Détermination des espèces d'oxygène Potentiel membrane mitochondriale et réactive dans les neurones corticaux de rat en direct

L'objectif de cette procédure est de déterminer le potentiel membranaire mitochondrial et les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène dans des neurones corticaux primaires à l'aide des sondes fluorescentes TMRM et H2DCFDA, respectivement. Cette analyse est réalisée en préparant tout d'abord les concentrations stock et de travail du TMRM et du H2DCFDA. La deuxième étape consiste à incuber les neurones corticaux avec le TMRM et le H2DCFDA pendant 45 minutes à température ambiante dans un tampon Thai roads.

La troisième étape consiste à imager l'intensité de fluorescence de TMRM et de DCF dans des neurones corticaux vivants en utilisant respectivement des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 545/517 nanomètres et de 488/515 nanomètres. Les variations de la fluorescence de TMRM seront surveillées en présence du découplant mitochondrial FCCP, tandis que les variations de la fluorescence de DCF seront observées en présence de peroxyde d'hydrogène. La dernière étape de cette procédure est la collecte, la normalisation et l'analyse des données.

En fin de compte, les résultats sont obtenus en traçant un graphique montrant les niveaux relatifs d'intensité de fluorescence de TMRM et de DCF avant et après traitement par FCCP et paroxyde d'hydrogène, respectivement. Bonjour, je suis Joanna Koska. Bienvenue dans mon laboratoire à l'Université Loyola de Chicago.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment mesurer le potentiel de membrane mitochondrial et les espèces réactives de l'oxygène dans des neurones corticaux de rat. La procédure sera démontrée par dhi. Bonjour, je suis Denise Jossi.

Grâce à cette procédure, le potentiel membranaire mitochondrial peut être mesuré au niveau d'une étiquette mitochondriale unique, et les espèces réactives de l'oxygène au niveau d'une étiquette cellulaire unique. Commençons donc. Préparez un stock de 10 millimolaire de TMRM en dissolvant cinq milligrammes de TMRM dans un millilitre de diméthylsulfoxyde anhydre, puis vortexez pendant une minute.

Ensuite, effectuez des aliquotes et conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Protégez-les de la lumière et utilisez-les dans un délai d'un mois. Préparez ensuite un stock de 10 millimolaire de H 2D CFDA en dissolvant 4,87 milligrammes de H 2D CFDA dans un millilitre de diméthylsulfoxyde anhydre.

De la même manière, vortexer pendant une minute, puis effectuer des aliquotes et les conserver à moins 20 degrés Celsius. Protéger de la lumière et utiliser dans la semaine pour charger d'abord les neurones corticaux de rat avec le TMRM. Laver les neurones en culture trois fois avec le tampon de Tyrode.

Préparez ensuite 20 nanomolaires de TMRM en diluant 1000 fois le stock de TMRM à 10 millimolaires dans du tb. Ajoutez ensuite deux microlitres du TMRM dilué par millilitre de tb. Incubez les neurones avec le TMRM pendant 45 minutes à l'abri de la lumière et à température ambiante.

Après 45 minutes, monter la boîte de culture sur la platine du microscope et commencer l'acquisition d'images pour charger les neurones corticaux de rat avec le H2DCFDA, puis laver les neurones en culture trois fois avec du tb. Préparer ensuite une solution de H2DCFDA à deux micromolaires en diluant 10 fois la solution mère de H2DCFDA à 10 millimolaires dans du tb. Ajouter ensuite deux microlitres de la solution diluée de H2DCFDA par millilitre de tb.

Incubez ensuite les neurones avec le H 2D CFDA pendant 45 minutes à l'obscurité et à température ambiante après 45 minutes. Lavez les neurones quatre fois avec du TB pour éliminer l'indicateur fluorescent en excès avant d'acquérir des images afin de réaliser une imagerie en temps réel des neurones incubés avec le TMRM par microscopie confocale à balayage laser, en utilisant le programme de séries temporelles en direct. Appliquez une résolution faible et une puissance laser atténuée afin de minimiser le temps nécessaire à l'acquisition des images et d'éviter le photoblanchiment.

Ensuite, ajustez le focus des neurones montés chargés de TMRM en utilisant la lumière réfléchie. Examinez la fluorescence du TMRM par une illumination à cinq 14 nanomètres et une détection à cinq 70 nanomètres. Réglez le gain de détection de la caméra légèrement en dessous du niveau de saturation une fois tous les paramètres fixés, notamment la résolution, la puissance du laser, le gain de la caméra et l'intervalle de prise de vue en laps de temps pour obtenir les images.

Ne modifiez pas ces paramètres entre les expériences. Ensuite, changez le champ. Commencez à acquérir des images pour tester les modifications du stimulus delta PSY M, par exemple en appliquant une micromolaire de FCCP ou deux microgrammes par millilitre d'oligomycine, ce qui entraînera respectivement une dépolarisation ou une hyperpolarisation marquée du potentiel membranaire mitochondrial.

Ces changements se manifesteront par une diminution de l'intensité de fluorescence du TMRM par rapport à l'intensité de fluorescence de base dans le cas du FCCP, ou par une augmentation de l'intensité de fluorescence du TMRM. Dans le cas d'une LIGA myin sin, pour réaliser un imagerie en direct de neurones incubés avec du H 2D CFDA, montez d'abord la boîte de culture sur la platine d'un microscope, puis ajustez le focus des cellules à l'aide de la lumière réfléchie. Examinez la fluorescence DCF par excitation à 4 88 nanomètres et émission à cinq 15 nanomètres.

Ensuite, réglez la puissance du laser à cinq à 7 % pour détecter un gain et une résolution de 256 par 256. Ne modifiez pas ces paramètres entre les expériences. Réglez ensuite la fréquence d'acquisition des images en direct.

À l'aide du programme de séries temporelles, sélectionnez un nouveau champ et commencez l'acquisition d'images pour détecter les variations des niveaux de ROS. Traitez les cellules avec 100 à 200 micromolaire de peroxyde d'hydrogène. Cela se traduira par une augmentation de l'intensité de la fluorescence DCF par rapport au niveau de base.

Utilisez l'outil de région d'intérêt du programme LSM pour sélectionner les zones. Ensuite, choisissez des ROI à partir des régions mitochondriales ou des ROI provenant de l'ensemble du corps cellulaire dans les cellules imagées, afin de mesurer respectivement les intensités de fluorescence de TMRM ou des ERO.

Sélectionnez des régions adjacentes aux cellules. Pour calculer l'intensité de fluorescence de fond, effectuez plusieurs mesures, puis calculez l'intensité moyenne de fond ; soustrayez cette intensité moyenne de fond des intensités de fluorescence moyennes des régions d'intérêt dans chaque cellule pour chaque point temporel à l'aide de Microsoft Excel. Après soustraction de l'intensité de fond, normalisez l'intensité de fluorescence de TMRM ou de DCF à l'intensité de fluorescence de base.

À l'aide de cette formule, utilisez ensuite le programme Sigma Plot pour générer le graphique montrant les variations de l'intensité de fluorescence au fil du temps. Voici un exemple d'image de fluorescence de neurones corticaux de rat incubés avec du TMRM. L'ajout de l'agent désaccoupleur mitochondrial F-C-C-P-A entraîne une dépolarisation mitochondriale et une perte de l'intensité de fluorescence du TMRM.

Le niveau de fluorescence de base du TMRM reste stable avant l'ajout de FCCP. L'analyse quantitative des variations de la fluorescence du TMRM au fil du temps montre une diminution significative de la fluorescence du TMRM après l'ajout de FCCP. Voici un exemple d'image de fluorescence de neurones corticaux de rat chargés avec du DCF.

Le niveau de fluorescence de DCF au départ reste inchangé durant les 120 premières secondes avant l'ajout du peroxyde d'hydrogène. L'ajout de peroxyde d'hydrogène entraîne une augmentation de l'intensité de fluorescence de DCF dans les corps cellulaires. Des mesures temporelles de la fluorescence de DCF montrent des niveaux stables ayant augmenté après les traitements au peroxyde d'hydrogène.

Dans cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser une faible puissance laser et une vitesse de balayage rapide afin d'éviter les artefacts dus au photoblanchiment et à la phototoxicité. Bonne chance avec votre expérience.