Name: Détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume Bio-spec Spectrophotomètre Nano (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Découvrez la quantification précise des acides nucléiques et des protéines avec le spectrophotomètre BioSpec-nano en utilisant des volumes ultra-faibles. Cette méthode offre une reproductibilité excellente pour la recherche en biochimie.

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1. Procédure pour la quantification d'ADN <ol><li> Tournez sur l'instrument. </li><li> Ouvrez le logiciel BioSpec-nano à partir du PC de bureau. </li><li> Cliquez sur l'acide nucléique simple-ADNdb onglet (figure 1). </li><li> Le logiciel va établir la communication avec l'instrument et d'exécuter une séquence d'initialisation. Cela permet de vérifier que l'instrument effectue conformément aux spécifications. </li><li> Sélectionnez 0,7 ou 0,2 mm sur le curseur trajet optique. Cela sélectionne le trajet optique et tous les calculs sont basés sur le trajet optique sélectionné. </li><li> Suivant dans BioSpec nano-cliquez logiciel de configuration-Autowiping configuration. Sélectionnez 1 ou 2. </li><li> Pipeter 2 uL (pour 0,7 mm) H 2 O ou mémoire tampon sur le piédestal. </li><li> Cliquez vierge ou F6 pour la mesure de vide. Chaque fois qu'une nouvelle trajet optique est sélectionné, il est nécessaire d'enregistrer un blanc. </li><li> Pipeter 2 uL d'échantillon sur le piédestal. </li><li> Cliquez sur Démarrer dans le logiciel ou poussez le bouton de démarrage de l'instrument. La fenêtre supérieure se déplace pour prendre contact avec la goutte d'échantillon. Clignote au xénon peuvent être observés. </li><li> Répétez le même échantillon 3 fois pour déterminer la reproductibilité. </li><li> Toutes les données enregistrées sont enregistrées au format. Bourgeon fichier. </li><li> Pour enregistrer au format pdf. Ou. Csv cliquez sur Enregistrer pdf / csv ou F9. Les résultats peuvent également être sauvegardées dans un fichier. Csv en utilisant la sélection appropriée dans l'onglet Enregistrer. </li></ol> 2. Protocole pour la quantification des protéines <ol><li> Sélectionnez l'onglet quantification des protéines (figure 2). </li><li> Entrez le e280 coefficient d'extinction, si elle est connue. </li><li> Si E280 n'est pas connu de calculer à l'aide e280Calc. </li><li> Sélectionnez 0,7 ou 0,2 mm sur le curseur trajet optique. </li><li> Cliquez sur Configuration-Autowiping configuration. Sélectionnez 2 ou supérieur. </li><li> Pipette 3 pi (0,2 mm) H 2 O ou mémoire tampon sur le piédestal. </li><li> Cliquez vierge ou F6 pour la mesure de vide. </li><li> Pipette 3 uL d'échantillon de la protéine sur le piédestal. </li><li> Cliquez sur Démarrer dans le logiciel ou poussez le bouton de démarrage de l'instrument. </li><li> Répétez le même échantillon 3 fois pour déterminer la reproductibilité. </li><li> Toutes les données enregistrées sont enregistrées au format. Bourgeon de fichier </li><li> Pour enregistrer au format pdf. Ou. Csv cliquez sur Enregistrer pdf / csv ou F9. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: 1. Résultats pour la quantification d'ADN La figure 3 montre les données à partir de mesures sur un échantillon typique d'ADN double brin. La concentration et OD 260/280 ratio calculé sont également représentées. La figure 4 contient les résultats des tests de reproductibilité pour la quantification d'ADN. Les données des figures 3 et 4 résultats montre sont hautement reproductibles comme en témoigne le faible écart type relatif de 0,26%. Note 1: Imprécision dans la quantification d'ADN peuvent découler de la présence des composants du tampon qui peut absorber dans la région UV. Il est également nécessaire d'utiliser une solution d'échantillon homogène. Comme la quantité d'échantillon étant pipette est seulement 1-2 uL, pipetage minutieux des volumes précis sans l'introduction de toute bulle est nécessaire. 2. Résultats pour quantification des protéines La figure 5 représente l'analyse la concentration de protéines pour BSA. La concentration en protéines pg / ml est basé sur la valeur e280. La figure 6 montre l'analyse de reproductibilité. Il est évident d'après l'écart type relatif de 0,51% que le BioSpec nano-mesures de la concentration précisément - non seulement pour l'ADN, mais aussi pour les protéines. Note 2: Facteurs influant sur ​​la concentration de protéines Détermination de la concentration de protéines précis est réalisable quand il ya un minimum d'effets de l'instabilité provoquée par le pH, tampons, la température ou d'additifs. La plupart des protéines purifiées passe par différentes étapes de traitement, d'où il est possible que la protéine peut contenir des agents tensioactifs ou d'autres additifs qui peuvent interférer avec la formation de gouttelettes. Pour ces échantillons, en utilisant la cellule de 5 mm trajet optique de quartz est fortement recommandée. <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Fenêtre de sélection Analyte pour la quantification d'ADN double brin <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Fenêtre de sélection d'analyte pour la quantification des protéines non étiquetés <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Représentant des données Figure 3. Pour la quantification d'ADN <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> La reproductibilité des données Figure 4. Pour la quantification d'ADN <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Données représentatives pour la quantification des protéines <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt='"Figure'> Figure 6. Données de reproductibilité pour la quantification des protéines

<ol><li>Aisubel, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAisubel%2C+F+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th edition, WILEY. (1999).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.</li>
</ol>

Suja Sukumaran, Ph.D. est un employé de Shimadzu qui fait l&#39;instrument présenté dans cet article.

Les nano-BioSpec a été conçu pour résoudre les problèmes actuels inhérents aux méthodes de quantification de l&#39;ADN, telles que des résultats incohérents et le travail manuel fastidieux. Chaque mesure ne prend que 3 secondes, permettant à un biologiste expérimenté moléculaire pour analyser plusieurs échantillons d&#39;environ 3-6 en une minute. La fonction d&#39;essuie-glace unique, non seulement améliore le débit de la mesure, il élimine également le besoin pour le nettoyage manuel des piédestaux, résultant en report négligeables entre les mesures. Par ailleurs, des tests en utilisant seulement 2 lingettes pour les échantillons d&#39;ADN contenant 1000 ng / uL, a indiqué report moins de 2 ng / mL. La disponibilité d&#39;une cellule de 5 mm trajet optique fournit une option pour analyser diluer l&#39;acide nucléique et des protéines des échantillons et s&#39;étend à l&#39;utilisation de cet instrument pour d&#39;autres applications.

<table><tbody><tr><td>BioSpec-nano</td><td>Shimadzu Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN de thymus de veau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume bio-spec spectrophotomètre nano

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid procédures de quantification ont considérablement progressé au cours des trois dernières décennies. De plus en plus, des biologistes moléculaires nécessitent cohérente petit volume d&#39;analyse d&#39;échantillons d&#39;acides nucléiques pour leurs expériences. Les nano-BioSpec fournit une solution potentielle aux problèmes de la inexactes, les résultats non reproductibles, inhérente à la quantification méthodes actuelles de l&#39;ADN, via l&#39;optique spécialisée et un détecteur sensible PDA. Le BioSpec-nano a aussi des fonctionnalités automatisées telles que le montage, la mesure et de nettoyage sont effectuées par l&#39;instrument, éliminant ainsi le placement fastidieuse, répétitive et incohérente de l&#39;élément de fibre optique et le nettoyage manuel. Dans cette étude, les données sont présentées sur la quantification de l&#39;ADN et de protéines, ainsi que sur la reproductibilité et la précision de mesure. Contact avec l&#39;échantillon automatisée et balayage rapide permet de mesurer en trois secondes, résultant en un débit excellent. L&#39;analyse des données est effectué en utilisant les fonctionnalités intégrées dans le logiciel. La formule utilisée pour calculer la concentration en ADN est la suivante: Concentration de l&#39;échantillon = DF · (OD260-OD320) · NACF (1) Où DF = facteur de dilution de l&#39;échantillon et NACF = facteur de concentration d&#39;acide nucléiques. Le facteur de concentration d&#39;acide nucléique est fixé en conformité avec l&#39;analyte sélectionné 1. Résultats de concentration en protéines peut être exprimée en pg / mL ou en moles / L en entrant e280 et les valeurs de poids moléculaire respectivement. Lorsque les valeurs des résidus pour Tyr, Trp et la cystéine (SS obligataires) sont entrés dans l&#39;onglet e280Calc, les valeurs du coefficient d&#39;extinction sont calculés comme e280 = 5500 x (résidus Trp) + 1490 x (résidus Tyr) + 125 x (cystéine SS obligataire) . La valeur E280 est utilisé par le logiciel pour le calcul de la concentration. En plus de détermination de la concentration des acides nucléiques et les protéines, les nano-BioSpec peut être utilisé comme un ultra micro-volume spectrophotomètre pour beaucoup d&#39;autres analytes ou comme un spectrophotomètre standard utilisant des cellules 5 mm trajet optique.

Cette communication présente des données sur la précision et la reproductibilité des BioSpec nano-UV-VIS spectrophotomètre pour ADNdb et la quantification des protéines. Même avec ultra-petits volumes (1 à 2 L), la reproductibilité est excellente, tandis que la fonction automatisée essuyant améliore le débit et les résultats de report minimale pour obtenir des résultats plus précis.

Détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume Bio-spec Spectrophotomètre Nano

Les procédures de quantification des acides nucléiques ont considérablement progressé au cours des trois dernières décennies. De plus en plus, les biologistes moléculaires exigent une cohérence...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer avec précision et reproductibilité les concentrations d'acides nucléiques et de protéines à l'aide d'un spectrophotomètre à microvolume. Cela est réalisé en sélectionnant d'abord la longueur de trajet appropriée pour l'échantillon à mesurer. La deuxième étape de la procédure consiste à mesurer un blanc.Ensuite, l'échantillon d'ADN ou de protéine est mesuré. La dernière étape de la procédure consiste à enregistrer les données au format PDF ou CSV. En définitive, des résultats hautement reproductibles pour l'ADN et les protéines.La quantification peut être obtenue rapidement et avec précision par cette méthode. Le principal avantage de cette technique réside dans sa rapidité, sa précision et sa reproductibilité. Pour commencer la procédure de quantification de l'ADN, allumez le spectrophotomètre nano BIOSpec.Ouvrez le logiciel BIOS spec nano depuis le bureau de l'ordinateur. Cliquez sur l'onglet ADN nucléique simple D-S-D-N-A. Le logiciel établira une communication avec l'instrument et exécutera une séquence d'initialisation.Ceci permet de vérifier que l'appareil fonctionne conformément aux spécifications. Ensuite, sélectionnez la longueur de trajet. Sur le curseur de longueur de trajet.Trois options sont disponibles pour les échantillons de volume microlitrique. On peut utiliser 0,2 millimètre ou 0,7 millimètre. Et pour les échantillons dilués, il est possible d'utiliser une longueur de trajet optique de cinq millimètres.Dans cette démonstration, 0,7 millimètre est sélectionné pour mesurer un échantillon de deux microlitres. Tous les calculs sont basés sur la longueur de trajet optique choisie. Ensuite, dans le logiciel, cliquez sur l'onglet configuration et sélectionnez le réglage de l'essuyage automatique.Sélectionnez-en un pour un essuyage. Avant la mesure d'un échantillon, ou à chaque fois qu'une nouvelle longueur de trajet optique est sélectionnée, une mesure du blanc est requise. Pour une longueur de trajet optique de 0,7 millimètre, déposez deux microlitres d'eau ou de tampon sur le socle. Cliquez sur « blanc » pour effectuer la mesure du blanc.La fenêtre supérieure va se déplacer pour entrer en contact avec la goutte d'échantillon et des éclairs de xénon peuvent être observés. Lorsque la mesure est terminée, l'essuie-glace efface automatiquement l'échantillon. L'échantillon peut désormais être mesuré.Il est important d'utiliser une solution d'échantillon homogène, car la présence de particules non dissoutes peut entraîner des données non reproductibles. Pour éviter d'introduire des bulles d'air, aspirez soigneusement deux microlitres de l'échantillon, puis déposez uniformément l'échantillon à partir de l'embout de la pipette sur le socle.Appuyez sur le bouton de démarrage de l'appareil. Comme précédemment, la fenêtre supérieure va se déplacer pour entrer en contact avec la goutte d'échantillon, et des éclairs de xénon peuvent être observés. Pour déterminer la reproductibilité, répétez la mesure du même échantillon trois fois ; toutes les données enregistrées sont automatiquement sauvegardées sous forme d'un fichier A BUD. Pour enregistrer au format PDF ou CCSV, cliquez sur enregistrer P-D-F-C-S-V.Les résultats peuvent également être enregistrés sous forme de fichier CSV en utilisant la sélection appropriée dans l'onglet d'enregistrement. La quantification des protéines peut être effectuée à l'aide de la méthode d'absorbance à 280 nm. Pour la quantification des protéines, sélectionnez l'onglet de quantification des protéines.Saisissez le coefficient d'extinction epsilon 280 s'il est connu ; si epsilon 280 n'est pas connu, calculez-le à l'aide de epsilon 280 calc. Sélectionnez 0,2 millimètre sur le curseur de longueur de trajet pour mesurer un échantillon de trois microlitres. Ensuite, dans le logiciel, cliquez sur l'onglet configuration et sélectionnez le réglage d'essuyage automatique. Choisissez deux essuyages pour éviter tout transfert d'échantillon et garantir une mesure précise.Pour mesurer un blanc, pipetez trois microlitres d'eau ou de tampon sur le socle, puis cliquez sur « blanc » pour effectuer la mesure du blanc. Ensuite, pipetez soigneusement trois microlitres d'échantillon protéique sur le socle. Sans introduire de bulles d'air, cliquez sur « démarrer » dans le logiciel ou appuyez sur le bouton de démarrage de l'appareil pour commencer la mesure de l'échantillon.Répétez la mesure du même échantillon trois fois pour déterminer la reproductibilité indiquée. Voici les données obtenues à partir de mesures effectuées sur un échantillon typique d'ADN double brin. La formule utilisée pour calculer la concentration en ADN est la suivante : concentration de l'échantillon égale DF multiplié par la quantité d'OD à 260 nm moins OD à 320 nm fois NACF, où DF correspond au facteur de dilution de l'échantillon et NACF au facteur de concentration des acides nucléiques.Le facteur de concentration des acides nucléiques est défini conformément à l'analyte sélectionné. La concentration d'acide nucléique calculée et le rapport OD 2 62 80 sont indiqués. Ce tableau contient les résultats des tests de reproductibilité pour la quantification de l'ADN.Ensemble, les données montrent des résultats hautement reproductibles, comme en témoigne l'écart-type relatif faible de 0,26 %. Des résultats représentatifs d'une analyse de concentration en protéines pour l'albumine sérique bovine (BSA) sont présentés ici. La concentration en protéines exprimée en microgrammes par millilitre est basée sur la valeur d'extinction molaire à 280 nm (Epsilon 280). Enfin, ce tableau présente une analyse de reproductibilité de la quantification des protéines.Le coefficient de variation relatif de 0,51 % indique que le BIOS spec nano mesure avec précision l'OD non seulement pour l'ADN, mais aussi pour les protéines. Une fois maîtrisé, plusieurs échantillons peuvent être analysés en une minute.

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