Un β-glucuronidase (GUS) dosage basé mort cellulaire

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser un système de rapporteur Gus pour analyser les propriétés de mort potentielles de gènes spécifiques. Les gènes d’intérêt sont clonés dans une cassette Gus et cultivés dans les vecteurs d’agrobacterium appropriés sous un promoteur de 35 s. Ces vecteurs sont ensuite transformés en souche d’Agrobacterium, LBA 44 0 4, et sont mélangés à une culture contenant une cassette d’expression Gus pour s’infiltrer dans les feuilles de Nick Oceana Hamana.

L’activité des gus peut être évaluée visuellement par coloration histochimique, ou quantitativement par dosage métrique au fluor. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’échelle d’ADN ou le test tunnel est couramment utilisé dans les systèmes mammifères, mais difficile à reproduire chez les plantes, est qu’il s’agit d’un test transitoire sensible et rapide à base de plantes qui tire parti du simple fait que les cellules vivantes sont nécessaires à l’expression du gaz. Les RAO de Hua feront la démonstration de la procédure aujourd’hui.

Un associé de recherche postdoctoral dans notre laboratoire L’infiltration nécessite des feuilles saines entièrement développées de plantes de nicotiana hamana âgées de trois à six semaines cultivées à 25 degrés Celsius. Prévoyez de réaliser ce protocole sur huit jours. Le premier jour, les grilles striées avec des stocks de glycérol d’agrobacterium tumor fassan contenant les vecteurs pour l’essai de mort cellulaire et le vecteur avec la cassette d’expression Gus incluent également toujours un vecteur vide en tant que témoin négatif ou poussoir lorsque plusieurs combinaisons de cultures sont testées.

Incuber les plaques à 28 degrés Celsius pendant deux jours. Le troisième jour, inoculez deux millilitres de LB sélectif avec une seule colonie de chaque plaque. Incuber chaque culture en agitant à 28 degrés Celsius pendant 24 heures à 200 tr/min jusqu’à ce que la densité de croissance maximale soit atteinte.

Après 24 heures d’incubation, remettre complètement la culture en suspension par pipetage s’il y a des agglutinations, et augmenter le volume total de chaque culture à 10 millilitres avec des LB sélectifs frais pour induire les gènes de virulence d’Agrobacterium. Ajoutez de l’acétone à 25 micromolaires et incubez chaque culture en agitant à 28 degrés Celsius pendant 16 heures supplémentaires. L’étape suivante consiste à centrifuger chaque culture à 4 000 G pendant 10 minutes à température ambiante et Resus, suspendre la pastille dans 10 millilitres de milieu d’infiltration.

N’ajoutez pas d’acétone, centrifugez à nouveau les cultures, mais maintenant Resus. Suspendre chaque pastille dans cinq millilitres de milieu d’infiltration contenant 100 micromolaires d’acétone. Mesurez maintenant le diamètre extérieur à 600 nanomètres.

Des concentrations aussi faibles que 0,1 sont acceptables, mais si elles sont supérieures à 0,9, diluer à 0,9 avec de l’infiltration, du milieu et de l’acétone avant l’infiltration. Incuber à nouveau les cultures à 28 degrés Celsius en secouant pendant trois heures après l’incubation. Mélangez les cultures expérimentales et les cultures témoins dans un rapport de un à un avec la culture contenant la cassette Gus.

Pour chaque culture, utilisez une seringue sans aiguille d’un millilitre pour infiltrer le joint ABA ou la face inférieure des feuilles nouvellement émergentes. Le volume d’infiltration n’est pas important. Lorsqu’une zone de trempage d’eau se forme, suffisamment a été ajouté, infiltrez à la fois le contrôle négatif et le gène à doser sur les feuilles opposées de la même plante, puis infiltrez deux autres plantes de la même manière.

Il y a donc des plantes triples pour chaque culture. Trois jours après l’infiltration, il est temps de collecter les feuilles et de tester l’expression des protéines de rafale. Commencer l’analyse histochimique en infiltrant sous vide toute la feuille avec du substrat xlu jusqu’à ce qu’elle soit complètement trempée.

Maintenant, incubez les feuilles dans l’obscurité à température ambiante pendant la nuit ou jusqu’à ce qu’une coloration bleue distincte apparaisse lorsque la coloration bleue est évidente. Rincez les feuilles à l’eau distillée et incubez-les dans de l’éthanol à 70 % pendant la nuit jusqu’à ce que leur chlorophylle soit éliminée. Le lendemain, rincez les feuilles et l’eau distillée et évaluez les niveaux d’expression du GUS.

Pour quantifier l’expression de Gus, une tasse de substrat est convertie en un produit fluorescent mu, qui peut être mesuré à partir de broyage de disques de feuilles infiltrés dans un mortier à l’aide d’azote liquide. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon d’extraction GUS tout en gardant l’échantillon sur de la glace. Maintenant, centrifugez la suspension à 14 000 GS par cinq minutes à quatre degrés Celsius, et collectez le surnageant contenant les protéines solubles totales, y compris Gus.

Mesurez la concentration totale en protéines solubles à l’aide d’un NanoDrop et ajustez la concentration à 100 microgrammes de protéines totales pour chaque échantillon dans le tampon d’extraction Gus. Maintenant, ajoutez du substrat de tasse dans le tampon d’extraction Gus à chaque échantillon jusqu’à une concentration finale de deux tasses millimolaires. Un volume total de 100 microlitres par échantillon doit suffire mélangé par pipetage et incuber la réaction pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Au bout d’une heure, arrêtez la réaction en ajoutant 800 microlitres de tampon d’arrêt des rafales. Pour quantifier le mu, 100 microlitres de chaque échantillon sont chargés sur une plaque de microtitration, qui est analysée dans un lecteur de plaques, la fluorescence à 365 nanomètres, l’excitation de 455 nanomètres, les longueurs d’onde d’émission de 455 nanomètres sont mesurées et comparées à une courbe standard, l’activité de Guss peut alors être rapportée en M de mu par microgramme de protéine soluble totale par minute de réaction. Différents niveaux de rafale sont détectés en fonction de la construction utilisée lorsque la cassette d’expression GUS est co-infiltrée avec un régulateur négatif de la mort cellulaire ou un gène anti-mort.

Des niveaux élevés de rafales sont observés en comparaison. Les niveaux de gus dans le contrôle vectoriel vide sont beaucoup plus faibles. À l’inverse, lorsqu’un régulateur positif de la mort cellulaire ou un gène pro-mort est utilisé, une réduction du marché de l’expression de Gus est observée par rapport au contrôle vectoriel vide.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine environ. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que cette technique est utilisée comme une première étape pour déterminer le potentiel de gènes spécifiques. Des travaux supplémentaires doivent être effectués pour confirmer ces premiers résultats et déterminer le type de cellule concernée.