Thermodynamique du repliement des protéines membranaires mesuré par fluorescence Spectroscopie

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer la thermodynamique associée au repliement des protéines membranaires. Cela est réalisé en assemblant d'abord de petites vésicules LAR afin de fournir un environnement propice au repliement de la protéine membranaire. Une fois construites, les vésicules sont utilisées pour préparer des échantillons contenant la protéine et des concentrations systématiquement variables d'urée.

Ensuite, le spectre de fluorescence du tryptophane de chaque échantillon est mesuré afin de recueillir les données nécessaires à la génération d'une courbe de dénaturation des protéines membranaires. Les résultats obtenus montrent comment l'énergie libre de Gibbs de la dénaturation des protéines membranaires peut être déterminée à partir de courbes de dénaturation générées à partir des spectres de fluorescence du tryptophane. Bonjour, je m'appelle Judy Kim. Je suis professeure adjointe à l'Université de Californie à San Diego.

La méthode que vous êtes sur le point de regarder met en évidence une propriété importante des protéines membranaires. Plus précisément, nous allons vous montrer comment mesurer la stabilité d'une protéine repliée et insérée dans une bicouche lipidique. Je m'appelle Diana Ottinger, et je suis étudiante diplômée au Département de chimie de l'université de Californie à San Diego.

Aujourd'hui, nous allons démontrer cette méthode sur une protéine membranaire représentative. Toutefois, cette technique est générale et peut être appliquée à d'autres systèmes biologiques, comme les peptides associés aux membranes et les protéines solubles. Commençons donc.

Avant le début de ce protocole, acheter une solution d’un deux DME huile, SN glycérol, trois phosphocholine ou DMPC, lipide dans le chloroforme et Eloqua dans des vials en verre propres. En quantités de 20 milligrammes par vial, ajouter une couche de gaz azote dans chaque vial afin d’éviter l’oxydation du lipide et sceller les vials. Un seul vial contenant 20 milligrammes de lipide dans le chloroforme est utilisé pour chaque expérience.

Pour préparer la solution mère de vésicules, commencez par sécher le contenu du flacon sous un courant d'azote gazeux pendant une heure, à l'aide d'un septum en téflon et d'aiguilles, jusqu'à disparition complète du solvant. Ajoutez un millilitre de tampon phosphate de potassium 20 millimolaire, pH 7,3, aux lipides séchés et remettez en suspension environ 30 secondes dans un bain d'eau. Transférez la suspension trouble obtenue dans un tube en plastique de 15 millilitres à fond conique à l’aide d’une pipette.

Ajouter un millilitre supplémentaire de tampon phosphate dans l'ampoule en verre vide qui contenait initialement le lipide, puis répéter la sonication. Ajouter la suspension obtenue dans le même tube de 15 millilitres. Répéter ce processus un total de quatre fois afin d'obtenir un volume final de quatre millilitres et une concentration en lipide de cinq milligrammes par millilitre.

Placer la suspension de vésicules lipidiques dans un bain-marie chaud et soniquer à l’aide d’une microsonde ultrasonique pendant une heure à un cycle de travail de 50 %. Le bain-marie empêche la solution lipidique de devenir trop chaude et maintient la température de la solution aqueuse de lipides au-dessus de la température de transition de phase de la bicouche.

Filtrer la solution SONICÉE à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micron afin d’éliminer les débris provenant de la pointe du sonicateur, puis laisser la solution filtrée équilibrer toute la nuit à 37 degrés Celsius. Pour préparer l’échantillon en vue du dépliage initial par fluorescence, préparer une solution mère d’urée à 10 M dans un tampon phosphate à 20 millimolaire et une solution mère de tampon phosphate à 20 millimolaire. Selon le protocole écrit, la concentration en urée doit être déterminée expérimentalement en mesurant l’indice de réfraction à l’aide d’un réfractomètre et en le comparant à des valeurs connues.

Ensuite, préparez une solution mère de protéine dénaturée à une concentration d'environ 200 micromolaire de protéine dans de l'urée huit molaire, tampon phosphate 20 millimolaire. Dans cette vidéo, la protéine membranaire OPA A est utilisée pour illustrer le protocole ; les échantillons pour les études fluorescentes sont préparés en combinant des volumes appropriés de la solution mère de protéine, de la solution mère de lipide, de la solution mère d'urée 10 molaire et du tampon phosphate pour obtenir des échantillons contenant environ quatre micromolaires de protéine, un milligramme par millilitre de lipide et de zéro à huit molaire d'urée par incréments d'un molaire, ce qui donne un volume total de 200 microlitres. Les échantillons témoins sont préparés de la même manière.

Toutefois, quatre microlitres de solution d'urée huit molaire remplacent la protéine. Ces témoins sont préparés afin de soustraire la diffusion et les signaux de fond présents dans les spectres de fluorescence de la protéine. Incuber les échantillons de protéine avec les témoins à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures avant la mesure des spectres de fluorescence.

Pour garantir un repliement complet, allumez le fluorimètre une heure avant les mesures. Les protéines membranaires se replient généralement dans des lipides synthétiques uniquement lorsque la température est supérieure à la température de transition de phase de la bicouche. Par conséquent, dans le cas du DMPC, la température du porte-échantillon dans le fluorimètre est réglée à 30 degrés Celsius.

Installez l'expérience de fluorescence sur un fluorimètre en régime permanent et mesurez la fluorescence du tryptophane de chaque échantillon à blanc. La longueur d'onde d'excitation doit être réglée à 290 nanomètres afin d'éviter l'excitation des résidus de tyrosine, et l'émission doit être collectée entre 305 et 500 nanomètres. Utilisez une largeur de bande d'entrée et de sortie de trois nanomètres.

L'incrémentation en longueur d'onde et le temps d'intégration peuvent être optimisés pour améliorer le rapport signal sur bruit. Les valeurs typiques d'incrémentation en longueur d'onde et de temps d'intégration sont respectivement d'un nanomètre par pas et de 0,5 seconde par pas. Prélevez 200 microlitres de l'échantillon à l'aide d'une pipette et déposez-les dans une cuvette en silice fondue de microvolume Q Vet d'une capacité de 160 microlitres, puis insérez la qve dans le support de qve de l'appareil.

Enfin, les mesures de fluorescence peuvent commencer : chargez une feuille de données XY des spectres de fluorescence dans un logiciel tel qu'Igor Pro, MATLAB Origin ou Excel. Pour cette démonstration, Igor Pro sera utilisé afin de soustraire le fond provenant de l'urée et des vésicules lipidiques, de multiplier le spectre de fluorescence de l'échantillon témoin par le facteur d'échelle S, puis de soustraire ce résultat du spectre de fluorescence brut de la solution protéine-lipide. À la concentration d'urée correspondante, dressez un tableau indiquant la longueur d'onde de fluorescence maximale, ou lambda max, extraite du spectre corrigé.

Pour chaque concentration d'urée. Une valeur typique pour une protéine membranaire complètement dénaturée est de 350 nanomètres, tandis que celle d'une protéine repliée est d'environ 330 nanomètres. Traduisez les longueurs d'onde tabulées en fraction dénaturée en convertissant l'intervalle des valeurs de lambda max en un intervalle compris entre zéro et un, en corrélant la valeur de lambda max à la fraction de la population dénaturée.

Ensuite, tracer la fraction de protéine dépliée en fonction de la concentration de l'urée. Le tracé de la fraction dépliée F en fonction de la concentration d'urée C peut être ajusté à une équation qui suppose que la protéine peut exister soit à l'état replié, soit à l'état déplié. Le coefficient M correspond à la variation de l'énergie libre par rapport au dénaturant et à la concentration, et CM correspond à la concentration d'urée au point médian où la population repliée égale la population dépliée.

R est la constante de la loi des gaz, et T est la température en kelvin. La procédure d'ajustement fournit les valeurs des coefficients m et cm.

Ces coefficients sont multipliés afin de déterminer le delta G, l'énergie libre de Gibbs de dépliage en l'absence d'urée. La courbe de dépliage décrite révèle la gamme de concentrations d'urée qui provoque le changement le plus important dans le lambda max. Cette gamme est généralement étroite et la majeure partie du dépliage se produit dans cette plage restreinte afin de déterminer précisément l'énergie libre de dépliage.

Des échantillons supplémentaires doivent être analysés dans cette région afin d'obtenir un graphique contenant le grand nombre de points de données nécessaires à un ajustement optimal par la méthode des moindres carrés. Par exemple, si la protéine se dénature entre deux et quatre molarités d'urée, des échantillons peuvent être préparés entre ces concentrations d'urée par incréments de 0,2 molaire pour révéler plus précisément la forme de cette région importante de la courbe de dénaturation. Un témoin doit être inclus au moins tous les 0,5 molaire et tous les 0,2 molaire pour de meilleurs résultats.

L'énergie libre de dépliage obtenue à partir de ce tracé peut différer légèrement de celle obtenue à partir de la courbe de dépliage initiale, mais reflète une valeur plus précise. Voici les spectres de fluorescence de tryptophane d'une protéine membranaire représentative om a contenant un unique résidu de tryptophane. Le spectre de fluorescence brut du témoin est soustrait des spectres de fluorescence bruts de la protéine, comme décrit dans le protocole, ce qui donne le spectre corrigé.

Les spectres fluorescents corrigés du tryptophane pour la protéine membranaire, obtenus à différentes concentrations d'urée selon les méthodes décrites, sont présentés ici. Dans cette démonstration, une courbe de dénaturation a été générée en supposant que la protéine est soit repliée, soit dépliée, et qu'aucun état intermédiaire stable n'existe. Le paramètre M reflète la quantité de polypeptide exposée au solvant lors du dépliage, tandis que CM est une valeur importante qui décrit la dénaturation et la concentration nécessaire pour obtenir une population égale de molécules repliées et dépliées.

De fortes valeurs de CM et de M indiquent une protéine stable. L'énergie libre de Gibbs de dépliage a été calculée à 6,2 kilocalories par mole pour OPA a suite à cette procédure. D'autres méthodes de dépliage, telles que la chaleur, le pH et d'autres agents chimiques dénaturants, peuvent être utilisées pour obtenir des informations analogues sur la thermodynamique du repliement des protéines.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer la stabilité d'une protéine en vous appuyant sur les différentes propriétés de fluorescence des états repliés et dépliés. Alternativement, vous pourriez également tracer une courbe de dépliage en utilisant d'autres méthodes telles que la dichroïsme circulaire, l'absorbance, à condition que la méthode fournisse des informations sur la conformation de la protéine, quelle que soit l'outil analytique choisi. La méthode des courbes de dépliage est polyvalente et peut être appliquée à un large éventail de protéines membranaires et solubles.