Name: Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Découvrez l'imagerie des glycanes dans les embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et chimie click bioorthogonale. Cette méthode permet une visualisation dynamique in vivo des glycanes fucosylés.

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Ce travail a été partiellement financé par le National Institutes of Health (GM093282 à PW; 3U54AI057158-06S1 à RDS) et les fonds de démarrage de l&#39;Albert Einstein College of Medicine.

1. Collecte d'oeufs et Dechorionation <ol><li> Recueillir et transférer les œufs de poisson zèbre à 35mm boîte de Petri, retirer autant d'eau que possible et ensuite ajouter 1 E Pronease mg / ml dans le milieu d'embryon E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) pour digérer le chorion. </li><li> Après 3-5 minutes, fusionner le plat dans un bécher rempli d'eau les poissons (60 mg "Instant Ocean" par litre distillée H 2 O), et doucement transférer les oeufs dans le bécher et permettre les œufs pour "tomber" dans l'eau. </li><li> Rincer les oeufs avec l'eau du poisson trois fois. La plupart des oeufs seront libérés de leurs chorion. </li><li> Avec une pipette en verre poli au feu Pasteur, transférer les oeufs dechorionated d'agarose revêtement des boîtes de Pétri remplie de milieu d'embryon E3. </li></ol> 2. Microinjection avec un PIB-FucAl <ol><li> Préparer les plats après l'injection du protocole rapporté 7. </li><li> Transfert des œufs dans des boîtes d'injection dechorionated remplis de milieu d'embryon E3. </li><li> Préparer l'aiguille, et de la charge avec 2 uL solution injectable. Cette solution contient 20 mM PIB FucAl synthétisé chemoenzymatically 8 et soit Fluor Alexa 594-dextrane (5% p / v) comme un traceur de chargement ou de phénol colorant rouge (0,1% p / v) dans 0,2 M de KCl. Comme témoin négatif, remplacez-le PIB FucAl avec GDP-fucose dans la solution injectable. </li><li> Casser l'aiguille et d'ajuster la pression d'injection et la durée pour obtenir une baisse de 1 nL 9. </li><li> Injecter les oeufs avec 1 nL soit solution. </li><li> Transfert des œufs dans des boîtes de Pétri d'agarose à revêtement remplis de milieu d'embryon E3. </li><li> Incuber les œufs à 28 ° C et enlever les œufs non fécondés dans les trois à quatre heures après la fécondation. </li></ol> 3. BTTES-Cu (I) réaction catalysée par click chemistry <ol><li> Lorsque les embryons atteignent désiré stades de développement (par exemple gastrula tardive, la segmentation des tissus et des larves au début), le manteau de la base d'une plaque de 96 puits avec agarose. </li><li> Ajouter 92 pl de milieu d'embryon E3 à chaque puits, suivis par l'addition de 4 ul Alexa Fluor-488 azide (à partir d'un stock de 2,5 mM dans H 2 O), 2 pl BTTES-CUSO4 06:01 complexes, et secouer doucement pour mélanger. </li><li> Transfert des embryons dans le puits contenant le réactif de chimie clic en utilisant un incendie poli pipette Pasteur en verre. Chaque puits doit contenir moins de cinq embryons. </li><li> Ajouter 2,5 ascorbate de sodium fraîchement préparé uL (à partir d'un stock de 100 mM dans H 2 O) pour amorcer la réaction 3 clic. La concentration finale de chaque réactif: Alexa Fluor-488 azoture: 100 pM; CuSO 4: 50 uM; BTTES: 300 uM; ascorbate de sodium: 2,5 mm. </li><li> Après 3 minutes, ajouter 2 bathocuproine uL sulfonate (50 mm Stock dans H 2 O), un chélateur du cuivre biocompatible, pour arrêter la réaction puis diluer immédiatement avec 100 uL moyennes E3 embryon. </li><li> Transfert des embryons à un plat en verre de Pétri et laver les embryons traités deux fois avec 15 ml d'embryon moyennes E3. </li></ol> 4. Imagerie <ol><li> Déposer une goutte de la fonte ultra agarose point (de 1,2% (p / v) dans le milieu de l'embryon E3) sur un verre plat en bas de MatTek micropuits, et le lieu d'un embryon dans la goutte d'agarose. </li><li> Position des embryons dorsalement ou latéralement et placer le plat sur la glace pendant 5 min à solidifier la chute d'agarose. Ajouter moyennes embryon E3 doucement le plat jusqu'à ce qu'il recouvre la chute d'agarose. </li><li> Des images de terrain fluorescence et lumineuses sont acquises de façon séquentielle à l'aide d'un microscope confocal. Toutes les images sont acquises embryons en utilisant un intervalle de l'étape 5 um. Chiffres composites sont préparés en utilisant le logiciel ImageJ. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs La figure 1 montre le workflow de notre stratégie d'étiquetage en deux étapes. La figure 2 montre l'étiquetage des embryons de poissons zèbres via BTTES médiée CuAAC à 9,5 heures après fécondation (HPF). BTTES est un phosphate de tris (triazolylmethyl) à base d'amines ligand. Il accélère de façon spectaculaire quand CuAAC coordination avec les in situ généré Cu (I), et favorise la réaction de cycloaddition rapidement dans les systèmes vivants, sans toxicité apparente. Immédiatement après une réaction clic de 3 minutes, nous sommes en mesure de détecter l'étiquetage robuste du PIB embryons-FucAl traitées (figure 2, les panneaux de gauche). Seule la fluorescence de fond est détecté pour le contrôle des embryons micro-injecté avec GDP-fucose (figure 2, les panneaux de droite). <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. La stratégie de l'étiquetage des glycanes fucosylé dans la couche enveloppant d'embryons de poissons zèbres. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Imagerie in vivo des glycanes fucosylé cours de l'embryogenèse zèbre via BTTES-Cu (I)-catalysée click chemistry. Une cellule embryons de poissons zèbres stade sont microinjectés avec une dose unique du PIB-FucAl et autorisés à déveop à 9,5 HPF. Les embryons sont ensuite mis à réagir avec Alexa Fluor 488 azoture-catalysée par BTTES-Cu (I). Embryons réagi sont imagées par microscopie confocale. Intensité maximale z-projection des images de fluorescence Alexa Fluor 488 (panneau supérieur); Fond clair (panneau inférieur). Barre d'échelle: 100 um. Dépannage <table border="1"><tbody><tr><td> Problème </td><td> Cause </td><td> Remède </td></tr><tr><td> Les embryons aspect maladif </td><td> La solution contient des contaminants microinjectés </td><td> La pureté des sucres nucléotides doit être supérieure à 85%. Vérifiez vos sources. </td></tr><tr><td> Il n'ya pas d'étiquetage après la réaction </td><td> La concentration en cuivre est inférieure à 30 uM </td><td> Soyez prudent de ne pas diluer la solution de réaction en ajoutant un excès moyennes embryon E3 lors de l'ajout des embryons, comme la vitesse de réaction diminue considérablement lorsque la concentration en cuivre est inférieure à 30 uM. </td></tr><tr><td> Les embryons meurent après la réaction </td><td> Une mauvaise manipulation des embryons </td><td> Assurez-vous que la pipette est polie au feu et le réacteur est recouvert d'une couche très mince de 0,5% d'agarose. </td></tr><tr><td> Les images sont inégale </td><td> Les réactifs ne sont pas correctement mélangés avant d'ajouter que les embryons </td><td> Suivez l'ordre recommandé d'addition pour les réactifs, et s'assurer que les réactifs de chimie clic ont été correctement mélangés avant d'ajouter les embryons. </td></tr><tr><td> Les images montrent les embryons sont endommagés </td><td> Agitation vigoureuse dommages des embryons lors de la réaction </td><td> Secouez doucement pour moins de 10 secondes une fois les embryons sont dans la solution. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Biomolécules Imaging<em&gt; In vivo</em&gt; Fournit des indications essentielles de leurs activités biologiques dans leurs milieux d&#39;origine. Dans cette vidéo, nous montrons comment l&#39;étiquetage des glycanes fucosylé dans la couche enveloppant des embryons de poisson zèbre est réalisée par micro-injection embryons au stade une cellule avec le PIB-FucAl et une conjugaison fluorophore deuxième étape intermédiaire BTTES médiée CuAAC biocompatible<sup&gt; 3</sup&gt;. Robuste étiquetage peut être réalisé dans les ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Pentahydrate de sulfate de cuivre (II) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 azoture </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> dextrane, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+)-L-ascorbate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic l&#39;acide </td><td> Acros Organics </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Fond de verre plat de micropuits </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et chimie cliquez bioorthogonal

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Glycanes d&#39;imagerie in vivo a été récemment activé en utilisant une stratégie chimique bioorthogonal journaliste en traitant des cellules ou organismes avec monosaccharides azide ou alcyne-marqués 1, 2. Les monosaccharides modifiés, transformés par la machinerie de biosynthèse glycane, sont incorporés dans les glycoconjugués de surface cellulaire. Les balises bioorthogonal azoture ou alcyne puis laisser conjugaison covalente avec des sondes fluorescentes pour la visualisation, ou avec des sondes d&#39;affinité pour l&#39;enrichissement et l&#39;analyse glycoproteomic. Ce protocole décrit les procédures généralement utilisées pour l&#39;imagerie non invasive des glycanes fucosylé dans embryons de poissons zèbres, notamment: 1) la microinjection d&#39;une cellule embryons au stade avec un PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) l&#39;étiquetage glycanes fucosylé dans la couche enveloppante de embryons de poissons zèbres avec l&#39;azoture de conjugué fluorophores via Cu biocompatible (I)-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC), et 3) l&#39;imagerie par microscopie confocale 3. La méthode décrite ici peut être facilement étendu pour visualiser d&#39;autres catégories de glycanes, glycanes contenant par exemple l&#39;acide sialique 4 et N-acétyl 5, 6, chez le poisson zèbre en développement et dans d&#39;autres organismes vivants.

Une méthode basée cliquez-chimie qui permet la rapidité, l&#39;étiquetage non invasive, robuste et d&#39;alcyne-taggés glycanes dans des embryons de poisson zèbre est décrite. Glycanes fucosylé dans la couche enveloppant des embryons de poisson zèbre au stade de la gastrulation tardive ont été imagées dans cette étude.

Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal

L'imagerie des glycanes in vivo a récemment été rendue possible grâce à une stratégie de rapporteur chimique bioorthogonale, consistant à traiter des cellules ou des organismes avec des dérivés d'azide ou de...

La démonstration récente de l'imagerie in vivo des glycanes utilise une stratégie de marqueur chimique bio-orthogonal consistant à traiter des cellules ou des organismes avec des monosaccharides marqués par un alcyne ou un azoture. Les monosaccharides modifiés, traités par la machinerie biosynthétique des glycanes, sont incorporés dans des glycoconjugués de surface cellulaire portant des marqueurs bio-orthogonaux, alcyne ou azoture. Ces marqueurs permettent ensuite une conjugaison covalente avec des sondes fluorescentes pour la visualisation, ou avec des sondes d'affinité pour l'enrichissement et l'analyse glycoprotéomique.Cette méthode fondée sur la chimie click permet une marquage rapide, non invasif et robuste des glycanes alkyne ou azido dans les embryons de poisson zèbre et peut être facilement étendue à la visualisation d'autres classes de glycanes dans les organismes en développement. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la détection des glycanes à l'aide de lectines ou d'anticorps, est qu'elle peut être appliquée à l'imagerie dynamique in vivo. Les méthodes d'imagerie basées sur les lectines ou les anticorps ne fournissent qu'un instantané des glycanes à un moment donné.Ils sont difficiles à mettre en œuvre dans le cadre d'études dynamiques. De plus, le marquage des glycanes à l'aide de lectines ou d'anticorps nécessite la suppression des cellules ou tissus d'intérêt de leur environnement naturel et leur fixation avant analyse. En revanche, le marquage des glycanes par la stratégie du traceur chimique bioorthogonal permet de surmonter ces limitations et peut être directement appliqué à l'imagerie non invasive des glycanes dans des systèmes vivants tels que les embryons de poisson-zèbre et les embryons de *Caenorhabditis elegans*.En utilisant l'édition Azi Aine Cyclo médiée par des BTT Es, une version biocompatible de la chimie Qlik, un marquage robuste peut être obtenu en une à cinq minutes. Voici les étapes à suivre : récupérer et transférer les œufs de poisson zèbre dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Éliminer autant d'eau que possible, puis ajouter 1 milligramme par millilitre de pronase E dans le milieu embryonnaire afin de digérer le chorion ; après trois à cinq minutes, des bulles peuvent apparaître sur le chorion, puis plonger la boîte dans un bécher rempli d'eau pour poisson.Transférez délicatement les œufs dans le bécher en laissant les œufs tomber dans l'eau. Rincez abondamment les œufs avec de l'eau pour poisson afin que la majorité des œufs soient libérés de leur chorion. À l'aide d'une pipette polie à la flamme, transférez les œufs enrobés dans des boîtes de Pétri recouvertes d'agar et remplies de milieu embryonnaire E3. Remplissez les boîtes de microinjection préparées avec le milieu embryonnaire E3 et y transférer les œufs enrobés.Ensuite, préparez l'aiguille et chargez-la avec deux microlitres de solution d'injection contenant 20 millimolaire de GDP Fuk all et soit 5 % de lor, 5 94 dextrine comme traceur, soit 0,1 % de rouge de phénol comme colorant de charge dans du chlorure de potassium 0,2 molaire servant de témoin négatif. Remplacez le GDP FUCA par du GDP Fuco dans la solution d'injection. Cassez maintenant l'aiguille et réglez la pression et la durée d'injection afin d'obtenir une goutte d'un nanolitre.Ensuite, injectez les œufs avec un nanolitre de la solution. Enfin, transférez les œufs injectés dans des boîtes de Pétri revêtues d'agar et remplies de milieu embryonnaire E3, puis incubez-les à 28 degrés Celsius entre trois et quatre heures après la fécondation. Retirez les œufs non fécondés lorsque les embryons atteignent les stades de développement souhaités, tels que la segmentation tissulaire tardive de la gastrula et le stade larvaire précoce.Recouvrir la base d'une plaque de 96 puits avec des aros. Ajouter 92 microlitres de milieu pour embryons dans chaque puits, puis 4 microlitres d'azide 4 88 à partir d'une solution mère de 2,5 millimolaire dans l'eau et 2 microlitres du complexe B-T-T-E-S sulfate de cuivre six pour un à l'aide d'une pipette en verre à embout feuilleté. Transférer moins de cinq embryons dans le puits.Poursuivre en ajoutant 2,5 µL de 100 millimolaire de L-ascorbate de sodium fraîchement préparé comme réactif de chimie click. Pour initier la réaction click, laisser réagir pendant trois minutes. Ajouter ensuite 2 µL de 50 millimolaire de bathophénanthroline disulfonate, un chélateur de cuivre biocompatible, afin de stopper la réaction, puis diluer immédiatement avec 100 µL de milieu pour embryon.Transférez les embryons dans une boîte de Pétri en verre et lavez les embryons traités deux fois avec 15 millilitres de milieu pour embryons. Déposez une goutte d'agarose à point de fusion ultra bas sur une boîte de culture microscopique à fond en verre mat et transférez un embryon dans la goutte d'agarose. Positionnez l'embryon et placez la boîte sur de la glace pendant cinq minutes.Pour solidifier la goutte d'agros, ajoutez délicatement du milieu pour embryons dans la boîte jusqu'à ce qu'il recouvre l'agros. Ajoutez goutte à goutte de manière séquentielle. Acquérez des images en fluorescence et en champ clair à l'aide d'un microscope confocal par intervalles de cinq microns, puis construisez des figures composites.Utilisation de l'image. Le ligand à base d'amine J-B-T-T-E-S accélère de manière spectaculaire le cuivre a c lorsqu'il se coordonne au cuivre I généré par NC deux et favorise rapidement la réaction de cycloaddition dans les systèmes vivants, sans toxicité apparente. Ici, les embryons de poisson zèbre sont marqués par un cuivre médié par B-T-T-E-S.A un C à 9,5 heures post-fécondation, immédiatement après une réaction de « click » de trois minutes. Un marquage intense du GDPF est détecté chez tous les embryons traités, comme attendu. Seulement une fluorescence de fond est observée pour les embryons témoins micro-injectés avec le GDPF. Le marquage et l'imagerie peuvent être réalisés à tout moment entre 2,5 et 96 heures post-fécondation.Ces images sont obtenues à 24 et 48 heures après la fécondation. Pulse-chase. Cette stratégie permet de suivre la biosynthèse dynamique des glycanes saturés, dans laquelle les alcools de fuco produits à différents moments sont marqués avec des fluorophores de différentes couleurs.Cette procédure peut être combinée à des mutants génétiques ou à des techniques de suppression génétique basées sur des morphinos afin d'analyser les rôles spécifiques des enzymes individuelles de synthèse des glycanes au cours de l'embryogenèse du poisson zèbre. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la biosynthèse des glycoconjugués, elle peut également être appliquée à d'autres modifications post-traductionnelles telles que l'acylation lors de la liquéfaction.Il peut également être appliqué à l'étude des protéines nouvellement synthétisées.

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