Immunocytochimie: des cellules souches humaines

Bonjour, je m’appelle Steve. Je travaille dans le laboratoire du Dr Flanagan au département de pathologie de l’UC, Irvine. Et aujourd’hui, je vais vous montrer comment faire de l’immunochimie des cellules précurseurs neurales humaines.

Ce protocole comprend la mise en place de cellules sur des lamelles enrobées et le blocage et l’incubation de cellules dans l’anticorps primaire pendant la nuit, puis l’application de plusieurs anticorps secondaires et à température ambiante. Et enfin, le montage du couvercle se glisse sur les vols des microscopes. Commençons.

Je vais donc d’abord placer trois lamelles de verre allemand stériles de 12 millimètres de diamètre dans une plaque à 24 puits afin de les recouvrir de stratifié. Alors maintenant, j’ai mes lamelles dans la plaque, et je vais d’abord ajouter une solution de polylysine PDL, et je vais incuber les sous-couches de couverture dans PDL pendant cinq minutes à température ambiante. Alors maintenant, au bout de cinq minutes, je vais retirer le PDL et mettre de la laminine, et je vais incuber les lamelles dans du stratifié pendant au moins quatre heures ou mieux pendant la nuit.

J’ai donc incubé la plaque pendant la nuit dans du stratifié, et maintenant je vais rincer les lamelles avec du PBS et des cellules précurseurs neurales humaines que j’ai déjà comptées. Je viens donc de retirer les solutions stratifiées et maintenant je vais freiner les lamelles avec du PBS. Alors maintenant, je vais supprimer PBS et mettre la solution multimédia.

Et enfin, je suis prêt à voir les cellules. Je vais donc voir les cellules à cent mille cellules par moulin, ce qui signifie que pour une plaque de 24 puits, je vais ajouter 50 000 cellules par puits, parce que, parce que chaque puits contient un demi-millilitre. Je vais donc incliner la plaque d’un côté à l’autre pour m’assurer que les cellules s’étalent uniformément sur la surface de la lamelle.

Et maintenant, je vais les mettre dans l’incubateur pendant au moins 24 heures pour les laisser se stabiliser et se répandre pour l’immunochimie. Les cellules ont donc été en croissance pendant 24 heures et je les ai regardées et elles sont attachées et bien étalées. Alors maintenant, je vais les réparer avec une hauteur de perfor de 4 % pendant cinq minutes.

Mais d’abord, je vais retirer le média et je ne veux pas laisser les cellules se dessécher. Je vais donc retirer le support et ajouter un fixateur en même temps. C’est ce qu’on appelle une technique à deux mains.

Alors maintenant, je vais incuber les cellules dans un fixateur pendant cinq minutes à température ambiante. Cela fait donc cinq minutes. Je vais retirer le PFA et le placer dans le conteneur à déchets PFA et ajouter du PBS en même temps que j’enlève le PFA pour que les cellules ne se dessèchent pas.

Je vais donc utiliser l’une de ces pipettes d’aspiration en plastique pour remonter le PFA et je vais régler la minuterie sur cinq minutes. Donc, pendant que mes cellules sont en lavage PBS, je vais préparer une solution de visualisation de perme en utilisant Triton X 100. C’est un détergent non ionique et il est très, très visqueux.

Il est donc important d’attendre que toute la solution entre et entre dans la pipette. Je vais donc préparer une solution à 0,3 % dans PBS, je vais ajouter 10 mils de PBS. Et à ces 10 mils de PBS, je vais ajouter 30 microlitres de tri next 100.

Je vais donc ajouter 30 microlitres de tri next 100 à 10 mils de PBS. Je vais donc ajouter environ 10 secondes pour laisser toute la solution entrer dans l’embout. Donc, j’ai ici ma solution d’utilisation permanente.

Je le mets sur le rotateur pendant 10 minutes, puis je le vortex pour m’assurer que le tritton visqueux est complètement dissous. Alors maintenant, je suis prêt à faire l’étape de visualisation du perme. Et donc je vais par sages, pendant cinq minutes à température ambiante.

Cela fait donc cinq minutes. Je vais maintenant faire trois lavages PBS de cinq minutes pour m’assurer d’éliminer tout le triton. Donc, encore une fois, je vais régler l’horloge à cinq minutes.

Donc, je viens de terminer toutes mes étapes de lavage, donc je suis prêt à faire l’étape de blocage. Donc, pour l’étape de blocage, j’ai préparé une solution à 5 %BSA dans PBS. Et comme pour tous les lavages, je vais retirer le PBS et ajouter la solution de blocage en même temps.

Et l’étape de blocage va durer une heure à température ambiante. Donc, pendant que mes cellules sont en blocage, je vais préparer la plaque pour l’incubation primaire des anticorps. Je vais donc commencer par cette plaque de verre, et je vais couper un, un morceau de film para qui est à peu près de cette taille.

Et ce que je vais faire, c’est l’enrouler et j’ai besoin de ruban adhésif, donc je vais avoir besoin de quatre morceaux de ruban adhésif. Je vais donc tous les préparer. Je vais donc prendre ce morceau de film para et je vais le redresser pour que la surface soit belle et lisse.

Ensuite, je vais prendre chaque extrémité et la coller à l’arrière de la plaque de verre. Alors maintenant, je vais tirer ceci à l’autre extrémité pour m’assurer que les surfaces sont droites, et je vais coller l’autre extrémité à l’arrière. Alors maintenant, j’ai besoin d’un autre morceau de film de la même taille que le premier.

Et en gros, je vais faire la même chose. J’ai donc collé un deuxième morceau de film para par-dessus le premier, tout comme le premier, sauf que j’ai laissé une extrémité du deuxième morceau de perfil lâche parce que je vais placer la solution d’anticorps, puis des glissements de puissance sur le premier morceau. Ensuite, je vais placer le deuxième morceau par-dessus qui fait un sandwich.

Mais pour l’instant, je vais étiqueter l’endroit où je vais mettre la solution d’anticorps et couvrir. Donc, les cellules sont dans la solution de blocage depuis une heure maintenant, et je vais maintenant mettre les lamelles sur des gouttelettes d’anticorps primaires pour une incubation nocturne. Je vais donc placer une goutte de 35 microlitres d’anticorps primaire, et je vais faire très attention à ne pas expulser tout le liquide, car cela pourrait créer des bulles et les bulles pourraient interférer avec la liaison de l’anticorps à l’antigène.

Je veux donc essayer d’éviter d’avoir des bulles dans la goutte, les trois gouttes d’anticorps primaires, et je suis prêt à, pour mettre une couverture, couvrir des feuillets avec des cellules sur ces gouttes. Donc, ce que je vais faire maintenant, c’est que je vais prendre un bordereau de couverture. Je vais donc d’abord déplacer la lamelle sur le côté et essayer de la soulever doucement avec la pince à épiler ouverte.

Dès que j’ai l’impression d’avoir saisi la lamelle, je vais la fermer pour fermer lentement la pince à épiler et soulever doucement la lamelle pour la sortir du puits. Donc, les cellules sont actuellement au-dessus de la feuille de couverture. Donc, ce que je vais faire, c’est inverser et toucher doucement la goutte et la poser lentement sur la goutte sans créer de bulles.

Je vais donc répéter la même procédure avec les deuxième et troisième bordereaux de protection. Et la dernière étape consiste à placer le deuxième morceau de film para sur le dessus. Et la façon dont je vais le faire, c’est que je vais le poser d’un seul mouvement comme ça.

Je veux essayer d’éviter de bouger, de le déplacer d’un côté à l’autre. Et enfin, je vais le fixer au bas de la plaque avec un autre morceau de ruban adhésif. Et maintenant, enfin, les cellules sont prêtes à être incubées à quatre degrés pendant la nuit, et c’est la fin du premier jour de l’immunochimie.

C’est le deuxième jour de l’immunochimie, et je vais laver les lamelles en PB S3 plusieurs fois pendant cinq minutes. Ensuite, je vais incuber dans un anticorps secondaire pendant deux heures à température ambiante. Tout d’abord, je vais couper le film para comme ça pour pouvoir retirer les lamelles.

Et je vais soulever lentement la partie supérieure du film para pour que les lamelles restent sur la pièce inférieure du film para d’entretien. J’ai donc retiré le premier morceau et j’ai une plaque avec la solution de lavage PBS prête. Je vais donc soulever chaque soupe de couverture et la placer dans le puits pour, pour laver tout anticorps primaire restant qui ne s’est pas attaché à l’épitope.

Donc, pour soulever le caillout, je vais d’abord le tenir comme ça avec une lame de rasoir et essayer doucement de le ramasser. Et puisque les cellules sont, nous sommes face à la solution d’anticorps, je vais les retourner pour qu’elles soient maintenant sur le dessus et les faire glisser dans le puits pour qu’il reste toujours au-dessus. Et je vais répéter la procédure pour les fiches de courant restantes.

Et donc ils vont être lavés pendant cinq minutes. Cela fait donc cinq minutes. Je vais remplacer la solution PBS.

Je vais ajouter les crochets poinçons. Maintenant, je vais l’incuber pendant cinq minutes. L’incubation des crochets est donc terminée, et maintenant je suis prêt à monter le couvercle et à les regarder.

Donc, d’abord, je vais alk quadruple bouclier vectoriel, qui aide à garder les centimes fluorescents pour le blanchiment. Je vais, eh bien, je vais d’abord étiqueter la diapositive avec le, avec le nombre de lamelles, puis je vais placer 10 microlitres de bouclier vectoriel. Le bouclier vectoriel est, c’est une huile et c’est vraiment visqueux, donc c’est, il est également important d’attendre un peu jusqu’à ce que tout entre dans la pointe.

J’ai donc placé un écran vectoriel sur la lame de microscope, et maintenant je suis prêt à placer les lamelles de protection sur la lame de microscope. Donc, ce que je vais faire en premier, c’est que je vais prendre une lamelle et je vais rincer l’arrière de la lamelle avec de l’eau déminéralisée, car si je ne le fais pas, quand il sèche, le sel qui était dans le PBS va cristalliser et il va interférer avec les propriétés optiques des matrices fluorescentes. Je vais donc avoir mon eau déminéralisée prête.

Et donc je vais ramasser la lamelle et je vais rincer l’arrière de celle-ci avec de l’eau désionisée. Et puis je vais toucher une lingette en étain pour le sécher. Ensuite, je vais l’inverser à nouveau pour que le côté cellulaire soit inversé et descende sur la lame du microscope.

Et comme avant, je vais toucher la goutte du bouclier vectoriel et l’abaisser lentement sans piéger de bulles. Et je vais répéter la même chose, la même procédure pour, pour tous les retournements de cargaison. Et maintenant, jetons un coup d’œil.

C’est un exemple de ce que vous pourriez obtenir après avoir fait de l’immunochimie et obtenu vos photos et fait des superpositions et autres. Donc, dans cette image, c’est une image de cellules souches neurologiques de l’hippocampe isolées de dent gys chez des souris postnatales. Aujourd’hui, je vous ai montré comment faire de l’immunochimie des cellules précurseurs neurales humaines.

Et si vous le remarquez, cette technique vous permet d’économiser le réactif d’anticorps expansif. Nous avons utilisé un très petit volume d’anticorps primaires et secondaires en plaçant une petite goutte sur un perfil et en inversant la lamelle avec les cellules au-dessus. Alors continuez, faites de l’immunothérapie en chimie, et merci de me regarder.