Détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume Bio-spec Spectrophotomètre Nano

L'objectif général de cette procédure est de déterminer avec précision et reproductibilité les concentrations d'acides nucléiques et de protéines à l'aide d'un spectrophotomètre à microvolume. Cela est réalisé en sélectionnant d'abord la longueur de trajet appropriée pour l'échantillon à mesurer. La deuxième étape de la procédure consiste à mesurer un blanc.

Ensuite, l'échantillon d'ADN ou de protéine est mesuré. La dernière étape de la procédure consiste à enregistrer les données au format PDF ou CSV. En définitive, des résultats hautement reproductibles pour l'ADN et les protéines.

La quantification peut être obtenue rapidement et avec précision par cette méthode. Le principal avantage de cette technique réside dans sa rapidité, sa précision et sa reproductibilité. Pour commencer la procédure de quantification de l'ADN, allumez le spectrophotomètre nano BIOSpec.

Ouvrez le logiciel BIOS spec nano depuis le bureau de l'ordinateur. Cliquez sur l'onglet ADN nucléique simple D-S-D-N-A. Le logiciel établira une communication avec l'instrument et exécutera une séquence d'initialisation.

Ceci permet de vérifier que l'appareil fonctionne conformément aux spécifications. Ensuite, sélectionnez la longueur de trajet. Sur le curseur de longueur de trajet.

Trois options sont disponibles pour les échantillons de volume microlitrique. On peut utiliser 0,2 millimètre ou 0,7 millimètre. Et pour les échantillons dilués, il est possible d'utiliser une longueur de trajet optique de cinq millimètres.

Dans cette démonstration, 0,7 millimètre est sélectionné pour mesurer un échantillon de deux microlitres. Tous les calculs sont basés sur la longueur de trajet optique choisie. Ensuite, dans le logiciel, cliquez sur l'onglet configuration et sélectionnez le réglage de l'essuyage automatique.

Sélectionnez-en un pour un essuyage. Avant la mesure d'un échantillon, ou à chaque fois qu'une nouvelle longueur de trajet optique est sélectionnée, une mesure du blanc est requise. Pour une longueur de trajet optique de 0,7 millimètre, déposez deux microlitres d'eau ou de tampon sur le socle. Cliquez sur « blanc » pour effectuer la mesure du blanc.

La fenêtre supérieure va se déplacer pour entrer en contact avec la goutte d'échantillon et des éclairs de xénon peuvent être observés. Lorsque la mesure est terminée, l'essuie-glace efface automatiquement l'échantillon. L'échantillon peut désormais être mesuré.

Il est important d'utiliser une solution d'échantillon homogène, car la présence de particules non dissoutes peut entraîner des données non reproductibles. Pour éviter d'introduire des bulles d'air, aspirez soigneusement deux microlitres de l'échantillon, puis déposez uniformément l'échantillon à partir de l'embout de la pipette sur le socle.

Appuyez sur le bouton de démarrage de l'appareil. Comme précédemment, la fenêtre supérieure va se déplacer pour entrer en contact avec la goutte d'échantillon, et des éclairs de xénon peuvent être observés. Pour déterminer la reproductibilité, répétez la mesure du même échantillon trois fois ; toutes les données enregistrées sont automatiquement sauvegardées sous forme d'un fichier A BUD. Pour enregistrer au format PDF ou CCSV, cliquez sur enregistrer P-D-F-C-S-V.

Les résultats peuvent également être enregistrés sous forme de fichier CSV en utilisant la sélection appropriée dans l'onglet d'enregistrement. La quantification des protéines peut être effectuée à l'aide de la méthode d'absorbance à 280 nm. Pour la quantification des protéines, sélectionnez l'onglet de quantification des protéines.

Saisissez le coefficient d'extinction epsilon 280 s'il est connu ; si epsilon 280 n'est pas connu, calculez-le à l'aide de epsilon 280 calc. Sélectionnez 0,2 millimètre sur le curseur de longueur de trajet pour mesurer un échantillon de trois microlitres. Ensuite, dans le logiciel, cliquez sur l'onglet configuration et sélectionnez le réglage d'essuyage automatique. Choisissez deux essuyages pour éviter tout transfert d'échantillon et garantir une mesure précise.

Pour mesurer un blanc, pipetez trois microlitres d'eau ou de tampon sur le socle, puis cliquez sur « blanc » pour effectuer la mesure du blanc. Ensuite, pipetez soigneusement trois microlitres d'échantillon protéique sur le socle. Sans introduire de bulles d'air, cliquez sur « démarrer » dans le logiciel ou appuyez sur le bouton de démarrage de l'appareil pour commencer la mesure de l'échantillon.

Répétez la mesure du même échantillon trois fois pour déterminer la reproductibilité indiquée. Voici les données obtenues à partir de mesures effectuées sur un échantillon typique d'ADN double brin. La formule utilisée pour calculer la concentration en ADN est la suivante : concentration de l'échantillon égale DF multiplié par la quantité d'OD à 260 nm moins OD à 320 nm fois NACF, où DF correspond au facteur de dilution de l'échantillon et NACF au facteur de concentration des acides nucléiques.

Le facteur de concentration des acides nucléiques est défini conformément à l'analyte sélectionné. La concentration d'acide nucléique calculée et le rapport OD 2 62 80 sont indiqués. Ce tableau contient les résultats des tests de reproductibilité pour la quantification de l'ADN.

Ensemble, les données montrent des résultats hautement reproductibles, comme en témoigne l'écart-type relatif faible de 0,26 %. Des résultats représentatifs d'une analyse de concentration en protéines pour l'albumine sérique bovine (BSA) sont présentés ici. La concentration en protéines exprimée en microgrammes par millilitre est basée sur la valeur d'extinction molaire à 280 nm (Epsilon 280). Enfin, ce tableau présente une analyse de reproductibilité de la quantification des protéines.

Le coefficient de variation relatif de 0,51 % indique que le BIOS spec nano mesure avec précision l'OD non seulement pour l'ADN, mais aussi pour les protéines. Une fois maîtrisé, plusieurs échantillons peuvent être analysés en une minute.