Name: Un test de bioluminescence calcium pour lanalyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez ( microplus) G récepteurs couplés aux protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Découvrez un test de bioluminescence calcium pour analyser les relations structure-activité des neuropeptides arthropodes sur les récepteurs GPCR d'Aedes aegypti et Rhipicephalus microplus. Cette méthode permet la déorphanisation des récepteurs et la découverte de médicaments.

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Drs. PJC Grimmelikhuijzen et Michael Williamson de l&#39;Université de Copenhague (Danemark) sont appréciés pour fournir l&#39;aequorine plasmide. Notre collaborateur, le Dr Ronald J. Nachman de ARS-USDA (TX, USA), est reconnu pour la synthèse peptidique et de fournir au lecteur de plaque Novostar.

<ol><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+5%27-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li>
<li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNachman%2C+R+%22Neuropeptide+systems+as+Targets+for+Parasite+and+Pest+Control%22">Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control</a>. Geary, T. , Landes Bioscience. Madamme Curie Library. (2010).</li>
<li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biostable+agonists+that+match+and%2For+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond%2C+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selective+and+non-selective%2C+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+and+mosquito+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li>
<li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li>
<li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li>
<li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li>
<li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li>
</ol>

Nous avons été en mesure d&#39;effectuer la caractérisation fonctionnelle du récepteur neuropeptide découvert des arachnides (tiques, acariens et araignées), le récepteur kinine tique, en utilisant ce protocole. Cette méthode a trois applications principales. Tout d&#39;abord, la technique peut être appliquée pour deorphanization récepteurs grâce à des mesures d&#39;activité ligand. Deuxièmement, le dosage peut résoudre ligand-récepteur relations structure-activité (SAR). Troisièmement, les méthodes peuvent être utilisées dans la découverte de médicaments. Par ailleurs, ce protocole peut être utilisé pour étudier l&#39;activité des agonistes ou antagonistes sur presque n&#39;importe quelle RCPG. Nous commençons à adapter ce protocole pour le dépistage des petites bibliothèques. La lignée cellulaire nous avons utilisé n&#39;exprime pas la protéine ubiquitaire G G 16. Nous n&#39;avons pas besoin, car arthropodes récepteurs des kinines signal par la protéine Gq et la cascade intracellulaire de calcium et ils conserver cette propriétés de signalisation dans les cellules de mammifères, comme indiqué ici.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> Cellules CHO-K1 </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, USA </td></tr><tr><td> F12K moyennes </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotiques Antimycosique </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM I Réduction milieu sans sérum </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif Lipofectin </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> Généticine </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen Inc </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> Réactifs de transfection FuGENE 6 </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96 puits blanche fine plaque inférieure microtitere </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> sans calcium milieu DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelentérazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Bright-Ligne hémacytomètre </td><td> Hausser scientifique </td><td></td><td> Horsham, Pennsylvanie </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> Labtechnologies BMG </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism Software 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc </td><td></td><td> San Diego, Californie, USA </td></tr><tr><td> T-25 et T-75 Flacons </td><td> BD Falcon </td><td> 353014 353135 et le </td><td></td></tr></tbody></table>

un test de bioluminescence calcium pour l&#39;analyse fonctionnelle des moustiques ( aedes aegypti) et cochez (<emrhipicephalus> microplus) g récepteurs couplés aux protéines

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Récepteurs hormonaux arthropodes sont des cibles potentielles pour les pesticides roman comme ils régulent de nombreux processus essentiels physiologiques et comportementaux. La majorité d&#39;entre eux appartiennent à la superfamille des G récepteurs couplés aux protéines (RCPG). Nous nous sommes concentrés sur la caractérisation des récepteurs des kinines arthropodes de la tique et de moustiques. Kinines arthropodes sont des neuropeptides multifonctionnel avec myotropes, diurétique, et la fonction des neurotransmetteurs. Ici, une méthode pour l&#39;analyse systématique des relations structure-activité des kinines insectes sur deux hétérologue kinine exprimant le récepteur des systèmes est décrite. Nous fournissons des informations importantes relatives au développement des analogues des kinines biostable avec le potentiel de perturber le diurétique, myotropes, et / ou processus digestifs chez les tiques et les moustiques. Les récepteurs des kinines par la tique du bétail sud, Boophilus microplus (Canestrini), et le moustique Aedes aegypti (Linné), ont été exprimés de manière stable dans la lignée cellulaire de mammifère CHO-K1. Les analyses fonctionnelles de ces récepteurs ont été réalisées en utilisant un dosage du calcium plaque de bioluminescence que les mesures de bioluminescence intracellulaire afin de déterminer les niveaux de calcium cytoplasmique lors de l&#39;application de peptides à ces cellules recombinantes. Cette méthode tire parti de la protéine aequorine, une photoprotéine isolé luminescente méduses. Nous transfectées transitoirement l&#39;aequorine plasmide (mtAEQ/pcDNA1) dans des lignées cellulaires qui ont exprimé de façon stable les récepteurs des kinines. Ces cellules ont ensuite été traitées avec le cofacteur coelentérazine, qui se complexe avec l&#39;aequorine intracellulaire. Ce lien ruptures dans la présence de calcium, en émettant des niveaux de luminescence indique la concentration de calcium. Comme le récepteur de signaux kinine par la libération de calcium intracellulaire, l&#39;intensité du signal est liée à la puissance du peptide. Ce protocole est une synthèse de plusieurs protocoles décrits précédemment avec des modifications, il présente, étape par étape les instructions pour l&#39;expression stable des RCPG dans une lignée cellulaire de mammifère par le biais des tests fonctionnels plaque (Staubly et al, 2002 et Stables et al, 1997.. ). En utilisant cette méthodologie, nous avons été en mesure d&#39;établir des lignées cellulaires stables exprimant les moustiques et les récepteurs des kinines tique, comparer la puissance de trois kinines moustiques, d&#39;identifier les positions des acides aminés essentiels pour l&#39;interaction ligand-récepteur, et d&#39;effectuer de semi-criblage d&#39;un peptide bibliothèque. Parce que les kinines insectes sont sensibles à la dégradation enzymatique rapide par les peptidases endogènes, ils sont sévèrement limités dans l&#39;utilisation comme outils de lutte contre les ravageurs ou les études endocrinologiques. Par conséquent, nous avons également testé les analogues des kinines contenant de l&#39;acide aminé isobutyrique (AIB) afin d&#39;améliorer leur efficacité et biostabilité. Cet analogue peptidase-résistante représente une avance importante dans le développement de biostable analogues des kinines insectes et peut aider au développement du neuropeptide basé stratégies de contrôle des arthropodes.

Ce protocole fournit des instructions pour la sélection de la lignée clonale de cellules et un dosage du calcium bioluminescence d&#39;analyser les relations structure-activité des neuropeptides synthétisés arthropodes sur leur apparenté RCPG. Ce test peut être utilisé pour deorphanization récepteurs et des études de relation structure-activité pour la conception et le peptide analogue synthétique / drogue mènent la découverte.

Un test de bioluminescence calcium pour l&#39;analyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez (<emRhipicephalus> microplus) G récepteurs couplés aux protéines

Les récepteurs hormonaux des arthropodes sont des cibles potentielles pour de nouveaux pesticides, car ils régulent de nombreux processus physiologiques et comportementaux essentiels. Le...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser les relations structure-activité de néuropeptides d'arthropodes synthétisés sur leurs récepteurs GPCR cognates. Cela est réalisé par transfection de cellules d'ovaire de hamster chinois, lignée K1 vide, avec le vecteur d'expression du récepteur GPCR désiré afin d'obtenir des lignées cellulaires stables dérivées d'une cellule unique. Dans une deuxième étape, la lignée cellulaire stable est transfectée avec le plasmide Quaran, qui porte le gène rapporteur Gina Quaran permettant la mesure de la bioluminescence intracellulaire dans le test de bioluminescence calcique en plaque. Ensuite, le test de bioluminescence calcique en plaque est réalisé afin de déterminer les concentrations cytoplasmiques de calcium après l'application du ligand peptidique sur ces cellules recombinantes.Des résultats sont obtenus qui montrent des différences en unités de bioluminescence suite à l'application de peptides de structure différente ou de concentrations peptidiques variées sur des cellules recombinantes, en fonction du relâchement intracellulaire de calcium induit, tel que détecté par le rapporteur a corrin dans le test en plaque. Le principal avantage de l'utilisation de lignées cellulaires clonales stables exprimant des RCPG recombinants par rapport aux tendances et protocoles d'expression est que les niveaux d'expression des récepteurs sont plus uniformes, permettant une meilleure reproductibilité et des résultats cohérents. En outre, le ciblage de la protéine aquarium vers les mitochondries permet des mesures sensibles du calcium par bioluminescence, démontrant que l'expérience d'aujourd'hui impliquera deux étudiants diplômés devront mentir, ainsi que Simon Kersch, ainsi qu'un postdoctorant de mon laboratoire.Pour établir des lignées cellulaires stables, commencez par cultiver des cellules d'ovaire de hamster chinois K1 vides à 37&nbsp;degrés&nbsp;Celsius dans un incubateur humidifié avec 5&nbsp;% de dioxyde de carbone. Maintenez les cellules vides dans un milieu de croissance contenant un antibiotique antimycotique 1&nbsp;x une fois que les cellules se développent sainement. Semez les cellules d'ovaire de hamster chinois K1 dans des flacons de culture tissulaire T25 et faites croître les cellules toute la nuit dans le milieu de croissance sans antibiotiques jusqu'à ce qu'elles atteignent environ 30&nbsp;% de confluence.Avant la transfection, préparez un vecteur d'expression d'ADN contenant le récepteur couplé aux protéines G d'intérêt, comme décrit dans le protocole écrit. Combinez l'ADN avec 100 microlitres de milieu Optum à sérum réduit.Mélanger six microlitres de réactif de lipofection dans 100 microlitres de milieu F 12 K sans sérum et incuber à température ambiante pendant 30 à 45 minutes. Après l'incubation, mélanger délicatement les solutions d'ADN et de lipofection goutte à goutte. Laisser reposer le mélange à température ambiante pendant 10 à 15 minutes dans un tube de 15 millilitres.Mélanger délicatement le mélange de transfection à 1,8 millilitre de milieu F 12 K frais, de manière goutte à goutte. Puis laver les cellules avec du PBS et ajouter cette nouvelle solution de transfection aux cellules. Incuber pendant 18 heures.Changer le milieu pour du F 12 K, milieu contenant 10 % de FBS sans antibiotiques, et incuber toute la nuit le jour suivant. Répartir les cellules dans deux flacons T 25 avec du F 12 K, milieu contenant 10 % de FBS sans antibiotiques, comme décrit dans la procédure écrite. Incuber pendant 18 heures supplémentaires.Remplacez le milieu par un milieu sélectif. Incubez ensuite les cellules dans le milieu sélectif pendant trois à quatre semaines. Cette étape permettra de sélectionner les cellules ayant intégré de façon stable le plasmide dans leur ADN génomique.Continuer à entretenir les cellules en utilisant le milieu d'entretien, en congelant périodiquement les lignées cellulaires afin d'éviter toute perte en cas de contamination inattendue. Pour sélectionner des lignées cellulaires clonales, trypsiner d'abord les cellules et centrifuger celles-ci avec le milieu d'entretien comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, resuspendre les cellules dans cinq millilitres de milieu d'entretien.Prélèvez 0,5 millilitre de la suspension cellulaire et ajoutez 4,5 millilitres de milieu de maintien frais afin d’obtenir une dilution 10 x, puis transférez 100 microlitres de cette dilution 10 x dans 12 puits d’une plaque de 96 puits pour sélectionner des cellules uniques. Poursuivez en réalisant environ 19 dilutions sérielles 10 x de ces cellules afin d’obtenir théoriquement une suspension finale contenant une cellule par 100 microlitres, et transférez 100 microlitres de chaque dilution sérielle dans 12 puits d’une plaque de 96 puits. Après 18 heures d’incubation, observez les plaques de 96 puits au microscope optique inversé ou au microscope à fluorescence, et marquez les puits qui semblent contenir une seule cellule ou deux cellules ayant manifestement divisé à partir d’une unique cellule.Observer les plaques chaque jour en changeant le milieu tous les trois jours. Laisser les cellules croître pendant une semaine jusqu'à une confluence d'environ 80 %. Rincer ensuite les puits marqués avec 200 microlitres de PBS et de trypsine.Incuber les cellules avec 100 microlitres de solution de PBS tripsine EDTA. Éliminer la solution de PBS tripsine EDTA. Ajouter 100 microlitres de milieu de maintien et transférer les cellules de chaque puits marqué dans un puits d'une plaque à six puits contenant un millilitre de milieu de maintien.Après avoir cultivé les cellules dans la plaque à six puits pendant trois jours, transférez les cellules dans des flacons T 25 individuels. Congelez périodiquement la lignée cellulaire afin de pouvoir la récupérer si les cellules cessent de fonctionner de manière constante. Pour déterminer la lignée cellulaire présentant la réponse la plus élevée, testez les cellules transférées à l’aide du dosage de bioluminescence calcique en utilisant un ligand actif tel que le récepteur, un peptide, un ligand ou un autre agoniste témoin positif.Le dosage bioluminescent du calcium sera détaillé ultérieurement dans cette vidéo. Effectuez une deuxième sélection de cellules individuelles avant de poursuivre l'expérience. Lorsque des lignées cellulaires clonales sont choisies pour des dosages et maintenues en culture, il est essentiel de suivre attentivement le nombre de passages, car les cellules ayant un nombre de passages élevé peuvent cesser de se développer correctement dans un flacon T 25.Cultiver les lignées cellulaires exprimant le récepteur souhaité dans le milieu de maintenance jusqu'à une confluence d'environ 90 %. Après avoir trypsiné et centrifugé les cellules, les resuspendre dans le milieu de maintenance, diluer les cellules d'environ 10 fois avec le milieu de maintenance et déterminer le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Ajuster ensuite le nombre de cellules à environ deux fois 10 puissance cinq cellules par millilitre, semer deux millilitres de cellules dans chaque puits d'une plaque à six puits et incuber la plaque pendant 24 heures, après quoi les cellules devraient atteindre une confluence d'environ 60 % avant le début du test de bioluminescence calcique en plaque.Préparez le gène rapporteur d'intérêt dans le vecteur d'expression. Un rapport de quorum exprimé dans les mitochondries est utilisé ici. Transfectez ensuite les cellules avec un microgramme de ce plasmide rapporteur, comme décrit dans le protocole écrit.Après avoir incubé les cellules dans une plaque de six puits pendant 24 heures, faites une trypsine, une centrifugation et une resuspension, puis déterminez le nombre de cellules à 400 000 cellules par millilitre et transférez 100 microlitres dans chaque puits d'une plaque de microtitration blanche à fond mince de 96 puits ; incubez pendant 24 heures supplémentaires jusqu'à ce qu'une confluence d'environ 80 % soit atteinte. Cette concentration de cellules est optimale pour le dosage de bioluminescence. Les étapes suivantes doivent être effectuées à l'obscurité, mais sont illustrées ici à la lumière.À des fins de démonstration, préparez suffisamment de milieu DME sans calcium contenant cinq micromoles par litre de CHO terezin pour 90 microlitres par puits. Retirez le milieu ancien de la plaque et ajoutez 90 microlitres dans chaque puits. Incubez les plaques pendant trois heures à l'obscurité à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone ; après quoi, les cellules sont prêtes à être testées.Cette démonstration est réalisée à l'aide d'un lecteur de plaques Nova star en mode bioluminescence. Pour commencer la purge, placer la plaque dans le support de plaque à l'obscurité pendant que la machine pompe. Solubiliser les peptides dans un tube EOR de 1,5 millilitre.Utiliser suffisamment de DME sans calcium et de milieu pour 10 microlitres de peptide à 10 x par puits. Régler la profondeur d'aspiration et la détermination de la position de la solution de peptide avant utilisation. Stimuler les cellules avec 10 microlitres de peptide et commencer immédiatement l'enregistrement de l'émission lumineuse.Dans cette démonstration, l'appareil est réglé pour enregistrer l'émission lumineuse à 465 nanomètres pour chaque puits toutes les deux secondes, pendant une durée totale de 50 secondes. Une fois l'analyse terminée, rincez les pompes de l'appareil. Répétez le processus pour chaque échantillon de peptide, enregistrez les données, puis rincez à nouveau les pompes de l'appareil après le dosage.Les données d'émission lumineuse de chaque puits sont automatiquement transférées dans une feuille de calcul Microsoft Excel par le logiciel. Collez les données depuis Excel vers Prism Software 4.0. Générez un graphique avec les différentes concentrations de peptides sur l'axe des abscisses et les unités de bioluminescence.Sur l'axe Y, sélectionnez un ajustement de courbe de régression non linéaire afin d'obtenir les courbes de réponse en fonction de la concentration pour chaque peptide, avec leurs valeurs de CE 50 correspondantes. Chaque expérience doit être répétée trois fois pour l'analyse des données. Lorsqu'il est exprimé dans des cellules d'ovaire de hamster chinois, K one cells, le récepteur de kinine du moustique Aedes aegypti se comporte comme un récepteur multiligande et répond fonctionnellement à des concentrations aussi faibles qu'un nanomolaire.Pour les trois kinines endogènes d'**Aedes aegypti** testées individuellement à l'aide du dosage colorimétrique de bioluminescence calcique, des valeurs d'EC50 statistiquement différentes ont été déterminées : environ 16 nanomolaires pour la kinine 3 d'**Aedes aegypti**, 26 nanomolaires pour la kinine 2 d'**Aedes aegypti** et 49 nanomolaires pour la kinine 1 d'**Aedes aegypti**, ce qui donne un ordre d'efficacité relatif avec la kinine 3 d'**Aedes aegypti** comme la plus puissante et la kinine 1 d'**Aedes aegypti** comme la moins active. Voici la comparaison de l'activité de six analogues de kinine contenant de l'acide α-aminoisobutyrique sur la lignée cellulaire de ovaires de hamster chinois (CHO-K1) exprimant le récepteur de kinine de tique, évaluée par un dosage colorimétrique de bioluminescence calcique.L'axe Y représente le pourcentage d'unités maximales de bioluminescence pour chaque analogue, exprimé en pourcentage de la bioluminescence observée à une concentration donnée par rapport à la réponse maximale observée à toutes les concentrations testées pour chaque analogue. Le peptide KININE HEXA F-F-F-S-W-G amide est le témoin positif de l'activité du récepteur. L'analogue de kinine avec remplacement simple, double F acide aminobutyrique WG amide, était plus actif que le témoin positif, l'analogue de peptide KININE HEXA. L'analogue de kinine avec deux remplacements par acide aminobutyrique, acide aminobutyrique FF acide aminobutyrique WG amide, s'est révélé le plus puissant parmi les analogues à double remplacement testés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'exprimer les A-G-P-C-R et d'obtenir des lignées cellulaires clonales afin d'analyser les relations structure-activité des ligands sur les récepteurs à l'aide d'un dosage bioluminescent calcique.

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&lt;p style='line-height :1.38 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'&gt;Source : Lark, A. R., et. al., approche d’imagerie cérébrale fonctionnelle in vivo basée sur l’indicateur de calcium bioluminescent GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre l’imagerie en temps réel de la dynamique calcique à l’aide de la bioluminescence de la protéine fluorescente verte-aequorin dans Drosophila’s structures cérébrales profondes.

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Nous présentons ici un roman Ca 2+ -Imagerie approche utilisant un journaliste bioluminescente. Cette approche utilise une construction GFP-aequorine condensé qui se lie au Ca 2+ et émet de la lumière, éliminant le besoin d'une lumière d'excitation. Significativement cette méthode permet à long imagerie continue, l'accès à des structures profondes du cerveau et une haute résolution temporelle.

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Décrit est une méthode permettant de gagner du temps et de l’espace pour compter les œufs et déterminer les taux d’éclosion des moustiques individuels à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire dans les puits, ce qui peut augmenter considérablement l’échelle et la vitesse des essais de fécondité et de fertilité.

Amélioration de la fécondité et de la fertilité pour Aedes aegypti à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire de puits (plaques EAgaL)

Dans ce travail, un test de fluorescence calcique intracellulaire à haut débit pour des plaques à 384 puits afin de cribler de petites banques de molécules sur des récepteurs couplés aux protéines G recombinantes (RCPG) est décrit. La cible, le récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, Rhipicephalus microplus, est exprimée dans les cellules CHO-K1. Ce test identifie les agonistes et les antagonistes utilisant les mêmes cellules dans un test de « double addition ».

Un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante

Des procédures sont décrites pour étudier les comportements de sondage et d’ingestion des moustiques Culex tarsalis sur des mains humaines à l’aide de l’électropénétrographie AC-DC.

Électropénétrographie AC-DC pour l’étude des comportements de sonde et d’ingestion des moustiques Culex tarsalis sur les mains humaines

Une méthode précise encore simplifiée pour collecter et tacher hémocytes de moustique est décrite. Notre méthode combine la simplicité de la perfusion avec la précision des techniques d'injection élevée pour isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes. Cette méthode facilite la connaissance des études nécessitant des types d'hémocytes et leur abondance.

Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti</em

Découvrez un test de bioluminescence calcium pour analyser les relations structure-activité des neuropeptides arthropodes sur les récepteurs GPCR d'Aedes aegypti et Rhipicephalus microplus. Cette méthode permet la déorphanisation des récepteurs et la découverte de médicaments.

Un test de bioluminescence calcium pour lanalyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez ( microplus) G récepteurs couplés aux protéines (Vidéo) | JoVE Journal

Un test de bioluminescence calcium pour l'analyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez ( microplus) G récepteurs couplés aux protéines

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