Un système de culture de cellules épithéliales de l'iris Pigment étudier la régénération Lens Newt

L'objectif général de cette procédure est de cultiver des cellules de l'épithélium pigmenté de l'iris afin d'étudier la régénération du cristallin chez la triton. Cela est réalisé en anesthésiant d'abord un triton dans une solution anesthésiante, puis en prélevant les yeux.

La deuxième étape de la procédure consiste à isoler les cellules épithéliales pigmentées de l’iris à partir du tissu oculaire en retirant d'abord le tissu rétinien, puis en découpant les fragments de l’iris cornéen en moitiés dorsale et ventrale. Les cellules de l’iris sont ensuite séparées du stroma et cultivées in vitro pendant deux semaines. Après deux semaines de Turing, les cellules EPI sont agrégées puis implantées dans un nouvel hôte qui a été lin optimiz.

Après un mois de cicatrisation, l'histologie révèle le potentiel de régénération du cristallin par les cellules de l'épithélium pigmenté de l'iris (IPE) dorsales et ventrales. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle aux étapes de culture cellulaire et d'implantation, difficiles à apprendre car elles exigent une bonne centaine de compétences en microdissection et en chirurgie. Commencez par anesthésier au moins sept souris nues avec 0,1 % d'Ethel trois amino benzoate méthane sul acid, puis retirez chirurgicalement leurs yeux à l’aide de pinces et de ciseaux chirurgicaux en coupant la paupière ainsi que la conjonctive. Ensuite, sectionnez le nerf optique.

Transférez maintenant rapidement les yeux disséqués sous une hotte et stérilisez-les dans de l'éthanol de Lugol pendant trois secondes. Lavez ensuite les yeux deux fois dans une solution de Hank sans calcium ni magnésium. Transférez-les dans du Hank frais et poursuivez la dissection.

À l’aide d’un scalpel, faire une incision dans l’œil. Puis, utiliser des ciseaux pour découper tout autour de la marge cornéenne. Retirer le cristallin et sectionner le tissu rétinien restant ainsi que la sclérotique.

Transférez les complexes irido-cornéens dans une boîte de Pétri contenant du Hanks frais à l’aide d’un scalpel n°15. Séparez les complexes en leurs moitiés dorsale et ventrale. Les iris dorsal et ventral sont identifiés par la présence de taches noires sur la sclère du côté dorsal, et par une incision en forme de V sur l’iris ventral.

Séparez l’iris ventral de l’iris dorsal. Ramassez les fragments d’iris dans une boîte de 35 millimètres contenant un millilitre de solution L 15. Conservez les moitiés dorsale et ventrale dans des boîtes séparées.

Ajoutez maintenant 150 microlitres de solution dispa dans les boîtes, puis incubez-les pendant deux heures à 27 degrés Celsius. Pour recueillir les cellules IPE à partir du stroma. À l’aide de pinces, détachez délicatement les cellules IPE de tous les fragments de tissu recueillis.

Ensuite, transférez les cellules IPE dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez à 1000 RP M pendant deux minutes à température ambiante, puis jetez le surnageant. Resuspendez le culot dans un millilitre de solution de Hanks, puis répétez la centrifugation pour séparer les cellules. Éliminez la solution de Hanks et resuspendez le culot.

Dans un millilitre d'une solution de trypsine au 1/250, incuber pendant deux heures à 27 degrés Celsius, puis laver les cellules par centrifugation et éliminer la trypsine. Ajouter un millilitre de solution L 15 et centrifuger à nouveau ; répéter une fois le lavage, puis remplacer par 800 microlitres de solution L 15 fraîche, et resuspendre délicatement les cellules en solution. Ensuite, ensemencer les cellules dans des plaques de 24 puits revêtues de collagène.

Le rendement habituel à partir de sept Ns est de quatre puits de cellules dorsales et de quatre puits de cellules ventrales. Incuber la boîte pendant deux semaines à 27 degrés Celsius après deux semaines. On observe ici que l’IPE peut être transfecté par des gènes afin d’en étudier la fonction dans la régénération du cristallin.

Cette culture de deux semaines de cellules IPE ventrales présente la même morphologie que les cellules dorsales. Notez que la pigmentation persiste à ce stade dans les cellules de l'iris dorsales et ventrales. Avant d'implanter les cellules IPE, elles doivent être agrégées en ajoutant 20 microlitres de dyse dans 400 microlitres de milieu de culture frais aux cellules, en agitant doucement la plaque et en laissant les cellules toute la nuit dans un incubateur à 27 degrés Celsius.

Le lendemain, utiliser un pipettage doux pour détacher les cellules, puis les transférer dans des tubes de 1,5 millilitre. Laver ensuite les cellules par centrifugation des tubes et remplacement du surnageant par un millilitre de L 15. Répéter cette étape deux fois. Utiliser 10 microlitres de la suspension cellulaire pour calculer le nombre de cellules selon les méthodes standard.

Une fois le calcul effectué, préparez de 3 000 à 5 000 cellules dans 200 microlitres de L-15 par agrégat. Faites maintenant centrifuger les cellules et incubez-les pendant 48 heures. À 27 degrés Celsius, les cellules peuvent désormais être implantées dans un animal receveur.

Commencez par anesthésier un adulte nouveau dans la solution de repos jusqu'à ce qu'il cesse de bouger. Utilisez ensuite une lame de scalpel pour pratiquer une incision dans la cornée de l'œil. Puis, à l'aide de pinces, retirez le cristallin.

Après avoir retiré le cristallin, placez l'agrégat de cellules IPE juste en dessous du tissu cornéen sur la face ventrale de l'œil. Replacez maintenant le triton dans un récipient séparé et laissez-le cicatriser. Pendant ce temps, manipulez le triton avec précaution afin d'éviter d'endommager le tissu en voie de guérison.

Les cellules transplantées nécessitent un mois pour régénérer un nouveau cristallin. Une fois le mois écoulé, retirez les nouveaux yeux implantés avec les cellules agrégées et fixez le tissu. À l’aide d’un protocole de déshydratation standard, le tissu fixé peut être inclus dans des moules d’inclusion adaptés à la coupe de sections de 15 micromètres, puis découpé et coloré de manière appropriée.

Après l'implantation d'un agrégat dans un œil nouvellement régénéré, l'agrégat provenant des cellules épithéliales de l'iris dorsales induit la formation d'un nouveau cristallin. L'induction du cristallin hôte à partir de l'iris dorsal est également observée dans l'œil contenant l'implant ventral. Aucune induction du cristallin n'est observée à partir de l'agrégat préparé à partir des cellules épithéliales de l'iris ventrales ; toutefois, lorsque le gène six three est surexprimé en présence d'acide rétinoïque, une induction du cristallin est observée à partir de l'agrégat ventral.

En outre, l'induction du cristallin hôte à partir de l'iris dorsal de l'œil est observée après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération du cristallin pour explorer le rôle de différents gènes dans une nouvelle perspective.