Name: Détermination des espèces doxygène Potentiel membrane mitochondriale et réactive dans les neurones corticaux de rat en direct (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Découvrez comment mesurer le potentiel membranaire mitochondrial et les espèces réactives de l'oxygène dans les neurones corticaux de rat en utilisant les sondes fluorescentes TMRM et H2D CFDA. Cette méthode permet d'évaluer la fonction mitochondriale et le stress oxydatif en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (K22NS050137 à JCB).

1. La culture cellulaire <ol><li> Les neurones corticaux sont isolées et cultivées en utilisant des techniques décrites précédemment et étalées sur des boîtes de culture avec un fond de verre (MatTek Corporation, Ashland, MA) recouvertes de poly-D-lysine et de la laminine 1. </li></ol> 2. Préparer les solutions mères pour les sondes fluorescentes TMRM et H 2 DCF-DA <ol><li> Préparer une solution stock de 10 mM de TMRM en dissolvant 5,0 mg de TMRM dans 1 ml de diméthylsulfoxyde anhydre. Vortex c'est pendant 1 min. Ensuite, faire des aliquots et de les stocker à -20 ° C, protéger de la lumière, et l'utiliser dans un mois. </li><li> Ensuite, préparer une solution stock de 10 mM de H 2 DCF-DA en dissolvant 4,87 mg de H 2 DCF-DA dans 1 ml de DMSO anhydre. De même, il vortex pendant 1 min. Ensuite, faire des aliquots et de les stocker à -20 ° C, protéger de la lumière, et l'utiliser dans une semaine. </li></ol> 3. Chargement des neurones de rat corticale avec TMRM et H 2 DCF-DA TMRM est un potentiométrique, les cellules perméables indicateur fluorescent qui s'accumule dans l'intérieur, fortement chargées négativement des mitochondries. Il est important d'utiliser les faibles concentrations (10-50 nm) des TMRM pour éviter l'auto-extinction de TMRM mitochondriale. Ensuite, le signal de fluorescence de TMRM peuvent être directement liés à la co-ΔΨm à travers la membrane mitochondriale interne. Une perte de ΔΨm provoque une fuite de TMRM des mitochondries entraînant une perte d'intensité de fluorescence. H 2 DCF-DA est la cellule-perméable sonde converti en signal DCF-DA par des estérases intracellulaires, et ses résultats d'oxydation dans DCF fluorescente. La concentration finale de H 2 DCF-DA varie entre 2-10 uM et il devrait être testé empiriquement dans les neurones issus de différentes régions du cerveau car les concentrations de chargement élevée peut entraîner la saturation du DCF de fluorescence, même en l'absence de H 2 O 2. La présence de tout oxydant endogène ou exogène (par exemple, l'hydrogène hypoazotique oxyde) va augmenter DFC de fluorescence d'intensité. Ci-dessous, nous fournissons un protocole pour le chargement de neurones corticaux de rat avec TMRM et H 2 DCF-DA. <ol><li> Pour charger les neurones corticaux de rat avec TMRM, d'abord, lavez les neurones cultivés à 3 reprises avec du tampon de Tyrode (Superposition de texte: la tuberculose: 145 mM NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glucose, 1,5 mM de CaCl2, MgCl2 1 mM, et 10 mM HEPES; ajuster le pH à 7,4 avec NaOH). Ensuite, préparez 20 nM de TMRM en diluant le stock de 10 mM TMRM 1 / 1000 fois dans la tuberculose, puis ajouter 2 pi de TMRM dilué par 1 ml de la tuberculose. Incuber les neurones avec TMRM pendant 45 min dans le noir à température ambiante. Après 45 minutes, monter la boîte de culture sur la scène du microscope et de commencer l'imagerie. </li><li> Pour charger les neurones corticaux de rat avec du H 2 DCF-DA, laver les neurones cultivés 3 fois avec la tuberculose. Ensuite, préparez 2 uM de H 2 DCF-DA en diluant le 10 mM H 2 DCF-DA stock de 1 / 10 fois dans la tuberculose, puis ajouter 2 pi de dilution de H 2 DCF-DA pour 1 ml de la tuberculose. Puis, incuber les neurones avec du H 2 DCF-DA pendant 45 min dans le noir à température ambiante. Après 45 minutes, laver les neurones 4 fois avec la tuberculose pour enlever l'excès indicateur fluorescent, avant d'obtenir des images. </li></ol> 4. En direct d'imagerie des neurones incubées avec TMRM pour déterminer ΔΨm <ol><li> Pour effectuer l'imagerie en direct de neurones incubées avec TMRM, microscopie confocale à balayage laser (Superposition de texte: LSM 510, objectif Carl Zeiss Inc), avec l'application de vivre des séries chronologiques de programme, est utilisé. Appliquer à faible résolution et atténué la puissance laser (Superposition de texte: basse résolution: 256 x 256; puissance du laser: 1%) pour minimiser le temps nécessaire pour obtenir des images et d'éviter de photoblanchiment. </li><li> . Ensuite, régler la netteté de l'neurones montés chargé avec TMRM utilisant la lumière réfléchie. Examiner la fluorescence TMRM par illumination à 514 nm et la détection à 570 nm. Réglez le gain de détection d'une caméra juste en dessous du niveau de saturation. </li><li> Une fois tous les paramètres qui incluent la résolution, la puissance du laser, le gain de détection d'une caméra, et time-lapse d'intervalle pour obtenir des images sont définies, ne pas modifier ces paramètres entre les expériences. Ensuite, modifiez le champ. Commencer à recueillir des images. </li><li> Pour tester des changements dans ΔΨm, des stimuli tels que 1 uM de FCCP ou 2 ug / ml de oligomycine, peut être appliquée, ce qui va considérablement dépolariser ou hyperpolariser le potentiel de membrane mitochondriale, respectivement. Ces changements seront reflétés par une diminution de l'intensité de fluorescence TMRM par rapport à l'intensité de la fluorescence de base dans le cas du FCCP, ou une augmentation de TMRM intensité de fluorescence dans le cas de oligomycine. </li></ol> 5. Imagerie en direct de neurones incubées avec H 2 DCF-DA ROS pour déterminer <ol><li> Pour effectuer l'imagerie en direct de neurones incubées avec H 2 DCF-DA, d'abord, monter la boîte de culture sur la scène d'un microscope. Ajustez la mise au point des cellules-nousING lumière réfléchie. Examinez DCF de fluorescence par excitation à 488 nm et émission à 515 nm. </li><li> Ensuite, régler la puissance du laser à 5-7%, le gain du détecteur, et la résolution de 256 x 256. Ne pas modifier ces paramètres entre les expériences. Ensuite, définissez la fréquence pour obtenir des images en direct en utilisant le programme de séries chronologiques. </li><li> Sélectionner un domaine nouveau et commencer à acquérir des images. Pour détecter les changements dans les niveaux de ROS, traiter avec des cellules 100-200 pm de H 2 O 2. Cela sera reflété par une augmentation de l'intensité de fluorescence DCF par rapport au niveau de base. </li></ol> 6. L'analyse des données <ol><li> Utilisez région d'intérêt (Superposition de texte: RCI) l'outil à partir du programme LSM pour sélectionner les domaines. Ensuite, mesurer la TMRM ou ROS intensités de fluorescence. Sélectionnez ROIs de régions mitochondrial ou ROIs du corps cellulaire dans les cellules de toute imagée pour mesurer les intensités de fluorescence de TMRM ou ROS, respectivement. </li><li> Calculer les intensités moyennes de fluorescence de tous les ROIs de chaque cellule pour TMRM ou d'organismes à cellules entières pour toutes les cellules imagé pour ROS pour chaque point de temps. Sélectionnez les régions à côté de la cellules pour calculer l'intensité de fluorescence de fond. Prenez plusieurs mesures et de calculer l'intensité de fond moyenne. </li><li> Soustraire l'intensité de fluorescence de fond moyen de la moyenne des intensités de fluorescence de ROIs dans chaque cellule de chaque point de temps en utilisant Microsoft Excel. Après soustraction de l'intensité de fond, de normaliser l'intensité de fluorescence TMRM ou DCF à la fluorescence de base en utilisant cette formule (Superposition de texte: AF = FF o / o F x 100, où F = intensité de fluorescence à aucun moment, Fo = base de fluorescence). Ensuite, utilisez le programme tracé Sigma pour générer le graphique montrant les changements d'intensité de fluorescence au cours du temps. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs La figure 1A montre une image de fluorescence des neurones corticaux de rat incubées avec TMRM. Ajout de FCCP, un découplant mitochondrial, conduit à une dépolarisation mitochondriale et une perte d'intensité de fluorescence TMRM (Fig. 1B). Le niveau de fluorescence de base TMRM reste stable avant l'addition du FCCP (le premier 350 sec;. Fig 1C). L'analyse quantitative des changements de fluorescence TMRM au fil du temps montre une diminution significative de la fluorescence après ajout de TMRM FCCP (Fig. 1C). La figure 1D montre l'image de fluorescence des neurones corticaux de rats chargé avec DCF. L'addition de H 2 O 2 résultats dans DCF augmenté l'intensité de fluorescence dans les corps cellulaires (figure 1E). La base de fluorescence DCF niveau est inchangé (le premier 120 sec) avant l'application de H 2 O 2. Time-lapse mesures de fluorescence montrent DCF ses niveaux stables, ce qui augmente après H 2 O 2 de traitement (Fig. 1F). <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Évaluation du potentiel de membrane mitochondriale et les niveaux de ROS dans des neurones corticaux rat vivant. (A) représentant l'image de fluorescence des neurones corticaux chargés avec TMRM. Après la numérisation de la base TMRM de fluorescence, les neurones ont été traités avec le FCCP protonophore (1 uM). A droite se trouve une barre d'intensité de fluorescence pseudo TMRM vif maximal représentant jaune et noir et une intensité minimale, respectivement. La perte de fluorescence TMRM des régions mitochondrial indique l'effondrement du FCCP ΔΨm sur le traitement (tableau B). La représentation quantitative des changements dans l'intensité de fluorescence TMRM à différents moments avant et après traitement FCCP est montré dans le panneau C (D) image de fluorescence des neurones corticaux de rat chargé avec H2DCF-DA. Après détermination de la base DCF de fluorescence, les cellules ont été traitées avec 200 uM H 2 O 2, et le changement de DCF de fluorescence a été évaluée. Une augmentation de la fluorescence DCF reflète l'augmentation des niveaux de ROS lors de H 2 O 2 de traitement (E). L'analyse quantitative des changements dans la fluorescence DCF, avant et après H 2 O 2 de traitement, est montré dans le panneau de F. Échelle bar = 10 um Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi Direct imagerie cellulaire des neurones corticaux dans TMRM avant et après addition FCCP utilisant l'objectif 40X. L'intensité pseudo montre un maximum (jaune vif, avant l'addition FCCP) et a diminué (de couleur rouge, après addition FCCP) TMRM intensité de fluorescence après ajout FCCP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">Cliquez ici pour voir la vidéo</a> Vidéo. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi Direct imagerie cellulaire du DCF dans les neurones corticaux, avant et après H 2 O 2 en utilisant plus objectif 40X. La base de fluorescence a DCF lumière de couleur verte dans les corps cellulaires et H2O2 ajout augmente le DCF l'intensité de fluorescence à la couleur vert vif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">Cliquez ici pour voir la vidéo</a>

<ol><li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+%28AICD%29+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li>
<li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%3A+implication+for+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li>
</ol>

Nous avons présenté une procédure étape par étape décrivant comment déterminer ΔΨm et ROS dans les neurones corticaux de rat en utilisant les indicateurs fluorescents TMRM et H 2 DCF-DA, respectivement. Pour d&#39;autres types cellulaires, il est important de déterminer empiriquement la concentration finale et le temps de chargement pour TMRM ou H 2 DCF-DA. En général, la gamme des concentrations de TMRM 20-200 nm, et le temps d&#39;incubation des cellules avec des TMRM varie de 20 à 60 min. La concentration finale de H 2 DCF-DA varie de 2 à 10 uM, et l&#39;incubation des cellules dans une solution de chargement contenant cet indicateur varie de 30-45 min. Il est important pour optimiser la puissance du laser et la vitesse de balayage de prendre les images pour éviter à la fois photo-toxicité pour les cellules et les changements dans l&#39;intensité de fluorescence (par exemple vacillante de TMRM fluorescence) en l&#39;absence de tout stimulus. Les paramètres optimisés optiques devrait se traduire par un signal de fluorescence qui n&#39;est pas plus ou moins saturés (seuil) en l&#39;absence de stimulus. Les conditions optimales pour recueillir les images à partir d&#39;un champ sélectionné à un laser de puissance particulière et une vitesse de balayage sont obtenus lorsque il n&#39;ya pas de changements dans l&#39;intensité de fluorescence de la sonde en l&#39;absence de tout stimulus pendant 10-15 min d&#39;imagerie en temps réel. Autres sondes de fluorescence pour déterminer ΔΨm comprennent la rhodamine 123 et tétra méthyl ester éthylique de la rhodamine (TMRE). Cependant, ils ont été trouvés pour inhiber les processus respiratoires en 2 mitochondries isolées. Surtout, TMRM n&#39;a aucun effet sur ​​la respiration mitochondriale à de faibles concentrations 2 et a phototoxicité faible et photoblanchiment 3 par rapport à d&#39;autres sondes. H 2 DCF-DA est un bon indicateur de ROS comme elle est bien conservée dans les cellules et reconnaît espèces oxydantes de plusieurs, tels que les peroxydes, oxydes super, et l&#39;oxyde nitrique 4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Boîte de culture à fond de verre </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF-DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

détermination des espèces d&#39;oxygène potentiel membrane mitochondriale et réactive dans les neurones corticaux de rat en direct

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm) est essentiel pour maintenir la fonction physiologique de la chaîne respiratoire pour produire l&#39;ATP. Une perte importante de ΔΨm rend les cellules épuisées d&#39;énergie avec la mort subséquente. Espèces réactives de l&#39;oxygène (ERO) sont importantes molécules de signalisation, mais leur accumulation dans des conditions pathologiques conduit au stress oxydatif. Les deux principales sources de ROS dans les cellules sont des toxines environnementales et le processus de phosphorylation oxydative. Dysfonction mitochondriale et le stress oxydatif ont été impliqués dans la physiopathologie de nombreuses maladies et, par conséquent, la capacité de déterminer ΔΨm et ROS peuvent fournir des indices importants sur l&#39;état physiologique de la cellule et la fonction des mitochondries. Plusieurs sondes fluorescentes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) peut être utilisée pour déterminer Δψm dans une variété de types de cellules, et de nombreux indicateurs de fluorescence (Dihydroethidium, dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) peut être utilisée pour déterminer les ROS . Presque toutes les sondes de fluorescence disponibles utilisés pour évaluer ΔΨm ou ROS sont une seule longueur d&#39;onde des indicateurs, qui augmentent ou diminuent leur intensité de fluorescence proportionnelle à un stimulus qui augmente ou diminue les niveaux de ΔΨm ou ROS. Ainsi, il est impératif de mesurer l&#39;intensité de fluorescence de ces sondes au niveau basal et après l&#39;application d&#39;un stimulus spécifique. Cela permet de déterminer le pourcentage de changement dans l&#39;intensité de fluorescence entre le niveau de référence et un stimulant. Ce changement dans l&#39;intensité de fluorescence reflète le changement dans les niveaux relatifs de ΔΨm ou ROS. Dans cette vidéo, nous démontrons comment appliquer l&#39;indicateur de fluorescence, TMRM, chez le rat neurones corticaux de déterminer le pourcentage de variation de l&#39;intensité de fluorescence TMRM entre le niveau de base et après l&#39;application FCCP, un découplant mitochondrial. Les niveaux inférieurs de la fluorescence TMRM résultant du traitement FCCP refléter la dépolarisation du potentiel de membrane mitochondriale. Nous montrons aussi comment appliquer la fluorescence de sonde H 2 DCF-DA pour évaluer le niveau de ROS dans des neurones corticaux, d&#39;abord au départ et puis après application de H 2 O 2. Ce protocole (avec des modifications mineures) peuvent être également utilisés pour déterminer les changements dans ΔΨm et ROS dans différents types cellulaires et dans les neurones isolés à partir d&#39;autres régions cérébrales.

Nous démontrons l&#39;application de l&#39;indicateur de fluorescence, TMRM, dans les neurones corticaux de déterminer les changements relatifs d&#39;intensité de fluorescence TMRM avant et après application d&#39;un stimulus spécifique. Nous montrons aussi l&#39;application de la fluorescence de la sonde H<sub&gt; 2</sub&gt; DCF-DA pour évaluer le niveau relatif des espèces réactives de l&#39;oxygène dans les neurones corticaux.

Détermination des espèces d&#39;oxygène Potentiel membrane mitochondriale et réactive dans les neurones corticaux de rat en direct

Le potentiel de membrane mitochondriale (&Delta;&Psi;m) est essentiel au maintien de la fonction physiologique de la chaîne respiratoire pour la génération d'ATP. Un ...

L'objectif de cette procédure est de déterminer le potentiel membranaire mitochondrial et les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène dans des neurones corticaux primaires à l'aide des sondes fluorescentes TMRM et H2DCFDA, respectivement. Cela est réalisé en préparant tout d'abord les concentrations stock et de travail du TMRM et de l'H2DCFDA. La deuxième étape consiste à incuber les neurones corticaux avec le TMRM et l'H2DCFDA à température ambiante pendant 45 minutes dans un tampon Thai roads.La troisième étape consiste à imager l'intensité de fluorescence de TMRM et de DCF dans des neurones corticaux vivants en utilisant respectivement une excitation émission de 5 15 5 17 nanomètres et de 4 88 5 15 nanomètres. Les variations de la fluorescence de TMR seront surveillées en présence du découplant mitochondrial FCCP, tandis que les variations de la fluorescence de DCF seront observées en présence de peroxyde d'hydrogène. La dernière étape de cette procédure est la collecte, la normalisation et l'analyse des données.En fin de compte, les résultats sont obtenus en traçant un graphique montrant les niveaux relatifs d'intensité de fluorescence de TMRM et de DCF avant et après traitement par FCCP et peroxyde d'hydrogène, respectivement. Bonjour, je suis Joanna Koska. Bienvenue dans mon laboratoire à l'Université Loyola de Chicago.Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment mesurer le potentiel de membrane mitochondrial et les espèces réactives de l'oxygène dans des neurones corticaux de rat. La procédure sera démontrée par dhi. Bonjour, je suis Denise Jossi.À l'aide de cette procédure, le potentiel membranaire mitochondrial peut être mesuré au niveau d'une étiquette mitochondriale unique et les espèces réactives de l'oxygène au niveau d'une étiquette cellulaire unique. Commençons donc. Préparez un stock de 10 millimolaire de TMRM en dissolvant cinq milligrammes de TMRM dans un millilitre de diméthylsulfoxyde anhydre, puis vortexez pendant une minute.Ensuite, faites des aliquotes et conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Protégez-les de la lumière et utilisez-les dans un délai d'un mois. Préparez ensuite un stock de 10 millimolaire de H 2D CFDA en dissolvant 4,87 milligrammes de H 2D CFDA dans un millilitre de diméthylsulfoxyde anhydre.De la même manière, vortexer pendant une minute, puis effectuer des aliquotes et les conserver à moins 20 degrés Celsius. Protéger de la lumière et utiliser dans la semaine pour charger d'abord les neurones corticaux de rat avec le TMRM. Laver les neurones en culture trois fois avec le tampon de Tyrode.Préparez ensuite 20 nanomolaires de TMRM en diluant 1000 fois le stock de TMRM 10 millimolaire dans du tb. Ajoutez ensuite deux microlitres du TMRM dilué par millilitre de tb. Incubez les neurones avec le TMRM pendant 45 minutes à l'abri de la lumière et à température ambiante.Après 45 minutes, monter la boîte de culture sur la platine du microscope et commencer l'acquisition d'images pour charger les neurones corticaux de rat avec le H2DCFDA, puis laver les neurones en culture trois fois avec du tb. Préparer ensuite une solution de H2DCFDA à deux micromoles en diluant 10 fois la solution mère de H2DCFDA à 10 millimoles dans du tb. Ajouter ensuite deux microlitres de H2DCFDA dilué par millilitre de tb.Ensuite, incuber les neurones avec le H 2D CFDA pendant 45 minutes à l'obscurité et à température ambiante après 45 minutes. Rincer les neurones quatre fois avec du TB pour éliminer l'indicateur fluorescent en excès avant d'acquérir des images afin d'effectuer une imagerie en temps réel des neurones incubés avec le TMRM par microscopie confocale à balayage laser, en utilisant le programme de séries temporelles en direct. Appliquer une résolution faible et une puissance laser atténuée afin de minimiser le temps nécessaire à l'acquisition des images et d'éviter le photoblanchiment.Ensuite, ajustez le focus des neurones montés chargés de TMRM en utilisant la lumière réfléchie. Examinez la fluorescence du TMRM par une illumination à cinq 14 nanomètres et une détection à cinq 70 nanomètres. Réglez le gain de détection de la caméra légèrement en dessous du niveau de saturation une fois tous les paramètres fixés, notamment la résolution, la puissance du laser, le gain de la caméra et l'intervalle de prise de vue en laps de temps pour obtenir les images.Ne modifiez pas ces paramètres entre les expériences. Ensuite, changez le champ. Commencez à acquérir des images pour tester les modifications du stimulus delta PSY M, par exemple en appliquant une micromolaire de FCCP ou deux microgrammes par millilitre d'oligomycine, ce qui entraînera respectivement une dépolarisation ou une hyperpolarisation marquée du potentiel membranaire mitochondrial.Ces modifications se traduiront par une diminution de l'intensité de fluorescence du TMRM par rapport à l'intensité de fluorescence de base dans le cas du FCCP, ou par une augmentation de l'intensité de fluorescence du TMRM. Dans le cas d'une LIGA myin, pour réaliser un imagerie en direct de neurones incubés avec H2DCFDA, monter tout d'abord la boîte de culture sur la platine d'un microscope et régler la mise au point des cellules à l'aide de la lumière réfléchie. Observer la fluorescence DCF par excitation à 488 nanomètres et émission à 515 nanomètres.Ensuite, réglez la puissance du laser à entre 5 et 7 % pour détecter un gain et une résolution de 256 par 256. N'ajustez pas ces paramètres entre les expériences. Réglez ensuite la fréquence d'acquisition des images en direct.À l'aide du programme de séries temporelles, sélectionnez un nouveau champ et commencez l'acquisition d'images afin de détecter les variations des niveaux de ROS. Traitez les cellules avec 100 à 200 micromolaire de peroxyde d'hydrogène. Cela se traduira par une augmentation de l'intensité de la fluorescence DCF par rapport au niveau de base.Utilisez l'outil de région d'intérêt du programme LSM pour sélectionner les zones. Ensuite, choisissez des ROI à partir des régions mitochondriales ou des ROI provenant de l'ensemble du corps cellulaire dans les cellules imagées, afin de mesurer respectivement les intensités de fluorescence de TMRM ou des ERO.Sélectionnez des régions adjacentes aux cellules. Pour calculer l'intensité de fluorescence du fond, effectuez plusieurs mesures, puis calculez l'intensité moyenne du fond. Soustrayez l'intensité moyenne de fluorescence du fond des intensités moyennes de fluorescence des régions d'intérêt dans chaque cellule pour chaque point temporel à l'aide de Microsoft Excel. Après soustraction de l'intensité du fond, normalisez l'intensité de fluorescence du TMRM ou du DCF à la fluorescence de base.À l'aide de cette formule, utilisez ensuite le programme SigmaPlot pour générer le graphique montrant les variations de l'intensité de fluorescence au fil du temps. Voici un exemple d'image de fluorescence de neurones corticaux de rat incubés avec du TMRM. L'ajout de l'agent désaccoupleur mitochondrial F-C-C-P-A entraîne une dépolarisation mitochondriale et une perte de l'intensité de fluorescence du TMRM.Le niveau de fluorescence TMRM de base reste stable avant l'ajout de FCCP. L'analyse quantitative des variations de la fluorescence TMRM au fil du temps montre une diminution significative de la fluorescence TMRM après l'ajout de FCCP. Voici un exemple d'image de fluorescence de neurones corticaux de rat chargés avec DCF.Le niveau de fluorescence de base du DCF reste inchangé durant les 120 premières secondes avant l'ajout du peroxyde d'hydrogène. L'ajout de peroxyde d'hydrogène entraîne une augmentation de l'intensité de fluorescence du DCF dans les corps cellulaires. Des mesures de fluorescence du DCF en laps de temps révèlent des niveaux stables ayant augmenté après les traitements au peroxyde d'hydrogène.Dans cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser une faible puissance laser et une vitesse de balayage rapide afin d'éviter les artefacts dus au photoblanchiment et à la phototoxicité. Bonne chance avec votre expérience.

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Analyse cytométrique en flux de paramètres mitochondriaux multiples dans des cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leurs dérivés neuronaux et gliaux

La respirométrie à haute résolution couplée à des capteurs de fluorescence détermine la consommation mitochondriale d’oxygène et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le présent protocole décrit une technique pour évaluer la fréquence respiratoire mitochondriale et la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé.

Évaluation de la fonction mitochondriale dans le nerf sciatique par respirométrie à haute résolution

Cette technique décrit un flux de travail efficace pour visualiser et mesurer quantitativement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde dans les cellules HeLa à l’aide de l’imagerie en direct basée sur la fluorescence.

Quantification basée sur la fluorescence du potentiel de membrane mitochondriale et des niveaux de superoxyde à l’aide de l’imagerie en direct dans les cellules HeLa

Le réseau mitochondrial est extrêmement complexe, ce qui le rend très difficile à analyser. Un nouvel outil MATLAB analyse les mitochondries confocales en direct dans des images timelapse, mais il en résulte un volume de sortie important nécessitant une attention manuelle individuelle. Pour résoudre ce problème, une optimisation de routine a été développée, permettant une analyse rapide des fichiers.

Analyse automatisée optimisée de la modulation de l’homéostasie des mitochondries neuronales vivantes par des récepteurs d’acide rétinoïque spécifiques aux isoformes

Ce protocole présente un flux de travail pour la propagation, la différenciation et la coloration de cellules SH-SY5Y en culture et de neurones primaires de l’hippocampe de rat pour la visualisation et l’analyse de l’ultrastructure mitochondriale à l’aide de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED).

Utilisation de l’imagerie STED de cellules vivantes pour visualiser l’ultrastructure de la membrane interne mitochondriale dans des modèles de cellules neuronales

Dans cette étude, nous décrivons un protocole étape par étape et mettons l’accent sur les détails clés pour déterminer les caractéristiques morphologiques des mitochondries dans les cellules vivantes, y compris la préparation des échantillons, l’acquisition d’images et l’analyse des données. Cette méthode est couramment utilisée pour examiner la morphologie mitochondriale afin d’étudier diverses conditions.

Détermination de la morphologie mitochondriale dans des cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale

Nous présentons une méthode non invasive et en temps réel pour surveiller la santé mitochondriale à l’aide de la spectroscopie Raman par résonance (RRS). Nous avons utilisé le RRS pour quantifier les états redox mitochondriaux et développé une métrique de la santé mitochondriale, le rapport mitochondrial réduit par résonance Raman (3RMR), qui montre une réponse plus rapide aux variations d’oxygénation que les analytes hémato-gaz traditionnels.

Évaluation en temps réel et non invasive de la fonction mitochondriale à l’aide de la spectroscopie Raman par résonance

Découvrez comment mesurer le potentiel membranaire mitochondrial et les espèces réactives de l'oxygène dans les neurones corticaux de rat en utilisant les sondes fluorescentes TMRM et H2D CFDA. Cette méthode permet d'évaluer la fonction mitochondriale et le stress oxydatif en temps réel.

Détermination des espèces d'oxygène Potentiel membrane mitochondriale et réactive dans les neurones corticaux de rat en direct

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