Un test de bioluminescence calcium pour l'analyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez ( microplus) G récepteurs couplés aux protéines

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser les relations structure-activité de néuropeptides d'arthropodes synthétisés sur leurs récepteurs GPCR cognates. Cela est réalisé par transfection de cellules d'ovaire de hamster chinois, lignée K1 vide, avec le vecteur d'expression du récepteur GPCR désiré afin d'obtenir des lignées cellulaires stables dérivées d'une cellule unique. Dans une deuxième étape, la lignée cellulaire stable est transfectée avec le plasmide Quaran, qui porte le gène rapporteur Gina Quaran permettant la mesure de la bioluminescence intracellulaire dans le test de bioluminescence calcique en plaque. Ensuite, le test de bioluminescence calcique en plaque est réalisé afin de déterminer les concentrations cytoplasmiques de calcium après l'application du ligand peptidique sur ces cellules recombinantes.

Des résultats sont obtenus qui montrent des différences en unités de bioluminescence suite à l'application de peptides de structure différente ou de concentrations peptidiques variées sur des cellules recombinantes, en fonction du relâchement intracellulaire de calcium induit, tel que détecté par le rapporteur a corrin dans le test en plaque. Le principal avantage de l'utilisation de lignées cellulaires clonales stables exprimant des RCPG recombinants par rapport aux tendances et protocoles d'expression est que les niveaux d'expression des récepteurs sont plus uniformes, permettant une meilleure reproductibilité et des résultats cohérents. En outre, le ciblage de la protéine aquarium vers les mitochondries permet des mesures sensibles du calcium par bioluminescence, démontrant que l'expérience d'aujourd'hui impliquera deux étudiants diplômés devront mentir, ainsi que Simon Kersch, ainsi qu'un postdoctorant de mon laboratoire.

Pour établir des lignées cellulaires stables, commencez par cultiver des cellules d'ovaire de hamster chinois K1 vides à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone. Maintenez les cellules vides dans un milieu de croissance contenant un antibiotique antimycotique 1 x une fois que les cellules se développent sainement. Semez les cellules d'ovaire de hamster chinois K1 dans des flacons de culture tissulaire T25 et faites croître les cellules toute la nuit dans le milieu de croissance sans antibiotiques jusqu'à ce qu'elles atteignent environ 30 % de confluence.

Avant la transfection, préparez un vecteur d'expression d'ADN contenant le récepteur couplé aux protéines G d'intérêt, comme décrit dans le protocole écrit. Combinez l'ADN avec 100 microlitres de milieu Optum à sérum réduit.

Mélanger six microlitres de réactif de lipofection dans 100 microlitres de milieu F 12 K sans sérum et incuber à température ambiante pendant 30 à 45 minutes. Après l'incubation, mélanger délicatement les solutions d'ADN et de lipofection goutte à goutte. Laisser reposer le mélange à température ambiante pendant 10 à 15 minutes dans un tube de 15 millilitres.

Mélanger délicatement le mélange de transfection à 1,8 millilitre de milieu F 12 K frais, de manière goutte à goutte. Puis laver les cellules avec du PBS et ajouter cette nouvelle solution de transfection aux cellules. Incuber pendant 18 heures.

Changer le milieu pour du F 12 K, milieu contenant 10 % de FBS sans antibiotiques, et incuber toute la nuit le jour suivant. Répartir les cellules dans deux flacons T 25 avec du F 12 K, milieu contenant 10 % de FBS sans antibiotiques, comme décrit dans la procédure écrite. Incuber pendant 18 heures supplémentaires.

Remplacez le milieu par un milieu sélectif. Incubez ensuite les cellules dans le milieu sélectif pendant trois à quatre semaines. Cette étape permettra de sélectionner les cellules ayant intégré de façon stable le plasmide dans leur ADN génomique.

Continuer à entretenir les cellules en utilisant le milieu d'entretien, en congelant périodiquement les lignées cellulaires afin d'éviter toute perte en cas de contamination inattendue. Pour sélectionner des lignées cellulaires clonales, trypsiner d'abord les cellules et centrifuger celles-ci avec le milieu d'entretien comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, resuspendre les cellules dans cinq millilitres de milieu d'entretien.

Prélèvez 0,5 millilitre de la suspension cellulaire et ajoutez 4,5 millilitres de milieu de maintien frais afin d’obtenir une dilution 10 x, puis transférez 100 microlitres de cette dilution 10 x dans 12 puits d’une plaque de 96 puits pour sélectionner des cellules uniques. Poursuivez en réalisant environ 19 dilutions sérielles 10 x de ces cellules afin d’obtenir théoriquement une suspension finale contenant une cellule par 100 microlitres, et transférez 100 microlitres de chaque dilution sérielle dans 12 puits d’une plaque de 96 puits. Après 18 heures d’incubation, observez les plaques de 96 puits au microscope optique inversé ou au microscope à fluorescence, et marquez les puits qui semblent contenir une seule cellule ou deux cellules ayant manifestement divisé à partir d’une unique cellule.

Observer les plaques chaque jour en changeant le milieu tous les trois jours. Laisser les cellules croître pendant une semaine jusqu'à une confluence d'environ 80 %. Rincer ensuite les puits marqués avec 200 microlitres de PBS et de trypsine.

Incuber les cellules avec 100 microlitres de solution de PBS tripsine EDTA. Éliminer la solution de PBS tripsine EDTA. Ajouter 100 microlitres de milieu de maintien et transférer les cellules de chaque puits marqué dans un puits d'une plaque à six puits contenant un millilitre de milieu de maintien.

Après avoir cultivé les cellules dans la plaque à six puits pendant trois jours, transférez les cellules dans des flacons T 25 individuels. Congelez périodiquement la lignée cellulaire afin de pouvoir la récupérer si les cellules cessent de fonctionner de manière constante. Pour déterminer la lignée cellulaire présentant la réponse la plus élevée, testez les cellules transférées à l’aide du dosage de bioluminescence calcique en utilisant un ligand actif tel que le récepteur, un peptide, un ligand ou un autre agoniste témoin positif.

Le dosage bioluminescent du calcium sera détaillé ultérieurement dans cette vidéo. Effectuez une deuxième sélection de cellules individuelles avant de poursuivre l'expérience. Lorsque des lignées cellulaires clonales sont choisies pour des dosages et maintenues en culture, il est essentiel de suivre attentivement le nombre de passages, car les cellules ayant un nombre de passages élevé peuvent cesser de se développer correctement dans un flacon T 25.

Cultiver les lignées cellulaires exprimant le récepteur souhaité dans le milieu de maintenance jusqu'à une confluence d'environ 90 %. Après avoir trypsiné et centrifugé les cellules, les resuspendre dans le milieu de maintenance, diluer les cellules d'environ 10 fois avec le milieu de maintenance et déterminer le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Ajuster ensuite le nombre de cellules à environ deux fois 10 puissance cinq cellules par millilitre, semer deux millilitres de cellules dans chaque puits d'une plaque à six puits et incuber la plaque pendant 24 heures, après quoi les cellules devraient atteindre une confluence d'environ 60 % avant le début du test de bioluminescence calcique en plaque.

Préparez le gène rapporteur d'intérêt dans le vecteur d'expression. Un rapport de quorum exprimé dans les mitochondries est utilisé ici. Transfectez ensuite les cellules avec un microgramme de ce plasmide rapporteur, comme décrit dans le protocole écrit.

Après avoir incubé les cellules dans une plaque de six puits pendant 24 heures, faites une trypsine, une centrifugation et une resuspension, puis déterminez le nombre de cellules à 400 000 cellules par millilitre et transférez 100 microlitres dans chaque puits d'une plaque de microtitration blanche à fond mince de 96 puits ; incubez pendant 24 heures supplémentaires jusqu'à ce qu'une confluence d'environ 80 % soit atteinte. Cette concentration de cellules est optimale pour le dosage de bioluminescence. Les étapes suivantes doivent être effectuées à l'obscurité, mais sont illustrées ici à la lumière.

À des fins de démonstration, préparez suffisamment de milieu DME sans calcium contenant cinq micromoles par litre de CHO terezin pour 90 microlitres par puits. Retirez le milieu ancien de la plaque et ajoutez 90 microlitres dans chaque puits. Incubez les plaques pendant trois heures à l'obscurité à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone ; après quoi, les cellules sont prêtes à être testées.

Cette démonstration est réalisée à l'aide d'un lecteur de plaques Nova star en mode bioluminescence. Pour commencer la purge, placer la plaque dans le support de plaque à l'obscurité pendant que la machine pompe. Solubiliser les peptides dans un tube EOR de 1,5 millilitre.

Utiliser suffisamment de DME sans calcium et de milieu pour 10 microlitres de peptide à 10 x par puits. Régler la profondeur d'aspiration et la détermination de la position de la solution de peptide avant utilisation. Stimuler les cellules avec 10 microlitres de peptide et commencer immédiatement l'enregistrement de l'émission lumineuse.

Dans cette démonstration, l'appareil est réglé pour enregistrer l'émission lumineuse à 465 nanomètres pour chaque puits toutes les deux secondes, pendant une durée totale de 50 secondes. Une fois l'analyse terminée, rincez les pompes de l'appareil. Répétez le processus pour chaque échantillon de peptide, enregistrez les données, puis rincez à nouveau les pompes de l'appareil après le dosage.

Les données d'émission lumineuse de chaque puits sont automatiquement transférées dans une feuille de calcul Microsoft Excel par le logiciel. Collez les données depuis Excel vers Prism Software 4.0. Générez un graphique avec les différentes concentrations de peptides sur l'axe des abscisses et les unités de bioluminescence.

Sur l'axe Y, sélectionnez un ajustement de courbe de régression non linéaire afin d'obtenir les courbes de réponse en fonction de la concentration pour chaque peptide, avec leurs valeurs de CE 50 correspondantes. Chaque expérience doit être répétée trois fois pour l'analyse des données. Lorsqu'il est exprimé dans des cellules d'ovaire de hamster chinois, K one cells, le récepteur de kinine du moustique Aedes aegypti se comporte comme un récepteur multiligande et répond fonctionnellement à des concentrations aussi faibles qu'un nanomolaire.

Pour les trois kinines endogènes d'**Aedes aegypti** testées individuellement à l'aide du dosage colorimétrique de bioluminescence calcique, des valeurs d'EC50 statistiquement différentes ont été déterminées : environ 16 nanomolaires pour la kinine 3 d'**Aedes aegypti**, 26 nanomolaires pour la kinine 2 d'**Aedes aegypti** et 49 nanomolaires pour la kinine 1 d'**Aedes aegypti**, ce qui donne un ordre d'efficacité relatif avec la kinine 3 d'**Aedes aegypti** comme la plus puissante et la kinine 1 d'**Aedes aegypti** comme la moins active. Voici la comparaison de l'activité de six analogues de kinine contenant de l'acide α-aminoisobutyrique sur la lignée cellulaire de ovaires de hamster chinois (CHO-K1) exprimant le récepteur de kinine de tique, évaluée par un dosage colorimétrique de bioluminescence calcique.

L'axe Y représente le pourcentage d'unités maximales de bioluminescence pour chaque analogue, exprimé en pourcentage de la bioluminescence observée à une concentration donnée par rapport à la réponse maximale observée à toutes les concentrations testées pour chaque analogue. Le peptide KININE HEXA F-F-F-S-W-G amide est le témoin positif de l'activité du récepteur. L'analogue de kinine avec remplacement simple, double F acide aminobutyrique WG amide, était plus actif que le témoin positif, l'analogue de peptide KININE HEXA. L'analogue de kinine avec deux remplacements par acide aminobutyrique, acide aminobutyrique FF acide aminobutyrique WG amide, s'est révélé le plus puissant parmi les analogues à double remplacement testés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'exprimer les A-G-P-C-R et d'obtenir des lignées cellulaires clonales afin d'analyser les relations structure-activité des ligands sur les récepteurs à l'aide d'un dosage bioluminescent calcique.