High Resolution Imaging 3D des Ex-Vivo Échantillons biologiques par Micro CT

Visualisation de volume non destructifs peuvent être atteints que par des techniques tomographiques, dont le plus efficace est la tomographie aux rayons X micro ordinateur (TAO).

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une microtomographie à rayons X 3D de tissus minéralisés et non minéralisés. Pour ce faire, on extrait d’abord les échantillons à examiner, puis on immobilise et on positionne les échantillons dans l’instrument de micro-tomodensitométrie. La troisième étape de la procédure consiste à définir les paramètres d’acquisition de chaque échantillon et à collecter les images.

En fin de compte, une image 3D de l’échantillon à haute résolution par tomodensitométrie à rayons X est obtenue. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodologies existantes, comme l’IRM, l’échographie ou la microscopie électronique, est qu’elle fournit des informations sur les volumes de tiques à une résolution d’un micron D. Cette méthode peut fournir des informations dans de nombreux tissus biologiques. Il peut également être utilisé en électronique, en sciences des matériaux et en archéologie.

La préparation est différente pour les tissus minéralisés et non minéralisés. Les tissus minéralisés doivent être scellés dans des contenants bien ajustés, de sorte que la position de l’échantillon ne change pas. Bien que des mesures à haute résolution soient effectuées, la forme du récipient variera en fonction de la morphologie du tissu.

Par exemple, un fémur de souris extrait d’un embryon de 18,5 D peut s’insérer dans la pointe d’une pipette. Commencez par sceller l’extrémité étroite d’une pointe de pipette en polystyrène avec de la colle comme de la résine époxy. Remplissez ensuite l’embout avec un tampon de travail.

Dans ce cas, PBS insère maintenant la patte avec le fémur exposé fermement dans la pointe et place la pointe de la pipette dans un support approprié et scelle l’autre extrémité avec un sacrifice de feuille de film para et perfuse l’animal comme indiqué dans le manuscrit ci-joint. Ensuite, extrayez les poumons et le cœur tachés et transférez-les dans un tube à essai préparé de 50 millilitres. Placez les organes sur une feuille de papier sèche.

Placez les échantillons dans les tubes à essai de mesure finaux au fond du tube à essai est un chiffon humide à l’éthanol. Pour créer un environnement saturé d’éthanol, l’échantillon doit être bien ajusté dans le tube. Si l’échantillon est lâche, serrez-le avec un fil et immobilisez-le près du bas du tube juste au-dessus du tissu.

Ensuite, collez ou vissez le tube dans un support de l’instrument et procédez au réglage de l’image. Paramètres d’acquisition. Commencez par placer le porte-échantillon dans l’étage de rotation de l’instrument.

Ensuite, à l’aide de valeurs choisies arbitrairement pour la tension et le courant, prenez une image radiographique. Si l’image est trop sombre. Apportez des modifications en augmentant d’abord progressivement le nombre de photons.

Cela se fait en augmentant progressivement le courant. Si l’image n’est pas devenue plus lumineuse après avoir augmenté le courant à 200 microampères, augmentez progressivement l’énergie des photons de rayons X en augmentant la tension. Si l’image est trop lumineuse, diminuez d’abord la tension, puis diminuez le courant jusqu’à ce que l’image soit satisfaisante.

Le benning peut également être utilisé pour augmenter la luminosité de l’image au détriment de la résolution. Une valeur de manche de deux rendra l’image environ quatre fois plus lumineuse à la moitié de la résolution. Après avoir réglé la luminosité optimale, optimisez le temps d’exposition de l’appareil photo pour trouver un compromis entre le meilleur contraste possible et une durée d’expérience raisonnable.

Le contraste de l’image, en particulier pour les échantillons à forte absorption, peut être amélioré en utilisant des filtres pour réduire le flux de photons de faible énergie. Maintenant, choisissez le grossissement de travail entre 0,5 x et 40 x et ajustez le champ de vision pour englober l’ensemble de l’échantillon tout en maximisant la résolution. Pour augmenter la résolution, placez la source de rayons X plus près de l’échantillon.

Pour augmenter le champ de vision, placez le détecteur plus près de l’échantillon. Pour l’imagerie 3D, l’échantillon doit s’adapter au champ de vision à n’importe quel angle de rotation, de sorte que l’axe de rotation doit être centré. Commencez par faire pivoter l’échantillon à moins 20 degrés.

Si le volume souhaité s’est déplacé latéralement, repositionnez l’axe de rotation. Poursuivez la prise d’images à d’autres rotations et continuez à apporter des corrections jusqu’à ce que l’échantillon soit entièrement visible de moins 90 à plus 90 degrés, puis procédez à la mesure à tous les angles entre moins 90 et 90 degrés. L’exécution d’un programme d’imagerie peut prendre beaucoup de temps, alors planifiez en conséquence.

Par exemple, pour imager le plus grand nombre de fémurs à un grossissement Forex avec une résolution de huit microns, il faut 1000 images de projection. Cela ne prend que trois heures. Cependant, il faut 10 heures pour collecter les 2 500 images de projection nécessaires pour visualiser les poumons de rat à un grossissement de 0,5x et une résolution de 16 microns.

Pour la comparaison d’images futures, il est nécessaire de calibrer l’image en prenant des images d’un fantôme standard fait de matériaux artificiels qui ont une absorption des rayons X semblable à celle de l’os et de l’eau dans les mêmes conditions expérimentales. Comme pour l’échantillon, après avoir enregistré toutes les images de projection, le volume entier est reconstitué. Pour calibrer l’image reconstruite aux valeurs du fantôme, utilisez l’échelle de champ des chiens ou l’échelle CT.

Par exemple, à l’amplification Forex, la valeur aqueuse dans le fantôme est fixée à zéro et la valeur semblable à l’os est fixée à 3000 à partir de cette plage. Toutes les autres valeurs sont interpolées ou extrapolées. Les images peuvent désormais être analysées à l’aide de n’importe quel logiciel capable de prendre en charge des fichiers de 20 gigaoctets, tel que le logiciel gratuit image J ou Fiji.

Ce rendu volumique montre le fémur d’une souris quatre jours après le début de la minéralisation osseuse, la fraction minéralisée calculée à 18 % et la densité minérale osseuse peut être comparée à celle des os à d’autres stades de développement. Ce rendu volumique tomographique des poumons d’un rat nu femelle de 12 semaines est résolu à 16 microns. La coloration pulmonaire est utilisée pour révéler des vaisseaux sanguins de 20 microns de diamètre.

Dans cette coupe en série, analyse des mêmes poumons. Plusieurs nodules cancéreux peuvent être vus comme des formes grises solides dans les quatre semaines suivant l’implantation de cellules tumorales. Dans ces poumons, les nodules se sont développés pour couvrir 17 % du volume pulmonaire.

La plupart de la coloration pulmonaire a été trouvée dans les zones périphériques des tumeurs. Des vaisseaux sanguins sont également présents à l’intérieur des nodules, couvrant environ 3 % de leur volume. Une fois maîtrisé, le positionnement de l’échantillon peut se faire en 15 à 20 minutes s’il est effectué correctement.

Le temps d’imagerie, y compris la reconstruction volumique automatique, qui ne nécessite généralement pas la présence d’une personne opérant le vol, dépend de l’échantillon et peut prendre jusqu’à 50 heures. N’oubliez pas que travailler avec des agents de fixation et de coloration peut être extrêmement dangereux. Portez toujours des gants de laboratoire et évitez de respirer les vapeurs des échantillons.