Name: Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Découvrez une méthode rapide de culture en goutte pendante pour générer des sphéroïdes 3D. Cette technique permet d'étudier les interactions cellule-cellule et d'évaluer la cohésion des agrégats en biologie cellulaire.

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L&#39;auteur aimerait remercier le Dr Dongxuan Jia pour l&#39;assistance technique. Certaines des images figurant dans le présent article ont été en collaboration avec le Dr Malcolm S. Steinberg, Département de Biologie Moléculaire, Université de Princeton. L&#39;auteur tient également à remercier le ministère de la Défense de la prostate Cancer Research Programme (subventions PC-030482-991552 et PC) et le pour le NCI / NIH (subvention R01CA118755) leur généreux soutien.

1. Préparation d'une suspension cellulaire unique <ol><li> Cultures de cellules adhérentes doivent être cultivés à 90% de confluence, les monocouches quoi doivent être rincés deux fois avec du PBS. Après la vidange bien, ajoutez 2 ml (pour les plaques de 100 mm) de 0,05% de trypsine-1 mM EDTA, et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détacher. Arrêtez trypsinisation en ajoutant 2 ml de milieu complet et doucement l'utilisation d'une pipette 5 ml de triturer le mélange jusqu'à cellules sont en suspension. Transfert des cellules dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Ajouter 40 ul d'un stock de 10 mg / ml de DNAse et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Brièvement au vortex et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. </li><li> Rejeter le surnageant et laver culot avec 1 ml de culture de tissus milieu complet. Répéter, puis remettre les cellules en 2 ml de milieu de culture de tissu complet. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre, ou un compteur de cellules automatisé et d'ajuster la concentration de 2,5 x 10 6 cellules / ml. Pour cette démonstration, une BioRad TC10 compteur de cellules automatisé a été utilisé. </li></ol> 2. Formation de gouttes suspendues. <ol><li> Retirez le couvercle d'une boîte de culture de tissu de 60 mm et placer 5 ml de PBS dans le fond du plat. Ceci agira comme une chambre de l'hydratation. </li><li> Inverser le couvercle et l'utilisation d'une pipette 20 ul de déposer 10 gouttes ul sur le fond du couvercle. Assurez-vous que des gouttes sont placées suffisamment éloignés afin de ne pas toucher. Il est possible de placer au moins 20 gouttes par plat. </li><li> Inverser le couvercle sur le PBS-remplie chambre inférieure et incuber à 37 ° C CO / 5% 2 / 95% d'humidité, de surveiller l'gouttes par jour et incuber jusqu'au feuilles cellule soit ou agrégats sont formés. Un microscope stéréo peut être utilisé pour évaluer la formation d'agrégats. </li><li> Une fois la forme des feuilles, ils peuvent être transférés à fond rond en verre Agitateur flacons contenant 3 ml de milieu complet et incubés dans un bain d'eau agité à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à la formation de sphéroïdes. </li></ol> 3. Remarques <ol><li> Selon la taille des cellules, la concentration peut être ajusté en amont ou vers le bas. </li><li> Les cellules peuvent être colorées avec membrane intercalant des colorants fluorescents avant la formation de goutte suspendue. </li><li> Deux différents types de cellules peuvent être différemment colorés et mélangés dans un rapport de 1:1 (ou autre) Le ratio avant la formation de gouttes suspendues. Elles peuvent être des cellules cancéreuses et stromales, les tissus embryonnaires, ou cellules génétiquement modifiées pour avoir des signatures adhésive spécifique. </li><li> Les cellules peuvent se détacher de boîtes de culture tissulaire en utilisant la trypsine 0,05% / 2 mM de calcium afin de préserver la fonction cadhérine. </li><li> Selon l'expérience, la taille des feuilles peut être mesurée, ou des agrégats peuvent être utilisés pour les essais mécaniques ou pour l'analyse biochimique ou moléculaire. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Fiche ou formation sphéroïde se produit généralement dans les 24 heures, mais peut prendre plus de temps selon le type de cellule. La figure 1 représente des images capturées après 18 heures d'incubation du cancer de la prostate non traité MAT-LyLu (MLL), les cellules de culture en suspension de chute (figure 1A) ou des cellules traitées avec l'inhibiteur de MEK 25 um PD98059. Notez que les résultats du traitement Meki dans un compactage marqués de la feuille de cellule. Le compactage peut être quantifiée en mesurant la taille de 10-20 (ou plus) des gouttes pendantes et en comparant la taille moyenne entre les groupes de traitement. Nous généralement d'analyser les images en utilisant le logiciel ImageJ par seuillage chaque image puis en convertissant les images en mode binaire, après quoi nous appliquons l'analyse des particules de révéler la zone de l'image totale, en pixels. Cela peut ensuite être facilement converti en microns carrés. La figure 2 représente une comparaison de taille pour les cellules non traitées et MLL Meki-traitée. Comme indiqué, le traitement réduit significativement la taille Meki feuille par rapport à t de Student-test (p &lt;0,0001). Pour cette comparaison, 10 pour chacune des agrégats de cellules traitées et non traitées ont été mesurés. La figure 3 représente un sphéroïde de foie de poulet embryonnaire formé après 24 heures dans la culture suspendus chute et 2 jours dans un bain de shaker. Le dosage de goutte suspendue peut également être modifié pour inclure plus d'un type cellulaire pour révéler le positionnement spatial adopté. Par exemple, les cellules de poulet foie embryonnaire peut être isolé, colorées avec une lampe fluorescente à membrane intercalant colorant et mélangé avec des cellules chiches coeur embryonnaire qui ont été colorés avec un marqueur fluorescent différent. Montre la figure 4A que plutôt que de rester entremêlés, les cellules du foie et le cœur ont tendance à «trier-out" d'un autre-et à adopter une sphère-dans-un-sphère configuration dans laquelle les cellules cardiaques sont enveloppés par des cellules du foie. Cette configuration peut être expliquée par les différences dans l'adhésion intercellulaire entre les cellules du foie et du cœur. Ce concept est codifié dans l'hypothèse adhésion différentielle qui a été utilisé pour expliquer le comportement de tri cellulaire entre les tissus embryonnaires pour la couche germe d'amphibiens et de poissons téléostéens 3 4 embryons, pour l'organisation des cellules des îlots pancréatiques 5 et pour la cellule de tri entre deux populations de cellules identiques in ce qui concerne tous les autres que pour les niveaux d'expression de même type de cadhérine (6 et la figure 4B). Ce résultat est particulièrement important pour démontrer comment une simple différence d'ingénierie de l'adhérence entre les populations cellulaires peut entraîner la génération de la structure des organes, par exemple, un îlot 5 pancréatiques. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Images de cellules incubées en culture en suspension déposer pendant 18 heures soit en l'absence (A) ou en présence (B) de 25 microns de l'inhibiteur de MEK PD98059. Les images ont été capturées à l'aide d'un Nikon Eclipse TE 300 microscope à épifluorescence et un Photometrics Coolsnap ES appareil photo numérique. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Quantification de Meki-induites chez le rat compactage des cellules de la prostate MLL cancer. Cultures de cellules goutte suspendue MLL non traitées et traitées à Meki ont été incubées pendant 18 heures, après quoi la taille des agrégats a été déterminée comme décrit ci-dessus. L'analyse statistique de la taille des agrégats a été par la Student t-test. L'astérisque représente une différence statistiquement significative de la taille globale (p &lt;0,0001) entre les cellules non traitées et traitées à Meki et suggère que les résultats de Meki-traitement dans les agrégats nettement plus petit et plus compact. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Un sphéroïde formé en incubant les cellules du foie de poulet embryonnaire en culture en suspension déposer pendant 18 heures puis dans un incubateur / secousses de bain pour 48 heures. Cette image a été capturée à l'aide d'un microscope Nikon stéréo SMZ800 et une caméra CCD Sony Noire. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Hanging culture déposer révèle le tri-out comportement entre différents types cellulaires. Dans la partie A, les cellules de poulet foie embryonnaire ont été colorées avec un colorant intercalant PKH-2 membrane et mélangés dans des proportions égales avec PKH-26 cellules chiches tachés coeur embryonnaire. Dans le panel B, deux N-cadhérine-clones cellulaires transfectées L (LN4 et LN2a), exprimant la N-CAD à leurs surfaces dans le ratio de 2,4:1, ont également été colorés avec des colorants fluorescents membrane intercalant PKH-2 et PKH-26 (Sigma-Aldrich), mélangés dans des proportions égales et cultivées comme des gouttes pendantes 7. Après 18 heures de culture, des feuilles de cellules ont été transférées à des flacons secouant et incubé pendant 48 heures. Agrégats ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 2% dans un tampon phosphate salin et visualisées avec un système laser BioRad MRC600 microscope confocal à balayage attaché à un Nikon Optiphot-2 microscope. Sections optiques des deux canaux vert et rouge ont été recueillis et une Silicon Graphix Crimson VGX poste de travail équipé de Vital Images Voxel Ultra View logiciel d'imagerie a été utilisée pour attribuer des fausses couleurs pour les deux canaux et de fusionner les images, révélant des configurations anatomiques générées (A). confocale section optique grâce à un enveloppement global démontrant des cellules cardiaques (ici en jaune pseudo-couleurs) par les cellules du foie dans pseudocolor bleu (de 8). (B) l'article optique confocal par un enveloppement global démontrant de haute N-cadhérine des cellules exprimant (vert) par ceux qui expriment des niveaux inférieurs de la N-cadhérine (en rouge) (à partir de 6).

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<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).</li>
</ol>

Des études ont montré que les cellules en culture dans un contexte en trois dimensions (3D) produit distinctes morphologie cellulaire et de signalisation par rapport à une démarche rigide en deux dimensions du système de culture (2D) 9. Par exemple, des gels de collagène des fibroblastes peuplées de démontrer que la morphologie des fibroblastes en 3D est tout à fait distincte de celle observée en 2D 10,11. De même, la culture 3D peut induire tissu-spécifique de différenciation des cellules épithéli...

<ul><li> compteur de cellules automatique (BioRad TC10) </li><li> secouant bain d&#39;eau avec du CO 2 Modèle couvercle de pignon 3540 (Lab-line) </li></ul>

un protocole simple hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3d

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Les études sur la cohésion de cellule à cellule et cellule-substrat d&#39;adhérence ont historiquement été réalisées sur des cultures en monocouche adhérente sur des substrats rigides. Cellules dans un tissu, cependant, sont généralement enfermés dans une masse de tissu très dense dans lequel les cellules d&#39;établir des connexions intimes avec de nombreux quasi-voisins et avec des composants de la matrice extracellulaire. En conséquence, le milieu chimique et les forces physiques vécus par les cellules dans un tissu 3D sont fondamentalement différentes de celles vécues par les cellules en culture monocouche. Cela a été démontré que l&#39;impact nettement la morphologie cellulaire et de signalisation. Plusieurs méthodes ont été conçues pour générer des cultures cellulaires en 3D, y compris l&#39;encapsulation des cellules dans une des gels de collagène ou biomatériau échafaudages 2. Ces méthodes, bien qu&#39;utile, ne pas rappeler les intimes architecture Direct adhérence cellule-cellule dans les tissus normaux. Plutôt, ils plus étroitement les systèmes de culture approximative dans laquelle des cellules individuelles sont vaguement dispersés au sein d&#39;un maillage 3D de produits d&#39;ECM. Ici, nous décrivons une méthode simple dans lequel les cellules sont placées dans la culture suspendus baisse et incubés dans des conditions physiologiques jusqu&#39;à ce qu&#39;ils forment vraie sphéroïdes 3D dans lequel les cellules sont en contact direct avec eux et avec les composants de la matrice extracellulaire. La méthode ne nécessite pas d&#39;équipement spécialisé et peut être adapté pour inclure plus d&#39;un agent biologique en très petites quantités qui peuvent être d&#39;intérêt à élucider les effets sur la cellule-cellule ou cellule-ECM interaction. La méthode peut également être utilisé pour la co-culture de deux (ou plusieurs) des populations de cellules différentes, afin d&#39;élucider le rôle des interactions cellule-cellule ou cellule-ECM en précisant les relations spatiales entre les cellules. Cellule-cellule et cellule-cohésion ECM d&#39;adhésion sont les pierres angulaires d&#39;études du développement, de l&#39;interaction de cellules embryonnaires de tumeurs stromales malignes dans l&#39;invasion, la cicatrisation, et pour les applications d&#39;ingénierie tissulaire. Cette méthode simple vous fournir un moyen de générer des tissus tels que les agrégats cellulaires pour la mesure des propriétés biomécaniques ou pour l&#39;analyse moléculaire et biochimique dans un modèle physiologiquement pertinents.

Nous décrivons une méthode simple et rapide de générer des tissus 3D-like sphéroïdes et leur application potentielle de quantifier les différences dans les interactions cellule-cellule.

Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Les études sur la cohésion cellule-cellule et l'adhésion cellule-substrat ont historiquement été réalisées sur des cultures en monocouche adhérentes à des substrats rigides. Les cellules ...

L'objectif de cette expérience est de générer des tissus tridimensionnels semblables à des stéroïdes. Cela est réalisé en premier lieu en récoltant des cellules cultivées, puis en générant une suspension monocellulaire. Ensuite, des gouttes de la suspension cellulaire sont déposées sur la face inférieure du couvercle inversé d'une boîte de culture tissulaire.Ensuite, le couvercle est retourné et placé sur la chambre d'hydratation. La dernière étape consiste à incuber les gouttes suspendues pendant 24 à 48 heures afin de permettre la formation d'agrégats. Ceux-ci peuvent ensuite être transférés dans un bain-marie agité et incubés jusqu'à cinq jours supplémentaires.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des différences dans la cohésion des agrégats ou le tri cellulaire grâce à des tests de compaction, à l'analyse de la symétrie de la surface tissulaire ou à la microscopie à épifluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la culture tissulaire conventionnelle en 2D par exemple, est que les cellules cultivées en 3D imitent plus étroitement les interactions cellulaires auxquelles les cellules sont soumises dans un environnement tissulaire. Je vais démontrer cette méthode pour vous montrer qu'elle est si simple que même un directeur de recherche peut la réaliser.Pour commencer cette expérience, récoltez les cellules adhérentes à 90 % de confluence. Commencez par aspirer le milieu de culture et rincez la couche cellulaire deux fois avec du PBS. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez deux millilitres de trypsine 0,05 % dans une solution d’EDTA sur la monocouche.Placer la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et incuber jusqu'à ce que les cellules se détachent. Ensuite, retirer la plaque de l'incubateur et arrêter l'incubation. Ajouter deux millilitres de milieu complet.Utilisez une pipette de cinq millilitres pour triturer le mélange jusqu'à ce que les cellules soient complètement en suspension. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez 40 microlitres d'une solution d'ADN à 10 milligrammes par millilitre dans la suspension cellulaire, puis incubez à température ambiante pendant cinq minutes après l'incubation.Vortexez brièvement la suspension cellulaire, puis centrifugez à 200 ×g pendant cinq minutes. Une fois la centrifugation terminée, aspirez le surnageant S et jetez-le, puis resuspendez le culot dans un millilitre de milieu complet pour le laver. Répétez la centrifugation et resuspendez à nouveau le culot dans un millilitre de milieu complet.Ensuite, effectuez un dénombrement cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémo-cytomètre. Ajustez la suspension cellulaire avec du milieu pour obtenir une concentration finale de 2,5 × 10⁶ cellules par millilitre. Puis, passez à la formation de gouttes suspendues.Préparez une chambre d'hydratation en retirant le couvercle d'une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres et en pipetant cinq millilitres de PBS au fond de la boîte. Retournez le couvercle de la boîte et déposez jusqu'à 2010 microlitres de gouttelettes de suspension cellulaire sur la face inférieure du couvercle. Veillez à espacer suffisamment les gouttelettes pour qu'elles ne se touchent pas.Remettez délicatement le couvercle contenant les cultures en gouttelettes sur le fond de la boîte contenant le PBS. Placez la plaque de culture dans un incubateur à culture tissulaire, réglé à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'humidité, et incubez toute la nuit.Surveillez quotidiennement les gouttes et poursuivez l'incubation jusqu'à la formation de feuillets cellulaires ou d'agrégats. Une fois les feuillets cellulaires ou les agrégats formés, transférez-les dans des flacons en verre à fond rond contenant trois millilitres de milieu complet. Incubez les flacons contenant les feuillets cellulaires ou les agrégats dans un bain-marie agité.Conserver à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant environ 24 heures, jusqu'à ce que la formation de stéroïdes puisse être visualisée au microscope stéréoscopique. Une fois les stéroïdes formés, l'effet de manipulations expérimentales sur la formation de stéroïdes peut être quantifié selon la procédure décrite dans le protocole écrit. En outre, l'intercalation membranaire de tout colorant fluorescent précédemment ajouté peut désormais être visualisée par microscopie de fluorescence.Cette image au microscope en champ clair montre l'agrégation de cellules de cancer de la prostate du rat, lignée MLL, après 18 heures d'incubation selon la méthode de la goutte pendante. Cette image présente un second agrégat de cellules MLL formé après 18 heures de culture par la méthode de la goutte pendante. Ces cellules ont été cultivées en présence de 25 micromolaire de l'inhibiteur de la MEK, PD 9 8 0 5 9, conduisant à un agrégat de cellules nettement plus compact.Ici, on illustre la différence entre la culture en goutte suspendue de MLL traitée par un inhibiteur de MEK, la taille des agrégats et la taille des agrégats témoins non traités. L'astérisque indique une différence statistiquement significative avec une valeur P inférieure à 0,0001. Cette différence, déterminée par le test t de Student entre les agrégats non traités et ceux traités par l'inhibiteur de MEK, suggère que le traitement par l'inhibiteur de MEK conduit à des agrégats significativement plus petits et plus compacts.Cette image a été capturée à l’aide d’un microscope stéréo Nikon Smz 800 et illustre un stéroïde formé par incubation de cellules hépatiques embryonnaires de poulet en culture en goutte pendante pendant 18 heures, puis dans un bain-marie agité à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Cette image de microscopie confocale démontre le comportement d’auto-organisation qui se produit lorsque certaines populations cellulaires sont co-cultivées selon la méthode de la goutte pendante. Avant la culture en goutte pendante, les cellules hépatiques embryonnaires de poulet ont été marquées avec le colorant intercalant de membrane pkh deux et embryonnaires de poulet.Les cellules cardiaques ont été marquées au PKH 26. Les suspensions cellulaires ont ensuite été mélangées et déposées en goutte pendante. Une culture a été réalisée pendant 18 heures, suivie de 48 heures d'incubation dans un bain-marie agité à 37 degrés Celsius.On peut observer sur la coupe optique que les cellules cardiaques colorées en jaune sont enveloppées par des cellules hépatiques. Colorées ici en bleu par pseudo-coloration, deux nardi et des clones de cellules L transfectées exprimant la NCA à leur surface. Dans un rapport de 2,4 pour un, elles ont été marquées avec les colorants fluorescents de membrane PKH2 et PKH26 mélangés en proportions égales, puis cultivées sous forme de gouttes suspendues comme précédemment.Dans cet exemple, les cellules exprimant des niveaux élevés de cadian, colorées artificiellement en vert, sont entourées par celles exprimant des niveaux plus faibles de en cadian, colorées artificiellement en rouge. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes ou moins si elle est effectuée correctement.

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