La pressurisation impulsif de cellules neuronales pour l'étude de lésions cérébrales traumatiques

L'objectif général de cette procédure est d'administrer et d'observer une pressurisation impulsionnelle de cellules cérébrales cultivées dans le cadre de l'étude des lésions cérébrales traumatiques. Cela est réalisé en induisant d'abord la différenciation neuronale de cellules cultivées à l'aide d'acide rétinoïque. Ensuite, les cellules neuronales sont placées dans le dispositif de pressurisation cellulaire basé sur le ksky bar et exposées à une pression impulsionnelle d'une intensité et d'une durée pertinentes par rapport aux lésions cérébrales traumatiques induites par explosion.

Enfin, les cellules sont soumises à des tests de biologie moléculaire afin d'évaluer les lésions cellulaires et les mécanismes possibles du traumatisme cérébral. Les résultats de l'analyse microscopique montrent une mort cellulaire neuronale et une perte structurelle des axones des neurites en cas de pressurisation impulsionnelle d'une magnitude de deux mégapascals et d'une durée de 0,7 milliseconde. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la percussion fluidique, est l'absence de phases de pression négative et une durée bien contrôlée.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des traumatismes crâniens (TBI), telles que le seuil de mort ou de lésion des cellules nerveuses en fonction de la pression impulsive, de l'amplitude, de la durée et de la forme de la sollicitation. Bien que cette méthode ait été utilisée jusqu'à présent par notre équipe pour étudier les TBI induits par explosion, elle peut également être appliquée à d'autres types de traumatismes crâniens, comme les TBI induits par impact. La procédure sera démontrée par Matthew, étudiant diplômé du laboratoire du professeur Chen fang, et par li ha, technicienne de mon laboratoire.

Cette expérience utilise un dispositif Ksky configuré comme un appareil de pressurisation cellulaire. L'appareil est constitué de deux barres en alliage d'aluminium de six mètres, suspendues par des roulements en laiton alignés, avec une chambre de pressurisation cellulaire in vitro. Placée entre les barres, la chambre de pressurisation cellulaire est composée d'un cylindre-piston.

Le cylindre présente un petit trou taraudé à la base de la cavité, qui permet d'évacuer l'air et les fluides en excès pendant l'installation de l'échantillon cellulaire. Le piston est fabriqué à partir du même tube que la barre et est enroulé de deux ou trois couches de ruban en téflon. Le capuchon terminal fixe les lamelles de verre à l'aide de deux petites vis en acier inoxydable.

Cette démonstration utilise des cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y. Toutefois, le protocole s'applique à de nombreux modèles cellulaires en culture. Les cellules sont placées sur des lamelles en verre de 18 millimètres de diamètre à une densité de 3000 cellules par centimètre carré.

Dans le DMEM supplémenté, incuber les cellules afin de déclencher leur différenciation en ajoutant de l'acide rétinoïque à 10 micromolaire au milieu pendant sept jours, avec un changement de milieu tous les deux jours. Le septième jour, les cellules présentent une structure axonale de neurite bien développée et sont prêtes à être soumises à une pression. Stériliser toutes les parties de la chambre de pressurisation à l'aide d'un autoclave et les conserver sous lumière UV pendant l'assemblage de la chambre.

Dans une hotte de culture, s'assurer que la vis de ventilation de la chambre est légèrement engagée dans l'orifice de ventilation d'air. À la base de la cavité, remplir la chambre avec un milieu de croissance tiède fraîchement préparé. Ensuite, visser une lame de verre avec cellules cultivées sur le capuchon du piston, les cellules étant orientées vers l'extérieur, puis insérer soigneusement le piston dans la cavité de la chambre.

Retirez la vis de purge, inclinez la purge vers le haut et poussez le piston dans la chambre jusqu'à une ligne de référence déterminée préalablement. Cela laisse une profondeur de fluide d'environ six millimètres dans la chambre de pressurisation de la cellule. Évitez d'introduire des bulles, désinfectez la vis de purge et remettez-la en place afin de rendre la chambre étanche à l'eau.

La chambre ne doit pas présenter de fuite sous la charge statique. Réinitialisez le système de barre Ksky. Replacez la masse lourde dans sa position initiale et remettez en place le boulon de verrouillage.

Le boulon de verrouillage exerce une force de serrage qui empêche tout déplacement de la barre incidente jusqu'à ce que les goupilles soient rompues. Engagez le nouveau boulon de verrouillage à l'aide du vérin hydraulique jusqu'à environ 200 lb/po². Utilisez le cric à ciseaux pour comprimer la section de précharge de la barre incidente à une pression légèrement supérieure à la valeur souhaitée, puis desserrez légèrement pour activer entièrement le frottement de la vis JAK. Réglez maintenant l'acquisition des données, car la pressurisation dure environ une milliseconde.

Fixer une fréquence d'échantillonnage de un mégahertz en utilisant des jauges de contrainte de 2000 ohms dans un circuit en pont de Wheatstone. La tension doit être réglée à 45 volts au niveau de la barre transmise. Monter la chambre de cellule avec le piston tourné vers la barre transmise.

Placer la chambre à cellules dans un bloc en V soutenu par le cric en ciseaux de laboratoire et aligné avec les deux barres. Graisser légèrement chaque interface et éliminer tout air entre les surfaces en contact en les frottant doucement l'une contre l'autre. Le système est désormais amorcé.

Armer l'acquisition des données et effectuer le test en actionnant rapidement le vérin hydraulique du serre-joint. Cela force le boulon de verrouillage à se rompre, provoquant la séparation du serre-joint et la transmission d'une onde de pression aux cellules. Après le test, retirer la lame de la chambre dans une hotte de culture et procéder à l'évaluation du comportement cellulaire.

Avec de l'expérience, l'appareil peut être utilisé pour pressuriser environ neuf lames de culture cellulaire par heure. Lors de l'analyse du signal, des erreurs dues à des bulles d'air peuvent apparaître au début du signal transmis sous forme de barre, mais elles ne sont pas visibles dans cette démonstration.

Si la barre de transmission est suffisamment longue, alors les données les plus importantes doivent commencer au niveau de la première perturbation et se terminer là où les mesures indiquent une pression négative ; cette lecture de tension est proportionnelle à la contrainte subie par les cellules, déterminée par analyse à l’aide de jauges de contrainte. La durée de l'impulsion transmise peut être plus courte que celle de l'impulsion incidente. Si une petite bulle est piégée dans le fluide à l'intérieur de la chambre de pressurisation, l'amplitude de l'impulsion transmise peut ne pas dépasser celle de l'impulsion incidente, mais elle devrait présenter un plateau suffisamment long avant la décharge.

Dans le cas contraire, soit une grande bulle d'air est piégée dans la chambre scellée, soit l'assemblage et la barre sont mal alignés. Après la pressurisation, les cellules peuvent être examinées immédiatement ou incubées davantage pour un examen ultérieur. Comparez les cellules pressurisées aux cellules témoins de la chambre, traitées de manière identique mais non soumises à la pressurisation, afin d'évaluer les modifications de la longueur des neurites par microscopie optique à différents moments après l'incubation.

La coloration immunofluorescente de l'actine peut être utilisée pour évaluer les modifications du cytosquelette. Également, un anticorps dirigé contre la protéine associée aux microtubules deux, MAP deux, peut être utilisé pour visualiser les changements dans l'un des marqueurs neuronaux clés.

Pour évaluer l'effet de la pressurisation impulsionnelle sur l'expression génique neuronale et apoptotique, utilisez des techniques classiques de biologie moléculaire telles que la R-T-P-C-R si désiré. Des lysats cellulaires suffisants pour le transfert immuno-enzymatique peuvent être recueillis à partir de plusieurs échantillons cellulaires soumis à une pression identique. Dans cet exemple, le profil de pressurisation, l'appareil ksky bar a appliqué avec succès une pression impulsionnelle unique de niveau deux mégapascals avec une durée d'environ 0,7 milliseconde aux cellules neuronales cultivées, comme le montrent les images au microscope optique. Les cellules neuronales humaines SHSY5Y, soumises à une pression impulsionnelle de deux mégapascals, présentent une dégradation marquée des neurites et des axones par rapport aux cellules témoins non dépressurisées.

Lorsque vous effectuez cette procédure, vous devez toujours tenir la chambre de pressurisation du fluide de cette manière et jamais de cette autre manière, car cela soumettrait les cellules à une pression négative après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs du domaine des neurosciences d'explorer le mécanisme cellulaire des lésions cérébrales traumatiques dans des conditions contrôlées de pressurisation en prostate. Nous remercions le soutien financier provenant du centre de l'armée UNL pour la mécanique des traumatismes.