Name: Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Découvrez l'imagerie des glycanes dans les embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et chimie click bioorthogonale. Cette méthode permet une visualisation dynamique in vivo des glycanes fucosylés.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été partiellement financé par le National Institutes of Health (GM093282 à PW; 3U54AI057158-06S1 à RDS) et les fonds de démarrage de l&#39;Albert Einstein College of Medicine.

1. Collecte d'oeufs et Dechorionation <ol><li> Recueillir et transférer les œufs de poisson zèbre à 35mm boîte de Petri, retirer autant d'eau que possible et ensuite ajouter 1 E Pronease mg / ml dans le milieu d'embryon E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) pour digérer le chorion. </li><li> Après 3-5 minutes, fusionner le plat dans un bécher rempli d'eau les poissons (60 mg "Instant Ocean" par litre distillée H 2 O), et doucement transférer les oeufs dans le bécher et permettre les œufs pour "tomber" dans l'eau. </li><li> Rincer les oeufs avec l'eau du poisson trois fois. La plupart des oeufs seront libérés de leurs chorion. </li><li> Avec une pipette en verre poli au feu Pasteur, transférer les oeufs dechorionated d'agarose revêtement des boîtes de Pétri remplie de milieu d'embryon E3. </li></ol> 2. Microinjection avec un PIB-FucAl <ol><li> Préparer les plats après l'injection du protocole rapporté 7. </li><li> Transfert des œufs dans des boîtes d'injection dechorionated remplis de milieu d'embryon E3. </li><li> Préparer l'aiguille, et de la charge avec 2 uL solution injectable. Cette solution contient 20 mM PIB FucAl synthétisé chemoenzymatically 8 et soit Fluor Alexa 594-dextrane (5% p / v) comme un traceur de chargement ou de phénol colorant rouge (0,1% p / v) dans 0,2 M de KCl. Comme témoin négatif, remplacez-le PIB FucAl avec GDP-fucose dans la solution injectable. </li><li> Casser l'aiguille et d'ajuster la pression d'injection et la durée pour obtenir une baisse de 1 nL 9. </li><li> Injecter les oeufs avec 1 nL soit solution. </li><li> Transfert des œufs dans des boîtes de Pétri d'agarose à revêtement remplis de milieu d'embryon E3. </li><li> Incuber les œufs à 28 ° C et enlever les œufs non fécondés dans les trois à quatre heures après la fécondation. </li></ol> 3. BTTES-Cu (I) réaction catalysée par click chemistry <ol><li> Lorsque les embryons atteignent désiré stades de développement (par exemple gastrula tardive, la segmentation des tissus et des larves au début), le manteau de la base d'une plaque de 96 puits avec agarose. </li><li> Ajouter 92 pl de milieu d'embryon E3 à chaque puits, suivis par l'addition de 4 ul Alexa Fluor-488 azide (à partir d'un stock de 2,5 mM dans H 2 O), 2 pl BTTES-CUSO4 06:01 complexes, et secouer doucement pour mélanger. </li><li> Transfert des embryons dans le puits contenant le réactif de chimie clic en utilisant un incendie poli pipette Pasteur en verre. Chaque puits doit contenir moins de cinq embryons. </li><li> Ajouter 2,5 ascorbate de sodium fraîchement préparé uL (à partir d'un stock de 100 mM dans H 2 O) pour amorcer la réaction 3 clic. La concentration finale de chaque réactif: Alexa Fluor-488 azoture: 100 pM; CuSO 4: 50 uM; BTTES: 300 uM; ascorbate de sodium: 2,5 mm. </li><li> Après 3 minutes, ajouter 2 bathocuproine uL sulfonate (50 mm Stock dans H 2 O), un chélateur du cuivre biocompatible, pour arrêter la réaction puis diluer immédiatement avec 100 uL moyennes E3 embryon. </li><li> Transfert des embryons à un plat en verre de Pétri et laver les embryons traités deux fois avec 15 ml d'embryon moyennes E3. </li></ol> 4. Imagerie <ol><li> Déposer une goutte de la fonte ultra agarose point (de 1,2% (p / v) dans le milieu de l'embryon E3) sur un verre plat en bas de MatTek micropuits, et le lieu d'un embryon dans la goutte d'agarose. </li><li> Position des embryons dorsalement ou latéralement et placer le plat sur la glace pendant 5 min à solidifier la chute d'agarose. Ajouter moyennes embryon E3 doucement le plat jusqu'à ce qu'il recouvre la chute d'agarose. </li><li> Des images de terrain fluorescence et lumineuses sont acquises de façon séquentielle à l'aide d'un microscope confocal. Toutes les images sont acquises embryons en utilisant un intervalle de l'étape 5 um. Chiffres composites sont préparés en utilisant le logiciel ImageJ. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs La figure 1 montre le workflow de notre stratégie d'étiquetage en deux étapes. La figure 2 montre l'étiquetage des embryons de poissons zèbres via BTTES médiée CuAAC à 9,5 heures après fécondation (HPF). BTTES est un phosphate de tris (triazolylmethyl) à base d'amines ligand. Il accélère de façon spectaculaire quand CuAAC coordination avec les in situ généré Cu (I), et favorise la réaction de cycloaddition rapidement dans les systèmes vivants, sans toxicité apparente. Immédiatement après une réaction clic de 3 minutes, nous sommes en mesure de détecter l'étiquetage robuste du PIB embryons-FucAl traitées (figure 2, les panneaux de gauche). Seule la fluorescence de fond est détecté pour le contrôle des embryons micro-injecté avec GDP-fucose (figure 2, les panneaux de droite). <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. La stratégie de l'étiquetage des glycanes fucosylé dans la couche enveloppant d'embryons de poissons zèbres. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Imagerie in vivo des glycanes fucosylé cours de l'embryogenèse zèbre via BTTES-Cu (I)-catalysée click chemistry. Une cellule embryons de poissons zèbres stade sont microinjectés avec une dose unique du PIB-FucAl et autorisés à déveop à 9,5 HPF. Les embryons sont ensuite mis à réagir avec Alexa Fluor 488 azoture-catalysée par BTTES-Cu (I). Embryons réagi sont imagées par microscopie confocale. Intensité maximale z-projection des images de fluorescence Alexa Fluor 488 (panneau supérieur); Fond clair (panneau inférieur). Barre d'échelle: 100 um. Dépannage <table border="1"><tbody><tr><td> Problème </td><td> Cause </td><td> Remède </td></tr><tr><td> Les embryons aspect maladif </td><td> La solution contient des contaminants microinjectés </td><td> La pureté des sucres nucléotides doit être supérieure à 85%. Vérifiez vos sources. </td></tr><tr><td> Il n'ya pas d'étiquetage après la réaction </td><td> La concentration en cuivre est inférieure à 30 uM </td><td> Soyez prudent de ne pas diluer la solution de réaction en ajoutant un excès moyennes embryon E3 lors de l'ajout des embryons, comme la vitesse de réaction diminue considérablement lorsque la concentration en cuivre est inférieure à 30 uM. </td></tr><tr><td> Les embryons meurent après la réaction </td><td> Une mauvaise manipulation des embryons </td><td> Assurez-vous que la pipette est polie au feu et le réacteur est recouvert d'une couche très mince de 0,5% d'agarose. </td></tr><tr><td> Les images sont inégale </td><td> Les réactifs ne sont pas correctement mélangés avant d'ajouter que les embryons </td><td> Suivez l'ordre recommandé d'addition pour les réactifs, et s'assurer que les réactifs de chimie clic ont été correctement mélangés avant d'ajouter les embryons. </td></tr><tr><td> Les images montrent les embryons sont endommagés </td><td> Agitation vigoureuse dommages des embryons lors de la réaction </td><td> Secouez doucement pour moins de 10 secondes une fois les embryons sont dans la solution. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Biomolécules Imaging<em&gt; In vivo</em&gt; Fournit des indications essentielles de leurs activités biologiques dans leurs milieux d&#39;origine. Dans cette vidéo, nous montrons comment l&#39;étiquetage des glycanes fucosylé dans la couche enveloppant des embryons de poisson zèbre est réalisée par micro-injection embryons au stade une cellule avec le PIB-FucAl et une conjugaison fluorophore deuxième étape intermédiaire BTTES médiée CuAAC biocompatible<sup&gt; 3</sup&gt;. Robuste étiquetage peut être réalisé dans les ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Pentahydrate de sulfate de cuivre (II) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 azoture </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> dextrane, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+)-L-ascorbate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic l&#39;acide </td><td> Acros Organics </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Fond de verre plat de micropuits </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et chimie cliquez bioorthogonal

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Glycanes d&#39;imagerie in vivo a été récemment activé en utilisant une stratégie chimique bioorthogonal journaliste en traitant des cellules ou organismes avec monosaccharides azide ou alcyne-marqués 1, 2. Les monosaccharides modifiés, transformés par la machinerie de biosynthèse glycane, sont incorporés dans les glycoconjugués de surface cellulaire. Les balises bioorthogonal azoture ou alcyne puis laisser conjugaison covalente avec des sondes fluorescentes pour la visualisation, ou avec des sondes d&#39;affinité pour l&#39;enrichissement et l&#39;analyse glycoproteomic. Ce protocole décrit les procédures généralement utilisées pour l&#39;imagerie non invasive des glycanes fucosylé dans embryons de poissons zèbres, notamment: 1) la microinjection d&#39;une cellule embryons au stade avec un PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) l&#39;étiquetage glycanes fucosylé dans la couche enveloppante de embryons de poissons zèbres avec l&#39;azoture de conjugué fluorophores via Cu biocompatible (I)-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC), et 3) l&#39;imagerie par microscopie confocale 3. La méthode décrite ici peut être facilement étendu pour visualiser d&#39;autres catégories de glycanes, glycanes contenant par exemple l&#39;acide sialique 4 et N-acétyl 5, 6, chez le poisson zèbre en développement et dans d&#39;autres organismes vivants.

Une méthode basée cliquez-chimie qui permet la rapidité, l&#39;étiquetage non invasive, robuste et d&#39;alcyne-taggés glycanes dans des embryons de poisson zèbre est décrite. Glycanes fucosylé dans la couche enveloppant des embryons de poisson zèbre au stade de la gastrulation tardive ont été imagées dans cette étude.

Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal

L'imagerie des glycanes in vivo a récemment été rendue possible grâce à une stratégie de rapporteur chimique bioorthogonale, consistant à traiter des cellules ou des organismes avec des dérivés d'azide ou de...

La démonstration récente de l'imagerie in vivo des glycanes utilise une stratégie de marqueur chimique bio-orthogonal consistant à traiter des cellules ou des organismes avec des monosaccharides marqués par un alcyne ou un azoture. Les monosaccharides modifiés, traités par la machinerie biosynthétique des glycanes, sont incorporés dans des glycoconjugués de surface cellulaire portant des marqueurs bio-orthogonaux, alcyne ou azoture. Ces marqueurs permettent ensuite une conjugaison covalente avec des sondes fluorescentes pour la visualisation, ou avec des sondes d'affinité pour l'enrichissement et l'analyse glycoprotéomique.Cette méthode fondée sur la chimie click permet une marquage rapide, non invasif et robuste des glycanes alkyne ou azido dans les embryons de poisson zèbre et peut être facilement étendue à la visualisation d'autres classes de glycanes dans les organismes en développement. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la détection des glycanes à l'aide de lectines ou d'anticorps, est qu'elle peut être appliquée à l'imagerie dynamique in vivo. Les méthodes d'imagerie basées sur les lectines ou les anticorps ne fournissent

imaging-glycans-zebrafish-embryos-metabolic-labeling-bioorthogonal

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous rapportons le développement d'un système automatisé pour l'imagerie et l'analyse des embryons de poisson zèbre transgénique dans des plaques multipuits. Ceci démontre la capacité de mesurer les effets dose-dépendante d'une petite molécule, la BCI, le Fibroblast Growth Factor expression du gène rapporteur et de fournir la technologie pour établir des écrans à haut débit chimiques du poisson zèbre.

Développement de l&#39;imagerie automatisée et d&#39;analyse pour les écrans chimiques du poisson zèbre.

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

Cette vidéo présente un test d’absorption d’anticorps pour imager la signalisation Notch/DeltaD chez les progéniteurs de la glie radiale du poisson-zèbre. Il s’agit de monter des embryons de poisson-zèbre déchorionnés inclus dans de l’agarose, d’injecter une solution de colorant ciblant les ligands DeltaD sur les RGP et d’imager au microscope à fluorescence pour une division cellulaire asymétrique confirmant l’activation de la signalisation Notch/DeltaD.

Un test d’absorption d’anticorps pour l’imagerie de la signalisation Notch/DeltaD chez les progéniteurs de la glie radiale du poisson-zèbre

L'embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l'embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l'observation et l'analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d'embryons de poisson zèbre.

Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

Une nouvelle technique de détection des récepteurs endogènes de faible abondance présents dans les embryons de poisson-zèbre est décrite. Nous l’avons nommé AFLIP car il consiste en un marquage par affinité du récepteur par son ligand lié à l’immunoprécipitation.

Affinity Étiquetage Détection de Endogène Receptors de Zebrafish Embryons

Ce travail décrit des méthodes pour établir des modèles hyperglycémiques aigus et chroniques dans le poisson zèbre. L'objectif est d'étudier l'impact de l'hyperglycémie sur les processus physiologiques, tels que la neurogénèse constitutive et induite par les blessures. Le travail souligne également l'utilisation du poisson zèbre pour suivre les molécules radiomarquées (ici, [ 18 F] -FDG) en utilisant PET / CT.

Les modèles aigus et chroniques de l&#39;hyperglycémie dans le poisson-zèbre: une méthode pour évaluer l&#39;impact de l&#39;hyperglycémie sur la neurogénèse et la biodisposition des molécules radiomarquées

Ici, nous proposons un protocole simple combinant l’ingénierie des oligosaccharides métaboliques, la chimie click et la microscopie à expansion qui permet la bio-imagerie des N-glycoprotéines sialylées intracellulaires avec une résolution améliorée à l’aide d’équipements de microscopie de routine.

Visualisation de la sialylation intracellulaire avec la chimie clic et la microscopie à expansion

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les protéines avec une étiquette de protéine de fluorescence chez les larves de poisson-zèbre, un système in vivo nouvellement développé et modifié particulièrement utile pour visualiser les protéines de faible abondance chez le poisson zèbre.

Marquage par fluorescence pour visualiser les protéines faiblement exprimées chez le poisson-zèbre

Nous décrivons ici une méthode pour le montage embryons de poissons zèbres à long terme d'imagerie, l'imagerie à deux photons et les tissus des dommages-techniques, et time-lapse imagerie confocale.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Découvrez l'imagerie des glycanes dans les embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et chimie click bioorthogonale. Cette méthode permet une visualisation dynamique in vivo des glycanes fucosylés.

Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal

Explorer plus de vidéos