Un β-glucuronidase (GUS) dosage basé mort cellulaire

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser un système rapporteur Gus pour analyser les propriétés de mort éventuelles de gènes spécifiques. Les gènes d'intérêt sont clonés dans une cassette Gus et cultivés dans des vecteurs d'agrobactérie appropriés sous un promoteur 35 s. Ces vecteurs sont ensuite transformés dans la souche d'Agrobacterium LBA 44 0 4, puis mélangés à une culture contenant une cassette d'expression Gus afin d'infiltrer les feuilles de Nick Oceana Hamana.

L'activité Gus peut être évaluée visuellement par coloration histochimique ou de manière quantitative par le test fluorimétrique au mug. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le fractionnement de l'ADN ou le test TUNEL couramment utilisé dans les systèmes de mammifères mais difficile à reproduire chez les plantes, réside dans sa sensibilité et sa rapidité en tant que test transitoire basé sur les plantes, qui exploite le fait simple que des cellules vivantes sont nécessaires pour que l'expression du gène Gus se produise. La démonstration de la procédure aujourd'hui sera effectuée par Hua RAOs.

Un chercheur postdoctoral de notre laboratoire précise que l'infiltration nécessite des feuilles saines complètement développées de plantes de nicotiana benthamiana âgées de trois à six semaines, cultivées à 25 degrés Celsius. Prévoyez d'effectuer ce protocole sur huit jours. Le premier jour, réalisez des stries à partir de stocks glycérolés d'agrobacterium tumefaciens contenant les vecteurs pour le test de mort cellulaire et le vecteur avec la cassette d'expression Gus ; incluez toujours un vecteur vide comme témoin négatif ou vecteur témoin lorsque plusieurs combinaisons de cultures sont testées.

Incuber les boîtes à 28 degrés Celsius pendant deux jours. Le troisième jour, inoculer deux millilitres de LB sélectif avec une colonie unique provenant de chaque boîte. Incuber chaque culture sous agitation à 28 degrés Celsius pendant 24 heures à 200 tr/min jusqu'à atteinte de la densité maximale de croissance.

Après 24 heures d'incubation, redisperser complètement la culture par pipetage si des agrégats sont présents, puis augmenter le volume total de chaque culture à 10 millilitres avec du LB sélectif frais afin d'induire les gènes de virulence de l'agrobactérie. Ajouter de l'acétone à une concentration de 25 micromolaire et incuber chaque culture sous agitation à 28 degrés Celsius pendant 16 heures supplémentaires. L'étape suivante consiste à centrifuger chaque culture à 4 000 G pendant 10 minutes à température ambiante, puis à resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu d'infiltration.

Ne pas ajouter d'acétone, centrifuger à nouveau les cultures, mais maintenant resuspendre chaque culot dans cinq millilitres de milieu d'infiltration contenant 100 micromolaire d'acétone. Mesurer maintenant la DO à 600 nanomètres.

Des concentrations aussi faibles que 0,1 sont acceptables, mais si elles dépassent 0,9, alors diluez-les à 0,9 avec du milieu d'infiltration et de l'acétone avant l'infiltration. Incubez les cultures une fois de plus à 28 degrés Celsius sous agitation pendant trois heures après l'incubation. Mélangez les cultures expérimentales et les cultures témoins dans un rapport de un pour un avec la culture contenant la cassette Gus.

Pour chaque culture, utilisez une seringue de un millilitre sans aiguille pour infiltrer le scellé ABA ou la face inférieure des feuilles nouvellement émergentes. Le volume d'infiltration n'est pas important. Lorsqu'une zone de saturation aqueuse se forme, c'est que suffisamment a été ajouté ; effectuez alors l'infiltration du témoin négatif et du gène à tester sur des feuilles opposées de la même plante, puis répétez l'infiltration sur deux autres plantes de la même manière.

Ainsi, il y a trois plantes par culture. Trois jours après l'infiltration, il est temps de récolter les feuilles et de doser l'expression de la protéine gust. Commencez l'analyse histochimique en infiltrant sous vide toute la feuille avec le substrat X-Gluc jusqu'à ce qu'elle soit complètement imprégnée.

Incubez maintenant les feuilles au noir à température ambiante toute la nuit ou jusqu'à l'apparition d'une coloration bleue nette, lorsque la coloration bleue est visible. Rincez les feuilles à l'eau distillée et incubez-les dans de l'éthanol à 70 % toute la nuit jusqu'à ce que leur chlorophylle soit éliminée. Le jour suivant, rincez les feuilles à l'eau distillée et évaluez les niveaux d'expression de GUS.

Pour quantifier l'expression de Gus, un substrat mug est converti en un produit fluorescent mu, qui peut être mesuré en broyant d'abord des disques foliaires infiltrés dans un mortier à l'aide d'azote liquide. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon d'extraction GUS tout en maintenant l'échantillon sur glace. Centrifugez ensuite la suspension à 14 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis récupérez le surnageant contenant les protéines solubles totales, parmi lesquelles se trouve Gus.

Mesurez la concentration totale en protéines solubles à l’aide d’un NanoDrop et ajustez la concentration à 100 microgrammes de protéines totales pour chaque échantillon dans du tampon d’extraction Gus. Ajoutez ensuite le substrat mug dans le tampon d’extraction Gus à chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de deux millimolaire de mug. Un volume total de 100 microlitres par échantillon suffit ; mélangez par pipetage et incubez la réaction pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Après une heure, arrêter la réaction en ajoutant 800 microlitres de tampon d'arrêt gusts. Pour quantifier le mu, 100 microlitres de chaque échantillon sont chargés sur une plaque microtitration, qui est analysée en lecteur de plaque : la fluorescence est mesurée aux longueurs d'onde d'excitation de 365 nanomètres et d'émission de 455 nanomètres, puis comparée à une courbe standard. L'activité Guss peut alors être exprimée en M de mu par microgramme de protéines solubles totales par minute de réaction. Divers niveaux gust sont détectés selon le construit utilisé, lorsque la cassette d'expression GUS est co-infiltrée avec un régulateur négatif de la mort cellulaire ou un gène anti-mort.

Des niveaux élevés de Gus sont observés par comparaison. Les niveaux de Gus dans le contrôle par vecteur vide sont beaucoup plus faibles. Inversement, lorsqu'un régulateur positif de la mort cellulaire ou un gène pro-mortel est utilisé, une réduction marquée de l'expression de Gus est observée par rapport au contrôle par vecteur vide.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une semaine. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que cette technique est utilisée comme étape initiale pour déterminer le potentiel de gènes spécifiques. Des travaux supplémentaires doivent être effectués pour confirmer ces résultats préliminaires et déterminer le type de cellule impliqué.