avec le frein activé, éliminez le SANE et resuspendez les culots.Dans le RPMI complet à deux fois 10 puissance 6 cellules par millilitre pour un contrôle positif, environ deux fois 10 puissance 6 de cellules K562 sensibles à la lyse par les cellules NK sont utilisées dans cette vidéo. Centrifuger les cellules K562 à 300 g pendant 10 minutes avec frein activé, puis retirer le surnageant et resuspendre le culot dans le RPMI complet à deux fois 10 puissance 6 cellules par millilitre.Une fois toutes les populations cellulaires lavées et resuspendues à leurs concentrations expérimentales, placer les cellules NK ensemble avec soit des cellules K562, soit des lymphocytes T non infectés, soit des lymphocytes T infectés par le VIH. Dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits en V, un seul réplicat par type de cellule cible sera utilisé pour mesurer la dégranulation non spécifique des cellules NK. Ajouter 100 microlitres de cellules effectrices NK et 100 microlitres de milieu uniquement dans un puit.Ajouter dans chaque puits 10 microlitres d'anticorps anti-CD107a conjugué à un fluorochrome, puis centrifuger la plaque à 20 ×g pendant deux minutes avec freinage activé à 22 degrés Celsius. Incuber ensuite la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures. Après l'incubation, centrifuger la plaque à 400 ×g pendant cinq minutes avec freinage activé à 22 degrés Celsius, puis éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette d’aspiration de deux millilitres équipée d’une pointe P200.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon d'écoulement dans chaque puits, puis étiquetez les cellules avec les anticorps anti-CD3 14 20 Pacific blue et l'anticorps anti-CD56 A PC sur de la glace pendant 20 minutes. Une fois les cellules marquées, ajoutez 200 microlitres de tampon d'écoulement dans chaque puits et centrifugez la plaque à 400 ×g pendant cinq minutes. Avec le frein activé à 22 degrés Celsius, aspirez soigneusement le tampon d'écoulement de chaque puits.À l’aide d’une pipette aspirante de deux millilitres équipée d’une pointe de micropipette de 200 microlitres, sans perturber le culot, laver à nouveau les cellules, puis resuspendre les culots dans 200 microlitres de paraformaldéhyde à 1 % dans du PBS sans calcium ni magnésium. Enfin, transférer les suspensions cellulaires dans des tubes à flux et porter le volume total dans les tubes à 300 microlitres en ajoutant environ 100 microlitres de paraformaldéhyde à 1 % dans du PBS sans calcium ni magnésium à chacun. Ensuite, lire deux fois 10 à la puissance quatre événements de cellules NK par cytométrie en flux à l’aide du logiciel FACSDiva et analyser les données à l’aide du logiciel FlowJo. Étiqueter des cellules cibles T infectées par le VIH V1 et non infectées, purifiées, avec 125 microcuries de chrome 51 dans du sérum physiologique par 10 à la puissance six cellules pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un tube conique de 15 millilitres comme témoin positif, et marquer également 10 à la puissance six cellules K562 avec 100 microcuries de chrome 51 pendant deux heures.Dans les mêmes conditions de culture. Utilisez le RPMI complet pour ajuster le volume final de la solution de marquage pour chaque population cellulaire à 500 microlitres. Le volume de chrome 51 ajouté aux cellules cibles est calculé à l’aide du calculateur universel de désintégration radioactive disponible sur le site web de PerkinElmer, pendant que les cellules cibles sont marquées.Retirer les cellules NK précédemment isolées de la culture et les compter ; centrifuger les cellules NK à 300 ×g pendant 10 minutes avec freinage activé, puis resuspendre les culots dans du RPMI complet. Répartir les suspensions cellulaires obtenues dans trois tubes coniques de 15 millilitres. Ajuster la densité cellulaire à 10⁵ par millilitre dans le premier tube, à 2,5 × 10⁵ par millilitre dans le second tube, et à 5 × 10⁵ par millilitre dans le troisième tube. Dans ce dernier tube, les cellules NK seront utilisées comme cellules effectrices à des rapports respectifs de 1:1, 2,5:1 et 5:1 dans le test de libération de chrome 51.Retirer les cellules cibles maintenant marquées de l’incubateur et ajouter 4,5 millilitres de RPMI complet à chaque tube. Centrifuger les tubes à 300 ×g pendant 10 minutes. Ensuite, verser soigneusement le surnageant dans un récipient destiné aux déchets liquides radioactifs sans perturber le culot.Laver les cellules cibles deux fois supplémentaires afin d'éliminer tout le chrome 51 non absorbé. Le surnageant du troisième lavage peut être éliminé dans un contenant destiné aux déchets liquides non radioactifs. Resuspendre ensuite les cellules cibles dans du RPMI complet jusqu'à une densité finale de 105 par millilitre, comme illustré dans cet exemple de montage typique pour un dosage de libération de chrome 51.Remarquez que chaque groupe est effectué en aliquots triplicatés : introduisez 100 microlitres d'éléments marqués dans chacun des puits indiqués d'une plaque 96 puits à fond en V, pour un nombre final de cellules cibles de 10 puissance 4 par puit. Ensuite, ajoutez 100 microlitres des suspensions de cellules NK aux cellules cibles, selon les rapports indiqués entre cellules effectrices et cellules cibles. Puis ajoutez 100 microlitres de cellules cibles dans les puits correspondants où les cellules effectrices sont absentes, pour les groupes de libération maximale et spontanée.Supplémentez le groupe de libération spontanée avec 100 microlitres supplémentaires de RPMI complet, centrifugez la plaque à 20 G pendant deux minutes avec le frein activé, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures. Après l'incubation de quatre heures, ajoutez cinq microlitres d'une dilution au 1/10 de globules rouges humains dans du RPMI complet dans chaque puits, à l'exception des puits de libération maximale, puis ajoutez 100 microlitres de sulfate de sodium ESAL à 10 % dans les puits de libération maximale et centrifugez la plaque à 400 G pendant cinq minutes. Pour recueillir les cellules, étiquetez un tube de compteur gamma pour chacun des puits expérimentaux et témoins.Dans la plaque 96 puits, prélevez 100 microlitres de surnageant exempt de cellules de chaque puits et transférez le surnageant de chaque puits dans des tubes prédosés. Mesurez la quantité de chrome 51 dans chaque tube à l’aide d’un compteur gamma automatique PerkinElmer 24 70. Les diagrammes de dispersion suivants illustrent une stratégie typique de sélection en cytométrie en flux pour analyser les résultats d’un CD 1 0 7.Un test de dégranulation. Tout d'abord, les cellules individuelles sont sélectionnées en excluant les agrégats ou doublests sur un graphique de FSCA en fonction de FSCH. Ensuite, la population de cellules individuelles, représentée sur un graphique de FSCA en fonction de SSC, est sélectionnée dans la population des lymphocytes, indiquée à nouveau par le contour rose.La porte des lymphocytes est ensuite tracée en fonction de CD 3 14 20 par rapport à CD 56, en ciblant la population CD 56 positive et CD 3 14 20 négative, comme indiqué par l'ovale rose vertical. Ici, les NK GA sont tracés en fonction de CD 1 0 7 A par rapport à CD 56 afin de visualiser les cellules NK ayant dégranulé ; dans les deux figures suivantes, des résultats représentatifs de l'évaluation de la réponse cytotoxique des cellules tueuses naturelles contre des cellules infectées par le VIH-1 sont présentés. Les cellules NK ont été évaluées quant à leur capacité de dégranulation en l'absence de cibles et en réponse aux cellules K 5 62, aux lymphocytes T primaires CD 4 positifs et aux lymphocytes T primaires infectés par le VIH, selon le pourcentage de cellules NK exprimant la surface CD 1 0 7 A. Les nombres dans chaque quadrant représentent le pourcentage de cellules NK totales dans cette figure.Les cellules NK ont été évaluées quant à leur capacité à lyser les cellules K562, les cellules T CD4-positives non infectées et les cellules T infectées par le VIH-1 dans un test de libération de chrome 51, selon des rapports cellules effectrices sur cellules cibles de 2,5:1, 5:1 et 7,5:1 après leur développement. Cette technique a permis d'ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du VIH-1 afin d'explorer comment les cellules tueuses naturelles réagissent aux cellules infectées par le VIH-1 chez les patients infectés par le VIH.

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette expérience visualisé est un guide pour utiliser un clone moléculaire fluorescent du VIH pour vivre des expériences d'imagerie confocale.

Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

Plusieurs 2'-fluoro aptamères d'ARN contre le VIH-1BA-L gp120 avec nanomole affinité sont isolées à partir d'une bibliothèque d'ARN...

Développement d&#39;un type de cellule spécifique anti-VIH gp120 aptamères pour la livraison de siRNA

Cette vidéo montre la réalisation d’un test de libération de lactate déshydrogénase pour déterminer la cytotoxicité des cellules tueuses naturelles (NK) par rapport aux cellules cancéreuses cibles. Le test quantifie la libération de l’enzyme cytoplasmique lactate déshydrogénase par les cellules cancéreuses en mesurant l’absorbance du produit de couleur rouge formé.

Un test in vitro pour évaluer la cytotoxicité des cellules tueuses naturelles contre les cellules cancéreuses

CD4+ Les lymphocytes T régulateurs sont de puissants immunomodulateurs et remplissent des fonctions importantes dans l’homéostasie immunitaire. La rareté de ces cellules dans le sang périphérique rend les études fonctionnelles difficiles, en particulier dans le contexte de l’infection par le VIH-1. Nous décrivons ici une méthode permettant d’isoler et d’étendre les Tregs CD4+ fonctionnels à partir du sang périphérique d’individus infectés par le VIH-1.

De nouveaux outils pour multiplier des cellules T régulatrices de personnes VIH-1-infected

Nous avons développé un test in vitro pour étudier le rôle des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH.

Essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

Contrairement aux particules du VIH-1 sans cellules, les cellules T CD4 + infectées sont effectivement détectés par des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC). Ce manuscrit décrit une méthode où les cellules périphériques mononucléaires du sang (PBMC) ou des pDC isolées sont co-cultivées avec le VIH-1 des cellules T infectées par détection d'évaluer innée par les pDC évaluée par la libération de l'IFN de type I.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

L’objectif de cette étude était de formuler des technologies permettant la transduction réussie de gène dans les cellules primaires de le natural killer (NK). L’induite par le dextran de transduction des gènes de l’homme ou les résultats de cellules NK primaires de souris à une efficacité accrue les expression de gène. Cette méthode de transduction gène améliorera la manipulation génétique de cellules NK.

Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines

Une méthode axée sur la cytométrie de flux pour déterminer quantitativement l’activité cytotoxique des humains les cellules tueuses naturelles est montrée ici.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Une méthode simple permettant d’obtenir des clones NK et des lymphocytes T chez des patients CAEBV a été développée avec rendement élevé, une petite quantité de sang périphérique et une faible dose d’il-2.

Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

Nous décrivons ici un essai de tuerie in vivo basé sur la cytométrie en flux qui permet l’examen de l’immunodominance dans les réponses cytotoxiques des lymphocytes T (CTL) à un antigène tumoral modèle. Nous fournissons des exemples de la façon dont ce dosage élégant peut être utilisé pour les études mécanistes et pour les tests d’efficacité des médicaments.

Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

Nous décrivons ici certaines méthodes établies pour déterminer le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en mettant l’accent sur l’infection par le VIH-1. Cet article décrit également un ensemble de protocoles pour étudier l’effet du stress du RE/UPR sur la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion.

Mesure du stress du réticulum endoplasmique et de la réponse protéique dépliée dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1 et analyse de son rôle dans la réplication du VIH-1

Apprenez à évaluer la réponse cytotoxique des cellules NK contre les cellules T CD4+ infectées par le VIH-1. Cette méthode utilise l'analyse cytométrique et le test de libération au chrome pour étudier les interactions récepteur-ligand.

Préparation et utilisation de VIH-1 primaires CD4 + T-cellules comme cellules cibles dans des cellules tueuses naturelles Tests cytotoxiques (Vidéo) | JoVE Journal

Préparation et utilisation de VIH-1 primaires CD4 + T-cellules comme cellules cibles dans des cellules tueuses naturelles Tests cytotoxiques

Explorer plus de vidéos