Name: Utilisez des fluorescents Immuno-Chimie pour la détection de Edwardsiella ictaluri Dans la barbue de rivière ( I. punctatus) Des échantillons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Apprenez une méthode d'immunohistochimie indirecte pour détecter Edwardsiella ictaluri dans les tissus de poisson-chat à taches. Cette technique permet de visualiser la distribution bactérienne in situ par microscopie à fluorescence.

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Les auteurs tiennent à souligner l&#39;aide technique de Banes Michelle ainsi que le Dr Petrie-Hanson, Eels Dr et Timothy Brown pour leur aide en développement et l&#39;exécution des immunohistochimie. Ce projet a été financé par l&#39;USDA CRIS projet # MISV-0801310 et par la Mississippi State University College de Médecine Vétérinaire.

1. Challenge bactérien <ol><li> Cultivez bactéries nuit à 30 ° C en secouant le bouillon Brain Heart Infusion. </li><li> Arrêtez de circulation d'eau dans les réservoirs de poissons et ajouter le bouillon de la concentration de 1 sur 100 (10 ml par litre, par exemple). </li><li> Après une incubation d'une heure, redémarrez circulation de l'eau dans les réservoirs de débusquer les bactéries restantes. </li></ol> 2. Échantillonnage <ol><li> Les temps d'échantillonnage et des organes dépend de l'objectif de l'étude, mais dans notre étude, nous avons utilisé les points de prélèvement suivants: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 et 175 heures post-infection . </li><li> A chaque point du temps, euthanasier six poissons par immersion dans de l'eau contenant MS222 et déguster les organes suivants (sélection des organes prélevés était basée sur ce qui est connu du processus de l'infection): branchies, muscles postérieurs le long de la ligne latérale, de l'intestin, la rate, foie, estomac, coeur, rein tête, et les reins du tronc. </li><li> Après l'échantillonnage, charger immédiatement les organes dans des cassettes histologiques et les immerger pendant deux heures dans 1% de formol. </li><li> Après deux heures de fixation, le transfert des cassettes du formol à 50% d'éthanol, où ils demeurent jusqu'à incorporation. </li><li> Paraffine intégrer organes nuit à l'aide d'un processeur Tissue-Tek VIP tissus 3000 (Sakura Tek, Torrance, Californie) et l'article 5 um à l'aide d'un microtome Leica RM2255 (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois). </li></ol> 3. Sections de déparaffinage <ol><li> Immerger les sections dans une auge remplie de taches claires-rite pendant environ 5 minutes pour permettre à tous de la cire à se dissoudre. Soulevez la grille et drainer l'excès de cire solvant. </li><li> Immerger les sections dans un deuxième contenant des clairs-rite pendant 5 minutes. Après quelques utilisations, de remplacer le solvant dans le premier récipient et alternent entre les premier et second récipients. </li><li> Immerger les sections dans l'alcool à 100% pour enlever la cire solvant. </li><li> Immerger les sections dans une auge secondes d'alcool à 100%. </li><li> Immerger les sections dans un creux de 70% d'alcool. </li><li> Immerger les sections à l'eau courante pour enlever toute trace d'alcool. </li></ol> 4. Préparation de tampons <ol><li> Préparer tampon phosphate salin en dissolvant 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,15 g de Na 2 HPO 4 et 0,2 g de KH 2 PO 4 dans 1 litre d'eau distillée et le pH à 7,4. </li><li> Diluer PBS à 0.9x en ajoutant 900 ml de PBS à 100 ml d'eau distillée. </li><li> Préparer le blocage du sérum en ajoutant 2 ml de sérum de souris; 200 pi de Triton-X 100 et 500 BSA ul à 50 ml de PBS 0.9x. </li><li> Préparer 50 mM tampon bicarbonate Saline est préparée en dissolvant 2,1 g de NaHCO 3 et 4 g de NaCl dans 500 ml d'eau distillée H 2 O et titrée à pH 8,2. </li></ol> 5. Immunhistochemistry <ol><li> Réhydrater sections par immersion dans de 0.9x PBS. </li><li> Incuber les lames pendant 30 minutes dans le blocage de sérum. </li><li> Incuber sections dans ED9 (diluée au 1 100 dans le sérum de blocage) pendant deux heures dans une chambre humide, opaque, à la température ambiante. </li><li> Rincez les articles 4 fois dans du PBS pendant 10 minutes chacun. </li><li> Incuber sections pendant deux heures dans 50 ul de l'anticorps secondaire (anticorps de chèvre anti-souris FITC étiqueté; diluée 500 fois dans le blocage de sérum) dans une chambre humide, opaque, à la température ambiante. </li><li> Rincer les sections 3 fois dans du bicarbonate de solution saline tamponnée. </li><li> Rincer brièvement dans les sections de l'eau déminéralisée. </li></ol> 6. Montage <ol><li> Laisser les lames sécher dans l'obscurité pendant quelques minutes. </li><li> Le montage est effectué en utilisant permafluor. </li><li> Laisser le milieu de montage à sec, de préférence la nuit, dans un environnement sombre et frais. </li></ol> 7. Microscope <ol><li> Des coupes histologiques sont prêts à observer sous un microscope à fluorescence. Dans notre expérience, nous avons utilisé un Olympus BX51 microscope équipé d'un triplet (FITC; MCA Texas Red) filtre. Le logiciel Picture Frame (MicroFire, Goleta, Californie) a été utilisé. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: Parce que l'auto-fluorescence des tissus du poisson est si élevé, ces tissus apparaîtra orange sous le Tri-filtre, idéalement fournir un fond pour les bactéries. Dans ce contexte, l'individu FITC bactéries teinté apparaîtra aussi brillant points verts et, à leur forme 200X tige sera reconnaissable (figure 1). Bad sections peuvent constituer de faux positifs (en raison d'un problème dans la phase de rinçage), auquel cas un grand nombre de bactéries semblent être présents de manière uniforme sur la diapositive. <img src="/files/ftp_upload/2687/2687fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Micrographie d'une des sections musculaires montrant deux E. ictaluri (flèches a et b) (200x). igure 2 "/&gt; Figure 2. Diagramme d'ensemble de l'expérience

<ol><li>Plumb, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPlumb%2C+JA+%22Fish+Diseases+and+Disorders%22">Fish Diseases and Disorders</a>. Woo, P. T. K., Bruno, D. W. , CABI Publishing. New York. Vol. 3 479-479 (1998).</li>
<li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoberts%2C+RJ+%22Fish+Pathology%22">Fish Pathology</a>. , third ed, WB Saunders. (2001).</li>
<li>Lawrence, M. L. Louisiana State University. , (1997).</li>
<li>Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+35S-Labeled+Edwardsiella+ictaluri+into+Channel+Catfish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aquatic+Animal+Health%22%5BJournal%5D)">Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish.</a> Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).</li>
<li>Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+bioluminescent+Edwardsiella+ictaluri+for+noninvasive+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring.</a> FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Plumb, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+Edwardsiella+ictaluri+in+channel+catfish%2C+Ictalurus+punctatus+%28Rafinesque%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque).</a> Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).</li>
<li>Areechon, N., Plumb, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Edwardsiella+ictaluri+in+Channel+Catfish%2C+Ictalurus+punctatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+World+Mariculture+Society%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus.</a> Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).</li>
<li>Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Edwardsiella+ictaluri%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri.</a> Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).</li>
<li>Thune, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signature-Tagged+Mutagenesis+of+Edwardsiella+ictaluri+Identifies+Virulence-Related+Genes%2C+Including+a+Salmonella+Pathogenicity+Island+2+Class+of+Type+III+Secretion+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).</li>
<li>Karsi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+bioluminescence+mutant+screening+strategy+for+identification+of+bacterial+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).</li>
<li>Hook, E. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHook%2C+EW+%22Principles+and+Practices+of+Infectious+Diseases%22">Principles and Practices of Infectious Diseases</a>. Mandell, G. L., Douglas, G. Jr, Bennett, J. E. , Vol 1 1700-1700 (1990).</li>
<li>Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+monoclonal+antibodies+in+the+indirect+fluorescent+antibody+technique+%28IFA%29+for+the+diagnosis+of+Edwardsiella+ictaluri%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri.</a> Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).</li>
</ol>

Ce protocole décrit une technique pour la visualisation in situ de l&#39;silure pathogène Edwardsiella ictaluri dans les coupes histologiques. Pour le meilleur de notre connaissance, c&#39;est le premier protocole décrit par exemple. L&#39;étape la plus critique, dans notre expérience, est le rinçage de l&#39;anticorps tel que décrit dans l&#39;étape 4.4 du présent protocole comme le lavage insuffisant peut entraîner des faux positifs. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Bouillon d&#39;infusion cerveau </td><td> Becton Dickinson </td><td> 237200 </td></tr><tr><td> MS222 </td><td> Labs Argent </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de souris entier </td><td> Cappel </td><td> 55989 </td></tr><tr><td> Chèvre anti-souris FITC </td><td> Southern Biotech </td><td> 1010-1004 </td></tr><tr><td> Permafluor </td><td> Vision Lab </td><td> Ta-030-FM </td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P-4504 </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100-6X500ML </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td> Sigma </td><td> 85040C </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P-5379 </td></tr><tr><td> Bicarbonate de sodium (NaHCO 3) </td><td> Sigma </td><td> S-5761 </td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium (NaCal) </td><td> Sigma </td><td> S-9625 </td></tr><tr><td> Phosphate disodique (Na 2 HPO 4) </td><td> Sigma </td><td> S-9390 </td></tr></tbody></table>

utilisez des fluorescents immuno-chimie pour la détection de edwardsiella ictaluri dans la barbue de rivière ( i. punctatus) des échantillons

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Bien Edwardsiella ictaluri est un pathogène majeur des barbue de rivière Ictalurus punctatus et a été découvert près de trois décennies 1,2, jusqu&#39;à présent, à la connaissance de ces auteurs, aucune méthode n&#39;a été développée pour permettre la visualisation in situ de la bactéries dans les coupes histologiques. Alors que la localisation bactérienne a été déterminée in vivo dans des études précédentes utilisant un décompte plaque 3, 4 radiométrique étiquetés ou bactéries bioluminescentes 5, la plupart de ces études ont été menées uniquement au niveau des organes brut, avec une exception 6. Cette limitation est particulièrement préoccupante car E. ictaluri a un cycle d&#39;infection complexes 1,7, et il a une variété de facteurs de virulence 8,9. L&#39;interaction complexe de E. ictaluri avec son hôte est similaire à bien des égards à Salmonella typhi 10, qui est dans la même famille taxonomique. Nous décrivons ici une technique permettant la détection de bactéries à l&#39;aide indirecte d&#39;immuno-histochimie en utilisant l&#39;anticorps monoclonal ED9 d&#39;anticorps décrits par Ainsworth et al. 11. En bref, un sérum de blocage est appliqué à paraffine coupes histologiques pour empêcher les non-spécifiques Biding. Ensuite, les coupes sont incubées avec l&#39;anticorps primaire: E. ictaluri anticorps monoclonal spécifique ED9. Anticorps en excès sont rincés et les anticorps marqués FITC secondaire sont ajoutés. Après rinçage, les sections sont montées avec un milieu de montage spécifiques fluorescents. Cela a permis la détection de E. ictaluri in situ dans des coupes histologiques de tissus barbue de rivière.

Nous décrivons ici une procédure permettant à l&#39;étiquetage des<em&gt; Edwardsiella ictaluri in situ</em&gt; Dans les coupes histologiques de la barbue de rivière<em&gt; Ictalurus punctatus</em&gt; Par immunohistochimie indirecte avec des anticorps monoclonaux ED9 comme un primaire, et les lampes fluorescentes FITC anticorps marqués comme secondaire. Cela a permis la détection de la bactérie en utilisant la microscopie à fluorescence.

Utilisez des fluorescents Immuno-Chimie pour la détection de Edwardsiella ictaluri Dans la barbue de rivière ( I. punctatus) Des échantillons

Bien que l'espèce *Edwardsiella ictaluri* soit un agent pathogène majeur du poisson-chat canal *Ictalurus punctatus* et qu'elle ait été découverte il y a près de trois décennies 1,2, jusqu'à présent...

L'objectif général de cette procédure est de marquer les bactéries Edward Cella ilu et de les visualiser in situ dans des coupes de tissus de poisson-chat à l'aide de la microscopie. Cela est réalisé en premier lieu en exposant les poissons aux bactéries. Ensuite, les organes sont prélevés, inclus en paraffine, découpés en sections tissulaires et déparaffinés.Les bactéries sont ensuite marquées avec des anticorps primaires et secondaires. Enfin, elles sont visualisées par microscopie. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant la présence et la répartition des bactéries dans les tissus à l’aide de la microscopie en immunofluorescence.Bonjour, je m'appelle Simon Manto et la technique que nous allons présenter aujourd'hui a été développée dans le cadre de ma thèse de doctorat. Le principal avantage de cette technique, par comparaison par exemple à la PCR quantitative ou à la bioluminescence, est qu'elle permet d'observer les bactéries in situ dans l'organe et d'étudier leur localisation ainsi que leurs interactions avec les cellules de l'hôte. Pour infecter les poissons-chats Tlu Punc Deus avec des bactéries, commencez par faire croître Edward Cella TLU pendant une n

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