Name: Thermodynamique du repliement des protéines membranaires mesuré par fluorescence Spectroscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Découvrez comment mesurer la thermodynamique du repliement des protéines membranaires par spectroscopie de fluorescence du tryptophane. Cette méthode utilise des vésicules LAR pour étudier l'énergie libre de Gibbs.

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Nous remercions Pékin Wu pour l&#39;utilisation de ses données. Ce travail a été soutenu par une bourse de carrière NSF JEK

1. Préparation de ~ 50 nm de diamètre de petites vésicules unilamellaires (SUV) pour Folding des protéines membranaires <ol><li> Une solution de 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) lipides dans le chloroforme est acheté et aliquotes dans des flacons en verre propre dans 20 mg par flacon pour le stockage de quantités. Une couche de gaz d'azote est ajouté à chaque flacon pour éviter l'oxydation des lipides, et les flacons sont scellés avec des bouchons et de parafilm. Les flacons sont conservés dans un congélateur à -20 ° C jusqu'à utilisation. </li><li> Une seule fiole qui contient une aliquote de 20 mg de lipides dans le chloroforme est utilisé pour chaque expérience. Le contenu du flacon sont séchés en utilisant un flux d'azote gazeux pendant 1 heure jusqu'à ce qu'il ne reste solvable. </li><li> Lipides séchés sont remis en suspension dans 1 ml de tampon phosphate 20 mM de potassium (pH = 7,3) en utilisant un sonicateur bain-marie pendant environ 30 secondes. Cette solution de lipides en suspension apparaîtra nuageux, et est transféré à un plastique de 15 ml tube avec un fond conique. Une autre aliquote de 1 ml de tampon phosphate est ajouté à la fiole de verre vide qui contenait à l'origine des lipides, et sonication est répété, la solution est ensuite ajoutée à la même durée de 15 ml tube. Ce processus est répété un total de 4 fois jusqu'à ce que le volume final dans le tube est de 4 ml, ce qui entraîne une concentration lipidique de 5 mg / ml de cette solution de vésicules stock. </li><li> Le volume 4 ml de solution de vésicules lipidiques est placé dans un endroit chaud (~ 30 ° C), bain d'eau, et soniquées utilisant une micropointe ultrasonicator pendant 1 heure à 50% de cycle. Le but de l'eau du bain est double. D'abord, il empêche la solution lipidique de devenir trop chaud en raison du processus de sonication. Deuxièmement, le bain chaud assure que la température de la solution aqueuse de lipides demeure au-dessus de la température de transition de phase bicouche pendant la sonication; pour DMPC, cette température de transition est ~ 23 ° C. </li><li> La solution soniquée est passé à travers une seringue de 0,22 um de filtre pour enlever les débris de la pointe sonicateur, et cette solution filtrée est équilibré nuit à 37 ° C. </li></ol> 2. Préparation des échantillons pour la formation initiale Curve Dépliage fluorescence <ol><li> Une solution mère de 10 M d'urée dans un tampon phosphate 20 mM (à pH 7,3) est faite. Il est essentiel que l'eau soit ajoutée à la matière solide (et non vice-versa), car la grande quantité d'urée occupe un volume significatif dans la solution. Cette solution d'urée peut être fait par l'ajout de solutés à un nettoyage, bouteille vide et en ajoutant de l'eau jusqu'au volume final prévu. Cette solution peut exiger le réchauffement dans un bain d'eau ou sur une plaque chauffante avec agitation pour dissoudre le soluté. L'urée est hygroscopique et par conséquent, la concentration réelle de la solution stock d'urée devrait être déterminée en utilisant l'indice de réfraction 1. </li><li> Une solution stock tampon de 20 mM de phosphate (pH 7,3) est faite. </li><li> Une solution stock de déplié protéine est préparée. Cette solution de protéines stock doit avoir une concentration de protéine de ~ 200 pM en urée 8 M, 20 mM de tampon phosphate. </li><li> Les échantillons pour les études de fluorescence sont préparés de la manière suivante. Des volumes appropriés de protéines d'actions (article 2.3), solution lipidique des stocks (5 mg / ml de lipides, section 1), une solution d'urée stock 10 M (section 2.1), et un tampon phosphate de stock (article 2.2) sont combinés pour faire des échantillons contenant ~ 4 protéines uM, 1 mg / ml de lipides, et de 0 à 8 M d'urée par incréments de 1 M. Le volume total de chaque échantillon est de 200 mL. Un tableur par exemple (tableau 1) est inclus que les volumes de listes qui doivent utiliser une solution 200 uM stocks de protéines. </li><li> Échantillons de contrôle sont réalisés comme décrit dans la section 2.4, cependant, les protéines ne sont pas ajoutées. En lieu et place de protéines, 4 pi d'une solution d'urée 8 M peuvent être ajoutées afin concentrations des autres composants sont identiques à celles de la section 2.4. Ces espaces sont utilisés pour soustraire de diffusion et un signal de fond qui apparaît dans d'autres les spectres de fluorescence de la protéine. </li><li> Des échantillons provenant des sections 2.4 et 2.5 sont autorisés à incuber à 37 ° C pendant au moins 2 heures avant la mesure de spectres de fluorescence pour assurer pliage complet et d'équilibration. </li></ol> 3. Mesure des spectres de fluorescence Fluorescence de tryptophane de chaque échantillon et blanc est mesuré en utilisant un fluorimètre état stable. Les spectres de fluorescence doit être enregistré avec longueur d'onde d'excitation de 290 nm pour éviter l'excitation des résidus tyrosine, et numérisé 305 à 500 nm. Entrée typique et passe-bande de sortie est de 3 nm. L'incrément de longueur d'onde et le temps d'intégration peut être optimisé pour signal-bruit. Les valeurs typiques pour incrémenter longueur d'onde et le temps d'intégration sont à 1 nm / étape et 0,5 sec / step, respectivement. Protéines membranaires en général plier en lipides synthétiques seulement lorsque la température est supérieure à la température de transition de phase bicouche. Par conséquent, dans ce cas de DMPC, la température de l'échantillon est maintenue constante à 30 ° C. Une cuvette microvolume silice fondue avec 160 microlitres est utilisé dans ces exriences. 4. Génération de la courbe initiale et dépliage Estimation de énergie libre de Gibbs dépliage des protéines membranaires <ol><li> Les spectres de fluorescence sous la forme d'un ensemble de données xy sont chargés dans des logiciels tels que Igor Pro, Matlab, origine, ou Excel. </li><li> Signal du fond des vésicules lipidiques de l'urée et doit être soustraite suivant la procédure suivante: Spectre Le spectre de fluorescence = premières de protéines dans la présence de vésicules lipidiques et de concentration spécifique de l'urée. Spectre B = spectre brut de fluorescence des échantillons à blanc correspondant qui contient des vésicules lipidiques et la concentration d'urée même que dans le spectre de A; aucune protéine est dans les échantillons à blanc. Spectre corrigé = spectre A - C * B. Spectre C est un scalaire typiquement égal à 1,0. Dans certains cas, C est inférieur ou supérieur à 1,0 en raison de problèmes de dispersion qui causent sur-ou sous-soustraction près de la région ~ 305-320 nm. </li><li> La longueur d'onde de fluorescence maximale, λ max, est totalisées à partir de spectres corrigés pour chaque concentration d'urée. Une valeur typique pour complètement dépliée protéine membranaire est de 350 nm tandis que celle de la protéine repliée est ~ 330 nm. Longueurs d'ondes tabulées sont convertis à la fraction déplié en convertissant la gamme des valeurs max λ (~ 330 à ~ 350 nm) à la gamme de 0,0 à 1,0 pour corréler la valeur λ max à la fraction de la population s'est déroulée. Par exemple, une valeur λ max de 330 nm correspond à 0,0, à 350 nm correspond à 1,0, et 340 nm correspond à 0,5 en termes de fraction dépliée. Cette fraction de protéine est alors déplié fonction de la concentration d'urée. Comme indiqué plus haut, la concentration d'urée doit être déterminée expérimentalement en mesurant l'indice de réfraction. </li><li> Nous supposons que la protéine peut exister dans deux états: pliée ou dépliée. L'intrigue de la fraction déplié, f, fonction de la concentration d'urée, C, peut être adapté à l'équation: 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="Équation 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Équation 2"> Le coefficient m correspond à la vitesse de changement de l'énergie libre par rapport à la concentration de dénaturant, et C m correspond à la concentration d'urée milieu au cours de laquelle la population est égale à la population repliée dépliée. Ces valeurs sont les variables montage obtenu à partir des moindres carrés montage par le logiciel d'analyse de données. R (0.001987 kcal / mol • K) est la loi constante des gaz et T est la température (303 K). </li><li> Les coefficients obtenus à partir de l'ajustement sont utilisés pour déterminer l'énergie libre de Gibbs (kcal / mol) de dépliage en l'absence de l'urée: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="Équation 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Équation 3"> . </li></ol> 5. Optimisé Dépliage Courbe pour une mesure plus précise de l'énergie libre de Gibbs dépliage. <ol><li> La courbe de déroulement décrit ci-dessus révèle la gamme des concentrations d'urée qui provoque le plus grand changement dans le λ max. Cette gamme est généralement faible, et la majorité de déroulement se produit dans cette gamme de petite taille. Afin de déterminer précisément l'énergie libre du déroulement, des échantillons supplémentaires sont analysés dans cette région afin d'obtenir une parcelle qui contient de nombreux points de données nécessaires pour optimiser les moindres carrés de montage. Par exemple, si la protéine se déroule entre 2 et 4 M d'urée, les échantillons peuvent être faites qui contiennent de 2 à 4 M d'urée par incréments de 0,2 M de manière plus précise révèle la forme de cette région importante dans la courbe de déploiement. Il n'est pas nécessaire de mesurer les spectres vierge à chaque concentration d'urée, il suffit de mesurer un spectre vierge tous les ~ 0,5 M étape. </li><li> L'énergie libre de dépliage obtenus à partir de ce complot peut différer légèrement de celle obtenue dans la courbe originale se déroule, mais reflète une valeur plus précise. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: <table border="1"><tbody><tr><td> Exemple </td><td> final [urée], M </td><td> protéines de stock (uL) </td><td> lipides stock (uL) </td><td> stock de 10 M d'urée (uL) </td><td> stock tampon (uL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0.16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Volume de solutions de stock nécessaire de faire des échantillons de fluorescence <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Tryptophane spectres de fluorescence de la protéine de la membrane ~ 5 uM représentant qui contient un résidu tryptophane unique. (A) des spectres de fluorescence de la protéine brute (spectre A partir de 4.2), (B) des spectres de fluorescence des premières vierges (spectre B de 4,2), (C) rectifié spectre de 4,2. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Corrigé tryptophane spectres de fluorescence de la protéine de membrane de la figure 1 pour des concentrations d'urée nombreux. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Dépliage courbe obtenue à partir des données de la figure 2, avec un ajustement de l'équation en 4.4. L'énergie libre de Gibbs est calculé conformément à la section 4.5.

<ol><li>Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShirley%2C+BA+%22Protein+Folding+and+Stability%22">Protein Folding and Stability</a>. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li>
<li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li>
<li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li>
<li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+scene+investigation%3A+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li>
<li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li>
<li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Tryptophan+Microenvironment%2C+Soluble+Domain%2C+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding%3A+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li>
</ol>

Le protocole actuel décrit la génération de courbes de déroulement associée à la membrane des protéines et des peptides qui contiennent des résidus tryptophane. Ici, il est supposé que la fluorescence du tryptophane indique si la protéine est pliée et insérée dans les vésicules lipidiques synthétiques, ou dépliée en solution. D&#39;autres hypothèses, telles que les deux état ​​de pliage et de la dépendance linéaire de l&#39;énergie libre avec la concentration de dénaturant, sont faites dans le rapport actuel;. Modificat...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>MP Biomedicals</td><td>04821527</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285</td><td></td></tr></tbody></table>

thermodynamique du repliement des protéines membranaires mesuré par fluorescence spectroscopie

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Repliement des protéines membranaires est un sujet émergent ayant une importance fondamentale et liés à la santé. L&#39;abondance des protéines membranaires dans les cellules sous-tend la nécessité d&#39;étude exhaustive sur le pliage de cette famille de protéines ubiquitaires. En outre, les progrès dans notre capacité à caractériser les maladies associées à des protéines mal repliées ont motivé d&#39;importants efforts expérimentaux et théoriques dans le domaine du repliement des protéines. Des progrès rapides dans ce domaine important est malheureusement entravée par les défis inhérents associés à des protéines membranaires et la complexité du mécanisme de pliage. Ici, nous présentons une procédure expérimentale pour mesurer les propriétés thermodynamiques de l&#39;énergie libre de Gibbs se déroule en l&#39;absence de dénaturant, Δ G ° H 2 O, pour une protéine membranaire intégrale représentant de E. coli. Ce protocole met l&#39;accent sur l&#39;application de la spectroscopie de fluorescence pour déterminer l&#39;équilibre des populations d&#39;états plié et déplié comme une fonction de la concentration de dénaturant. Considérations expérimentales pour la préparation de vésicules lipidiques synthétiques ainsi que des principales étapes de la procédure d&#39;analyse de données sont mis en surbrillance. Cette technique est polyvalente et peut être poursuivie avec différents types de dénaturant, y compris la température et le pH, ainsi que dans divers environnements de pliage des lipides et des micelles. Le protocole actuel est celui qui peut être généralisé à toute membrane ou de protéines solubles qui répond à la série de critères discutés ci-dessous.

Cet article détaille la vidéo la procédure expérimentale pour l&#39;obtention du énergie libre de Gibbs du repliement des protéines membranaires par le tryptophane de fluorescence.

Thermodynamique du repliement des protéines membranaires mesuré par fluorescence Spectroscopie

Le repliement des protéines membranaires est un sujet émergent présentant une importance tant fondamentale que sanitaire. L'abondance des protéines membranaires dans les cellules...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer la thermodynamique associée au repliement des protéines membranaires. Cela est réalisé en assemblant d'abord de petites vésicules LAR afin de fournir un environnement propice au repliement de la protéine membranaire. Une fois construites, les vésicules sont utilisées pour préparer des échantillons contenant la protéine et des concentrations systématiquement variables d'urée.Ensuite, le spectre de fluorescence du tryptophane de chaque échantillon est mesuré afin de recueillir les données nécessaires à la génération d'une courbe de dénaturation des protéines membranaires. Les résultats obtenus montrent comment l'énergie libre de Gibbs de la dénaturation des protéines membranaires peut être déterminée à partir de courbes de dénaturation générées à partir des spectres de fluorescence du tryptophane. Bonjour, je m'appelle Judy Kim. Je suis professeure adjointe à l'Université de Californie à San Diego.La méthode que vous êtes sur le point de regarder met en évidence une propriété importante des protéines membranaires. Plus précisément, nous allons vous montrer comment mesurer la stabilité d'une protéine repliée et insérée dans une bicouche lipidique. Je m'appelle Diana Ottinger, et je suis étudiante diplômée au Département de chimie de l'université de Californie à San Diego.Aujourd'hui, nous allons démontrer cette méthode sur une protéine membranaire représentative. Toutefois, cette technique est générale et peut être appliquée à d'autres systèmes biologiques, comme les peptides associés aux membranes et les protéines solubles. Commençons donc.Avant le début de ce protocole, acheter une solution d’un deux DME huile, SN glycérol, trois phosphocholine ou DMPC, lipide dans le chloroforme et Eloqua dans des vials en verre propres. En quantités de 20 milligrammes par vial, ajouter une couche de gaz azote dans chaque vial afin d’éviter l’oxydation du lipide et sceller les vials. Un seul vial contenant 20 milligrammes de lipide dans le chloroforme est utilisé pour chaque expérience.Pour préparer la solution mère de vésicules, commencez par sécher le contenu du flacon sous un courant d'azote gazeux pendant une heure, à l'aide d'un septum en téflon et d'aiguilles, jusqu'à disparition complète du solvant. Ajoutez un millilitre de tampon phosphate de potassium 20 millimolaire, pH 7,3, aux lipides séchés et remettez en suspension environ 30 secondes dans un bain d'eau. Transférez la suspension trouble obtenue dans un tube en plastique de 15 millilitres à fond conique à l’aide d’une pipette. Ajouter un millilitre supplémentaire de tampon phosphate dans l'ampoule en verre vide qui contenait initialement le lipide, puis répéter la sonication. Ajouter la suspension obtenue dans le même tube de 15 millilitres. Répéter ce processus un total de quatre fois afin d'obtenir un volume final de quatre millilitres et une concentration en lipide de cinq milligrammes par millilitre.Placer la suspension de vésicules lipidiques dans un bain-marie chaud et soniquer à l’aide d’une microsonde ultrasonique pendant une heure à un cycle de travail de 50 %. Le bain-marie empêche la solution lipidique de devenir trop chaude et maintient la température de la solution aqueuse de lipides au-dessus de la température de transition de phase de la bicouche.Filtrer la solution SONICÉE à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micron afin d’éliminer les débris provenant de la pointe du sonicateur, puis laisser la solution filtrée équilibrer toute la nuit à 37 degrés Celsius. Pour préparer l’échantillon en vue du dépliage initial par fluorescence, préparer une solution mère d’urée à 10 M dans un tampon phosphate à 20 millimolaire et une solution mère de tampon phosphate à 20 millimolaire. Selon le protocole écrit, la concentration en urée doit être déterminée expérimentalement en mesurant l’indice de réfraction à l’aide d’un réfractomètre et en le comparant à des valeurs connues.Ensuite, préparez une solution mère de protéine dénaturée à une concentration d'environ 200 micromolaire de protéine dans de l'urée huit molaire, tampon phosphate 20 millimolaire. Dans cette vidéo, la protéine membranaire OPA A est utilisée pour illustrer le protocole ; les échantillons pour les études fluorescentes sont préparés en combinant des volumes appropriés de la solution mère de protéine, de la solution mère de lipide, de la solution mère d'urée 10 molaire et du tampon phosphate pour obtenir des échantillons contenant environ quatre micromolaires de protéine, un milligramme par millilitre de lipide et de zéro à huit molaire d'urée par incréments d'un molaire, ce qui donne un volume total de 200 microlitres. Les échantillons témoins sont préparés de la même manière.Toutefois, quatre microlitres de solution d'urée huit molaire remplacent la protéine. Ces témoins sont préparés afin de soustraire la diffusion et les signaux de fond présents dans les spectres de fluorescence de la protéine. Incuber les échantillons de protéine avec les témoins à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures avant la mesure des spectres de fluorescence.Pour garantir un repliement complet, allumez le fluorimètre une heure avant les mesures. Les protéines membranaires se replient généralement dans des lipides synthétiques uniquement lorsque la température est supérieure à la température de transition de phase de la bicouche. Par conséquent, dans le cas du DMPC, la température du porte-échantillon dans le fluorimètre est réglée à 30 degrés Celsius.Installez l'expérience de fluorescence sur un fluorimètre en régime permanent et mesurez la fluorescence du tryptophane de chaque échantillon à blanc. La longueur d'onde d'excitation doit être réglée à 290 nanomètres afin d'éviter l'excitation des résidus de tyrosine, et l'émission doit être collectée entre 305 et 500 nanomètres. Utilisez une largeur de bande d'entrée et de sortie de trois nanomètres.L'incrémentation en longueur d'onde et le temps d'intégration peuvent être optimisés pour améliorer le rapport signal sur bruit. Les valeurs typiques d'incrémentation en longueur d'onde et de temps d'intégration sont respectivement d'un nanomètre par pas et de 0,5 seconde par pas. Prélevez 200 microlitres de l'échantillon à l'aide d'une pipette et déposez-les dans une cuvette en silice fondue de microvolume Q Vet d'une capacité de 160 microlitres, puis insérez la qve dans le support de qve de l'appareil.Enfin, les mesures de fluorescence peuvent commencer : chargez une feuille de données XY des spectres de fluorescence dans un logiciel tel qu'Igor Pro, MATLAB Origin ou Excel. Pour cette démonstration, Igor Pro sera utilisé afin de soustraire le fond provenant de l'urée et des vésicules lipidiques, de multiplier le spectre de fluorescence de l'échantillon témoin par le facteur d'échelle S, puis de soustraire ce résultat du spectre de fluorescence brut de la solution protéine-lipide. À la concentration d'urée correspondante, dressez un tableau indiquant la longueur d'onde de fluorescence maximale, ou lambda max, extraite du spectre corrigé.Pour chaque concentration d'urée. Une valeur typique pour une protéine membranaire complètement dénaturée est de 350 nanomètres, tandis que celle d'une protéine repliée est d'environ 330 nanomètres. Traduisez les longueurs d'onde tabulées en fraction dénaturée en convertissant l'intervalle des valeurs de lambda max en un intervalle compris entre zéro et un, en corrélant la valeur de lambda max à la fraction de la population dénaturée.Ensuite, tracer la fraction de protéine dépliée en fonction de la concentration de l'urée. Le tracé de la fraction dépliée F en fonction de la concentration d'urée C peut être ajusté à une équation qui suppose que la protéine peut exister soit à l'état replié, soit à l'état déplié. Le coefficient M correspond à la variation de l'énergie libre par rapport au dénaturant et à la concentration, et CM correspond à la concentration d'urée au point médian où la population repliée égale la population dépliée.R est la constante de la loi des gaz, et T est la température en kelvin. La procédure d'ajustement fournit les valeurs des coefficients m et cm.Ces coefficients sont multipliés afin de déterminer le delta G, l'énergie libre de Gibbs de dépliage en l'absence d'urée. La courbe de dépliage décrite révèle la gamme de concentrations d'urée qui provoque le changement le plus important dans le lambda max. Cette gamme est généralement étroite et la majeure partie du dépliage se produit dans cette plage restreinte afin de déterminer précisément l'énergie libre de dépliage.Des échantillons supplémentaires doivent être analysés dans cette région afin d'obtenir un graphique contenant le grand nombre de points de données nécessaires à un ajustement optimal par la méthode des moindres carrés. Par exemple, si la protéine se dénature entre deux et quatre molarités d'urée, des échantillons peuvent être préparés entre ces concentrations d'urée par incréments de 0,2 molaire pour révéler plus précisément la forme de cette région importante de la courbe de dénaturation. Un témoin doit être inclus au moins tous les 0,5 molaire et tous les 0,2 molaire pour de meilleurs résultats.L'énergie libre de dépliage obtenue à partir de ce tracé peut différer légèrement de celle obtenue à partir de la courbe de dépliage initiale, mais reflète une valeur plus précise. Voici les spectres de fluorescence de tryptophane d'une protéine membranaire représentative om a contenant un unique résidu de tryptophane. Le spectre de fluorescence brut du témoin est soustrait des spectres de fluorescence bruts de la protéine, comme décrit dans le protocole, ce qui donne le spectre corrigé.Les spectres fluorescents corrigés du tryptophane pour la protéine membranaire, obtenus à différentes concentrations d'urée selon les méthodes décrites, sont présentés ici. Dans cette démonstration, une courbe de dénaturation a été générée en supposant que la protéine est soit repliée, soit dépliée, et qu'aucun état intermédiaire stable n'existe. Le paramètre M reflète la quantité de polypeptide exposée au solvant lors du dépliage, tandis que CM est une valeur importante qui décrit la dénaturation et la concentration nécessaire pour obtenir une population égale de molécules repliées et dépliées.De fortes valeurs de CM et de M indiquent une protéine stable. L'énergie libre de Gibbs de dépliage a été calculée à 6,2 kilocalories par mole pour OPA a suite à cette procédure. D'autres méthodes de dépliage, telles que la chaleur, le pH et d'autres agents chimiques dénaturants, peuvent être utilisées pour obtenir des informations analogues sur la thermodynamique du repliement des protéines.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer la stabilité d'une protéine en vous appuyant sur les différentes propriétés de fluorescence des états repliés et dépliés. Alternativement, vous pourriez également tracer une courbe de dépliage en utilisant d'autres méthodes telles que la dichroïsme circulaire, l'absorbance, à condition que la méthode fournisse des informations sur la conformation de la protéine, quelle que soit l'outil analytique choisi. La méthode des courbes de dépliage est polyvalente et peut être appliquée à un large éventail de protéines membranaires et solubles.

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Nous allons décrire une méthode qui mesure la cinétique de transport des ions des protéines membranaires spécifiques au site aux côtés de l'analyse des changements conformationnels à l'aide de fluorescence sur des cellules individuelles. Cette technique est adaptable aux canaux ioniques, les transporteurs et les pompes ioniques et peut être utilisé pour déterminer les contraintes distance entre sous-unités protéiques.

L&#39;examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

Cette vidéo présente la technique de spectroscopie de fluctuation de fluorescence (FFS) pour étudier l’homo-oligomérisation des protéines. Les protéines marquées par fluorescence dans un échantillon sont dimérisées à l’aide d’un agent lors de l’étude de l’oligomérisation des protéines à l’aide de la FFS. À l’aide d’un microscope confocal, au fur et à mesure que les protéines entrent et sortent du petit volume d’observation, l’analyse des fluctuations de la luminosité des molécules fluorescentes...

Spectroscopie de fluctuation de fluorescence pour étudier l’homo-oligomérisation des protéines

Les étapes clés de la fonction des protéines, en particulier les changements de conformation du squelette et les réactions de transfert de protons, se déroulent souvent à l’échelle de la microseconde à la milliseconde. Ces processus dynamiques peuvent être étudiés par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à balayage pas à pas résolue en temps, en particulier pour les protéines dont la fonction est déclenchée par la lumière.

Proton transfert et la conformation des protéines photosensibles dans la dynamique des protéines par résolution temporelle étape-scan à transformée de Fourier spectroscopie infrarouge

La fluorimétrie différentielle à balayage est une méthode largement utilisée pour cribler des bibliothèques de petites molécules pour les interactions avec les protéines. Nous présentons ici une méthode simple pour étendre ces analyses afin de fournir une estimation de la constante de dissociation entre une petite molécule et son partenaire protéique.

Détermination des interactions protéine-ligand à l&#39;aide différentielle à balayage Fluorimétrie

La distribution spatiale et la dynamique temporelle des protéines et des lipides de la membrane plasmique sont un sujet brûlant en biologie. Ici, cette question est abordée par une analyse de fluctuation d’image spatio-temporelle qui fournit conceptuellement les mêmes quantités physiques de suivi de particules uniques, mais elle utilise de petits marqueurs moléculaires et des configurations de microscopie standard.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

Nous présentons un protocole pour la caractérisation rapide des biomoléculaire pliage et contraignant les interactions avec les ligands thermolabiles utilisant la calorimétrie différentielle à balayage.

Mesurer les profils biomoléculaire DSC avec des Ligands Thermolabile de caractériser rapidement pliage et reliure Interactions

Beaucoup de protéines dans la cellule détecte et induire la courbure de la membrane. Les auteurs décrivent une méthode pour extraire des nanotubes de la membrane de vésicules lipidiques pour étudier l’interaction des protéines ou de n’importe quelle molécule de courbure-active avec courbes de membranes in vitro.

Tirant des Nanotubes de la Membrane des vésicules unilamellaires géant

Ce protocole décrit une approche d’axée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation pour étudier les interactions entre protéines médiant les interactions cellule-cellule, c'est-à-dire des protéines localisées dans les jonctions cellulaires, directement dans les cellules vivantes. Nous fournissons des lignes directrices détaillées sur l’étalonnage de l’instrument, d’acquisition de données et l’analyse, y compris les corrections apportées aux sources de l’artefact possible.

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

L’amélioration de la fluorescence induite par une seule molécule résolue dans le temps est un capteur de proximité spectroscopique de fluorescence utile sensible aux changements structurels locaux dans les protéines. Ici, nous montrons qu’il peut être utilisé pour découvrir des conformations locales stables dans la α-synucléine, qui est également connue sous le nom de non structurée globulaire et instable lorsqu’elle est mesurée à l’aide de la règle FRET à plus longue portée.

Utilisation de l’amélioration de la fluorescence induite par les protéines résolues dans le temps pour identifier les conformations locales stables un α-synucléine à la fois

Le présent protocole décrit une procédure pour effectuer une chromatographie d’exclusion de taille fluorescente (FSEC) sur les protéines membranaires afin d’évaluer leur qualité pour l’analyse fonctionnelle et structurale en aval. Des résultats CSEM représentatifs recueillis pour plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dans des conditions solubilisées et sans détergent sont présentés.

Évaluation rapide de la qualité des protéines membranaires par chromatographie d’exclusion de taille fluorescente

Ici, nous présentons le protocole pour étudier la flexibilité locale et la dynamique des biomolécules en utilisant l’anisotropie de fluorescence résolue en temps au niveau de la molécule unique en mode microscopie confocale.

Anisotropie de fluorescence résolue dans le temps à partir de molécules uniques pour caractériser la flexibilité locale dans les biomolécules

Découvrez comment mesurer la thermodynamique du repliement des protéines membranaires par spectroscopie de fluorescence du tryptophane. Cette méthode utilise des vésicules LAR pour étudier l'énergie libre de Gibbs.

Thermodynamique du repliement des protéines membranaires mesuré par fluorescence Spectroscopie

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