Translocation polarisée des protéines fluorescentes dans les Xenopus en réponse à la signalisation Wnt

L'objectif général de cette procédure est d'examiner les changements de localisation subcellulaire des protéines suite à la signalisation par un facteur de croissance. Cela est réalisé en injectant d'abord des blastomères animaux d'embryons précoces de Xenopus avec des ARN codant pour diverses protéines marquées en RFP et le récepteur de signalisation FRIZZLED huit. Ensuite, des implants électrodermiques et/ou des coupes cryogéniques d'embryons sont préparés et soumis à une immunomarquage.

Enfin, les cellules immunomarquées sont observées au microscope fluorescent. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant comment la localisation subcellulaire d'une protéine spécifique dépend des voies de signalisation embryonnaires. À titre d'exemple, nous démontrons que la protéine DIVERS ish est recrutée du centrosome vers la membrane cellulaire par le récepteur FRIZZLED huit.

Cette méthode permet aux chercheurs de visualiser la localisation subcellulaire des protéines de signalisation in vivo à l'aide d'embryons de Xenopus. Cela peut aider à répondre à des questions fondamentales en biologie du développement et en biologie cellulaire, telles que les études sur la régulation spatiale des voies de signalisation et des mécanismes de priorité cellulaire. Pour commencer le processus de fécondation in vitro, obtenir des œufs à partir de grenouilles femelles ayant reçu une injection de gonadotrophine chorionique humaine.

12 heures avant l'expérience, ajouter de 0,5 à un millilitre de solution de Ringer modifiée X Marx sur les œufs et les féconder in vitro à l'aide d'un petit morceau de testicule disséqué. Après deux à trois minutes, réduire la concentration en sel avec du MMR 0,1 X pour activer la mobilité des spermatozoïdes. Incuber pendant 20 minutes.

Après la fécondation, les œufs s'orientent avec leurs pôles animaux vers le haut. Retirer la gaine de gelée des œufs en remplaçant la solution MMR par une solution de 3 % de cystéine dans l'eau pendant cinq minutes. Rincer les œufs trois fois avec du MMR 0,1 X.

Incuber à 13 degrés Celsius jusqu'au stade deux à quatre cellules. Ensuite, transférer les embryons dans du 3 %fi. Placer dans du MMR 0,5 X pour la micro-injection.

Synthétisez des ARN à partir de matrices d'ADN linéarisées en utilisant le kit M message M machine et diluez-les avec de l'eau exempte d'ARN jusqu'à une concentration de 0,1 à un microgramme par microlitre. Les ARN destinés à divers marqueurs, comme l'inRFP, le marqueur membranaire GFP CX et Frizzled huit, sont utilisés à raison de 0,1 à un nanogramme par injection. Préparez les aiguilles d'injection à partir de tubes capillaires en utilisant un tire- aiguilles et un affûteur d'aiguilles avant l'injection.

Étalonnez chaque aiguille avec de l'eau afin d'éjecter 10 litres de liquide par injection. Placez les embryons au-dessus d'une boîte en plastique dans une grande goutte de 3 % de fial 0,5 XMMR. Aspirez un microlitre de solution d'ARN dans une aiguille d'injection à l'aide d'un micro-injecteur Shige étroit.

Injecter 10 nanolitres d'ARN dans chacun des deux blastomères animaux d'embryons à deux cellules. Transférer les embryons injectés dans une cavité d'une plaque de 12 puits et incuber à 13 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade de gastrula précoce.

Transférez les embryons au stade gastulaire dans une solution de 0,6 XMMR dans une boîte en plastique de six centimètres de diamètre recouverte d'1 % d'aéros. Retirez manuellement la membrane vitelline à l'aide de pinces. Ensuite, utilisez une aiguille en tsin et une boucle de cheveu pour exciser des explants ectodermiques à partir des embryons.

Les fixer dans du formaldéhyde à 3,7 % dans du PBS pendant 30 minutes. Laver l'X explan trois fois pendant 10 minutes chacun dans du PBS. Pour colorer les noyaux, ajouter du davi au troisième lavage.

Ensuite, montez l'explants X sur une lame de verre en les plaçant entre deux bandes de ruban adhésif, le côté interne non pigmenté de l'explants X étant orienté vers l'objectif. Ajoutez deux à trois gouttes de 20 microlitres de la solution de montage. Placez une lamelle par-dessus.

Les embryons injectés peuvent être inclus en cryo-sections afin de visualiser la distribution des protéines fluorescentes dans la cellule et d'effectuer une coloration immunohistochimique avec des anticorps spécifiques. Au stade 10, fixer les embryons pendant une à deux heures à température ambiante avec un fixateur concentré dans un flacon en verre de quatre millilitres. Ensuite, après un lavage dans le PBS, inclure les embryons dans une solution de gélatine de poisson à 15 % et de saccharose à 15 % dans le même flacon.

Le jour suivant, transférez les embryons inclus dans un moule en plastique. Congelez rapidement les embryons inclus sur de la glace sèche. Préparez ensuite des coupes cryogéniques à l'aide d'un cryostat.

Réalisez une coloration immunofluorescente sur les coupes, montez les lames et observez les embryons en coupe transversale en utilisant la même méthode que celle décrite pour les implants d'ectoderme. Acquérez les images à l’aide d’un microscope fluorescent Zeiss Axio plan doté des filtres appropriés et d’un objectif permettant d’identifier et d’imager des plans Z spécifiques au sein de l’explants X. Sur cette figure, la ersine est localisée au centrosome dans les cellules ectodermiques, mais transloquée vers la membrane cellulaire.

En réponse à Frizzled huit, cex GFP marque la membrane cellulaire en vert. Diverse in RFP apparaît en rouge, et les noyaux marqués par DPI sont en bleu ici. Diverse in RFP est recruté à la membrane cellulaire par Frizzled huit dans des sections cryogéniques d'embryon.

La tubuline gamma est un marqueur centro-somal. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l'utilité des embryons et des cellules embryonnaires XUS pour l'étude des processus d'autorisation d'ancrage des protéines et de signalisation à une résolution secondaire.