Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

L'objectif de cette expérience est de générer des tissus tridimensionnels semblables à des stéroïdes. Cette étape est réalisée en premier lieu en récoltant des cellules cultivées, puis en générant une suspension monocellulaire. Ensuite, des gouttes de la suspension cellulaire sont déposées sur la face inférieure du couvercle retourné d'une boîte de culture tissulaire.

Ensuite, le couvercle est inversé sur la chambre d'hydratation. La dernière étape consiste à incuber les gouttes suspendues pendant 24 à 48 heures afin de permettre la formation d'agrégats. Ceux-ci peuvent ensuite être transférés dans un bain-marie agité et incubés jusqu'à cinq jours supplémentaires.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des différences dans la cohésion des agrégats ou le tri cellulaire grâce à des tests de compaction, à l'analyse de la symétrie de la surface tissulaire ou à la microscopie à épifluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la culture tissulaire conventionnelle en 2D par exemple, est que les cellules cultivées en 3D imitent plus fidèlement les interactions cellulaires auxquelles les cellules sont soumises dans un environnement tissulaire. Je vais démontrer cette méthode pour vous montrer qu'elle est si simple que même un directeur de recherche peut la réaliser.

Pour commencer cette expérience, récoltez les cellules adhérentes à 90 % de confluence. Commencez par aspirer le milieu de culture et rincez la couche cellulaire deux fois avec du PBS. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez deux millilitres de trypsine 0,05 % dans une solution d’EDTA sur la monocouche.

Placer la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et incuber jusqu'à ce que les cellules se détachent. Ensuite, retirer la plaque de l'incubateur et arrêter l'incubation. Ajouter deux millilitres de milieu complet.

Utilisez une pipette de cinq millilitres pour triturer le mélange jusqu'à ce que les cellules soient complètement en suspension. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez par pipetage 40 microlitres d'une solution d'ADN à 10 milligrammes par millilitre dans la suspension cellulaire, puis incubez à température ambiante pendant cinq minutes après l'incubation.

Vortexez brièvement la suspension cellulaire, puis centrifugez à 200 fois la gravité pendant cinq minutes. Une fois la centrifugation terminée, aspirez le surnageant S et jetez-le, puis resuspendez le culot dans un millilitre de milieu complet pour le laver. Répétez la centrifugation et reprenez le culot dans un millilitre de milieu complet.

Ensuite, effectuez un dénombrement cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémo-cytomètre. Ajustez la suspension cellulaire avec du milieu pour obtenir une concentration finale de 2,5 × 10⁶ cellules par millilitre. Puis, passez à la formation de gouttes suspendues.

Préparez une chambre d'hydratation en retirant le couvercle d'une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres et en pipetant cinq millilitres de PBS au fond de la boîte. Retournez le couvercle de la boîte et déposez jusqu'à 20 gouttes de 10 microlitres de suspension cellulaire sur la face inférieure du couvercle. Veillez à espacer suffisamment les gouttes pour qu'elles ne se touchent pas.

Remettez délicatement le couvercle contenant les cultures en gouttelettes sur le fond de la boîte contenant le PBS. Placez la plaque de culture dans une incubateur pour culture tissulaire, réglé à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'humidité, et incubez toute la nuit.

Surveillez les gouttes quotidiennement et poursuivez l'incubation jusqu'à la formation de feuillets cellulaires ou d'agrégats. Une fois les feuillets cellulaires ou les agrégats formés, transférez-les dans des flacons en verre ronds à fond plat contenant trois millilitres de milieu complet. Incubez les flacons contenant les feuillets cellulaires ou les agrégats dans un bain-marie agité.

Conserver à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant environ 24 heures, jusqu'à ce que la formation de stéroïdes puisse être visualisée au microscope stéréoscopique. Une fois les stéroïdes formés, l'effet de manipulations expérimentales sur la formation de stéroïdes peut être quantifié selon la procédure décrite dans le protocole écrit. En outre, l'intercalation membranaire de tout colorant fluorescent précédemment ajouté peut désormais être visualisée par microscopie de fluorescence.

Cette image au microscope en champ clair montre l'agrégation de cellules cancéreuses du prostate de rat MLL après 18 heures d'incubation selon la méthode de la goutte pendante. Cette image présente un second agrégat de cellules MLL formé après 18 heures de culture par la méthode de la goutte pendante. Ces cellules ont été cultivées en présence de 25 micromolaire de l'inhibiteur de la MEK PD 9 8 0 5 9, conduisant à un agrégat de cellules nettement plus compact.

Ici, on illustre la différence entre la culture en goutte pendante MLL traitée avec un inhibiteur de MEK, la taille des agrégats et la taille des agrégats témoins non traités. L'astérisque indique une différence statistiquement significative avec une valeur P inférieure à 0,0001. Cette différence, déterminée par le test t de Student entre les agrégats non traités et ceux traités avec l'inhibiteur de MEK, suggère que le traitement par l'inhibiteur de MEK conduit à des agrégats significativement plus petits et plus compacts.

Cette image a été capturée à l’aide d’un microscope stéréo Nikon Smz 800 et illustre un stéroïde formé par incubation de cellules hépatiques d’embryon de poulet en culture en goutte pendante pendant 18 heures, puis dans un bain-marie agité à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Cette image de microscopie confocale démontre le comportement d’auto-organisation qui se produit lorsque certaines populations cellulaires sont co-cultivées selon la méthode de la goutte pendante. Avant la culture en goutte pendante, les cellules hépatiques d’embryon de poulet ont été marquées avec le colorant intercalant de membrane pkh deux et l’embryon de poulet.

Les cellules cardiaques ont été marquées au PKH 26. Les suspensions cellulaires ont ensuite été mélangées et déposées en goutte pendante. Une culture a été réalisée pendant 18 heures, suivie de 48 heures d'incubation dans un bain-marie agité à 37 degrés Celsius.

On peut observer sur la coupe optique que les cellules cardiaques colorées en jaune sont enveloppées par des cellules hépatiques. Colorées ici en bleu artificiellement, deux nardi et des clones de cellules L transfectées exprimant la NCA à leur surface. Dans un rapport de 2,4 pour un, elles ont été marquées avec les colorants fluorescents de membrane PKH2 et PKH26 mélangés en proportions égales, puis cultivées sous forme de gouttes suspendues comme précédemment.

Dans cet exemple, les cellules exprimant des niveaux élevés de cadian, colorées artificiellement en vert, sont entourées par celles exprimant des niveaux plus faibles de en cadian, colorées artificiellement en rouge. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes ou moins si elle est effectuée correctement.