Détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume Bio-spec Spectrophotomètre Nano

L’objectif général de cette procédure est de déterminer les concentrations d’acides nucléiques et de protéines avec précision et reproductibilité à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume. Pour ce faire, il faut d’abord sélectionner la longueur de trajet appropriée pour l’échantillon à mesurer. La deuxième étape de la procédure consiste à mesurer un blanc.

Ensuite, l’échantillon d’ADN ou de protéine est mesuré. La dernière étape de la procédure consiste à enregistrer les données au format PDF ou CSV. En fin de compte, des résultats hautement reproductibles pour l’ADN et les protéines.

La quantification peut être obtenue rapidement et avec précision par cette méthode. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide, précise et reproductible. Pour commencer la procédure de quantification de l’ADN, allumez le nano-spectrophotomètre conforme aux spécifications du BIOS.

Ouvrez le logiciel BIOS spec nano à partir du bureau du PC. Cliquez sur l’onglet simple acide nucléique D-S-D-N-A. Le logiciel établira la communication avec l’instrument et exécutera une séquence d’initialisation.

Cela permet de vérifier que l’instrument fonctionne conformément aux spécifications. Ensuite, sélectionnez la longueur du chemin. Sur le curseur de longueur du chemin.

Trois options sont disponibles pour les échantillons d’un volume de plusieurs microlitres : 0,2 millimètre ou 0,7 millimètre peuvent être utilisés. Et pour les échantillons dilués, il est possible d’utiliser un vete de cinq millimètres de longueur de trajet.

Dans cette démonstration, 0,7 millimètre est sélectionné pour mesurer un échantillon de deux microlitres. Tous les calculs sont basés sur la longueur du chemin sélectionné. Ensuite, dans le logiciel, cliquez sur l’onglet de configuration et sélectionnez la configuration de l’effacement automatique.

Sélectionnez-en un pour un linge. Avant la mesure de l’échantillon, ou chaque fois qu’une nouvelle longueur de trajet est sélectionnée, une mesure à blanc est nécessaire Pour une longueur de trajet de 0,7 millimètre, pipetez deux microlitres d’eau ou de tampon sur le piédestal. Cliquez sur blank pour la mesure à blanc.

La fenêtre supérieure se déplacera pour entrer en contact avec la gouttelette d’échantillon et des éclairs de xénon peuvent être observés. Une fois la mesure terminée, l’essuie-glace essuie automatiquement l’échantillon. L’échantillon peut maintenant être mesuré.

Il est important d’utiliser une solution d’échantillon homogène car il y a des particules non dissoutes. La particule d’échantillon donnera des données non reproductibles. Pour éviter d’introduire des bulles d’air, aspirez soigneusement deux microlitres de l’échantillon, puis pipetez l’échantillon uniformément de la pointe de la pipette sur le socle.

Appuyez sur le bouton de démarrage de l’instrument. Comme auparavant, la fenêtre supérieure se déplacera pour entrer en contact avec la gouttelette d’échantillon, et des flashs de xénon peuvent être observés pour déterminer la reproductibilité, répéter la mesure du même échantillon trois fois, toutes les données enregistrées sont automatiquement sauvegardées sous forme de fichier BUD. Pour enregistrer en tant que fichier PDF ou CCSV, cliquez sur enregistrer P-D-F-C-S-V.

Les résultats peuvent également être enregistrés sous forme de fichier CSV en utilisant la sélection appropriée dans l’onglet de sauvegarde. La quantification des protéines peut être effectuée à l’aide de la méthode de l’absorbance deux 80. Pour la quantification des protéines, sélectionnez l’onglet Quantification des protéines.

Entrez le coefficient d’extinction epsilon deux 80 s’il est connu, si Epsilon deux 80 n’est pas connu, calculez-le à l’aide de Epsilon deux 80 calc sélectionnez 0,2 millimètre sur le curseur de longueur de chemin pour mesurer un échantillon de trois microlitres. Ensuite, dans le logiciel, cliquez sur l’onglet de configuration et sélectionnez la configuration de l’effacement automatique. Sélectionnez deux lingettes pour deux afin d’éviter tout transfert d’échantillon et d’assurer une lecture précise.

Pour mesurer une pipette vierge de trois microlitres d’eau ou de tampon sur le piédestal, cliquez sur blanc pour la mesure à blanc. Ensuite, pipetez soigneusement trois microlitres d’échantillon de protéines sur le piédestal. Sans introduire de bulles d’air pour commencer à mesurer l’échantillon, cliquez sur démarrer dans le logiciel ou appuyez sur le bouton de démarrage de l’instrument.

Répétez la mesure du même échantillon trois fois pour déterminer la reproductibilité démontrée. Voici les données provenant de mesures sur un échantillon d’ADN double brin typique. La formule utilisée pour calculer la concentration d’ADN est la suivante : la concentration de l’échantillon est égale à la quantité de DO deux 60 moins DO trois fois 20 fois NACF, où DF est égal au facteur de dilution de l’échantillon et NACF est égal au facteur de concentration en acide nucléique.

Le facteur de concentration en acide nucléique est fixé en fonction de l’analyte sélectionné. La concentration calculée en acides nucléiques et le rapport OD 2 62 80 sont indiqués. Ce tableau contient les résultats des tests de reproductibilité pour la quantification de l’ADN.

L’ensemble des données montre des résultats qui sont hautement reproductibles, comme en témoigne le faible écart-type relatif de 0,26 %Les résultats représentatifs d’une analyse de concentration en protéines pour la BSA sont présentés ici. La concentration en protéines au microgramme par millilitre est basée sur la valeur Epsilon deux 80. Enfin, ce tableau présente une analyse de reproductibilité de la quantification des protéines.

L’écart-type relatif de 0,51 % indique que la spécification nano du BIOS mesure avec précision non seulement l’ADN, mais aussi les protéines. Une fois maîtrisés, plusieurs échantillons peuvent être analysés en une minute.