Name: Phage Bioluminescent Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Découvrez la détection rapide de Yersinia pestis par phage rapporteur bioluminescent. Cette méthode utilise la luciférase bactérienne pour identifier les pathogènes de catégorie A en minutes.

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Cette recherche a été soutenue par le programme Small Business Innovation Research des National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) et l&#39;USDA Institut national de l&#39;alimentation et l&#39;agriculture (NIFA, 2009-33610-20028).

1. Y. l'inoculation plaque pestis <ol><li> Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) les cultures de stock sur Luria-Bertani (LB) agar (Miller). Utiliser une technique stérile et effectuer toutes Y. manipulations pestis dans un type de classe II A enceinte de sécurité biologique. Y. pestis A1122 est un confinement de niveau (BSL) 2 souche exclus agent de sélection. Il manque à la fois les 75 paires ko faible teneur en calcium de réponse (LCR) plasmide de virulence, et le locus PGM qui sont nécessaires pour la virulence. Cultivez Y. pestis à 28 ° C pendant 48 h dans une température d'air statique contrôlé incubateur. Le taux de croissance de Y. pestis est lente avec un temps de génération de 1.25 h 9. </li></ol> 2. Y. pestis milieux liquides d'inoculation <ol><li> Transfert d'un seul Y. pestis dans une colonie de stériles 17 x 100 mm tube de culture contenant 2 ml de bouillon LB utilisant une boucle métallique stérile inoculation. Sélectionnez une colonie qui est uniforme dans la taille, est révélateur des autres colonies, et il est clairement séparé du reste des colonies sur la plaque. Vortex brièvement et développer la culture à 28 ° C pendant environ 20 h dans un incubateur agitateur (225 rpm). </li></ol> 3. Y. excroissance pestis, outre phage journaliste, et la détection de bioluminescence <ol><li> Diluer le nuit Y. 01:20 pestis en bouillon de culture LB frais dans un tube Falcon de 50 ml (par exemple, 500 ul de cellules dans 9,5 ml de milieu) et de croître à 28 ° C avec agitation (225 rpm). Croître jusqu'à une densité optique à 600 nm (600 A) de 0,2 est atteinte (environ 5 h). Cellules en croissance active sont préférables pour la détection puisque la capacité du phage pour transduire une réponse bioluminescents est corrélée à la viabilité et l'aptitude de la bactérie hôte. Néanmoins, le système de détection a été montré pour être compatible avec les cellules récoltées à tous les stades du cycle de croissance de 7. </li><li> Générer le substrat nécessaire à la réaction de bioluminescence en préparant un 2% de n-décanale solution. Mélanger 200 uL de n-décanale avec 9,8 ml de bouillon LB. Vortex vigoureusement pendant 5 s. Premier la microplaque luminomètre injecteur avec 2 mL de 2% du n-décanale solution. Pré-régler le luminomètre d'autoinject 67 ul de la solution décanale à chaque puits de microplaque puis lire immédiatement l'échantillon pendant 10 s. </li><li> Distribuer des aliquotes de 1 ml de bouillon LB en 3 tubes de culture. Ajouter 20 ul de la solution stock journaliste phage (stock de 5 x 10 9 unités formant plaque [UFP] / ml) dans chaque tube, les phages et les médias seuls échantillons sert de contrôle négatif. En l'absence de Y. cellules pestis, l'ajout du phage journaliste ne devrait pas susciter une réaction de bioluminescence. </li><li> Distribuer des aliquotes de 1 mL de la Y. la culture pestis (de l'étape 3.1) dans 6 tubes de culture. Ajouter 20 uL de la journaliste de stock de phages à 3 sur les cultures (cultures d'essai). Les 3 autres cultures servir de «cellules seules« contrôle négatif (autobioluminescence fond). Mélanger les cultures au vortex brièvement, et la récolte 200 ul de chaque échantillon (pour l'instant 0 en lecture) et répartir dans une plaque de microtitration de 96 puits blanc. Incuber la culture reste à 28 ° C avec agitation (225 rpm). </li><li> Mesurer le temps 0 échantillons de la bioluminescence (unités relatives de lumière, RLU) en utilisant le luminomètre pour microplaques. </li><li> Récolte 200 ul de chaque échantillon après 10, 20, 30, 40, 50 et 60 min après ajout de phages-reporter, et de mesurer l'échantillon de la bioluminescence. Si Y. cellules pestis sont présents, le phage rapporteur sera lient spécifiquement à la cellule, injecter son ADN, et d'utiliser les machines hôtes transcription et de traduction de transcrire et de traduire les gènes rapporteurs luxAB (figure 1). </li><li> La force du signal et le temps de réponse du signal est proportionnelle au nombre de cellules présentes. À des concentrations élevées de cellules (10 5 -10 8 UFC / ml), une augmentation significative en RLU par rapport aux contrôles devrait être évident dans les 20 min. A des concentrations inférieures cellulaire, (10 2 -10 4 UFC / ml), une augmentation significative des AVC devrait être évident dans les 40-60 min. </li><li> Sinon, pour accélérer le processus de détection sans avoir besoin de Y. excroissance pestis, une colonie d'une plaque fraîchement cultivées peuvent être mixtes (au vortex) directement dans un tube Eppendorf de 1,5 ml avec 200 pi de bouillon LB abritant le phage journaliste. Répartir le mélange de cellules / phages dans un puits d'une microplaque. Incuber la microplaque à 28 ° C et de lire l'échantillon de la bioluminescence après 60 min (seul moment seulement). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Une expérience représentative du temps bien sûr du phage journaliste de médiation de détection de Y. pestis est représenté dans la figure 2. Les contrôles négatifs de 1) phage seul (sans cellules), ou 2) des cellules seules (pas le phage) de fournir des niveaux de référence de la bioluminescence d'environ 20 RLU dans le inc 60 minubation (niveaux de référence sont spécifiques luminomètre). En revanche, une augmentation de la bioluminescence pour les échantillons d'essai (phage journaliste et cellules) est évidente à 15 minutes après l'addition de phages. La force du signal devrait augmenter régulièrement plus de 60 min. Les incubations pour des périodes prolongées (plus de 80 min), se traduira par un signal qui va diminuer à partir du signal de pointe en raison de phage lyse des cellules hôtes. Des résultats similaires sont obtenus à des températures d'incubation de 37 ° C même si la température optimale pour Y. la croissance pestis est de 28 ° C 9. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Phage médiée par la détection de bioluminescence de Y. pestis. Au temps 0, phage journaliste et les cellules ont été mélangés, incubées à 28 ° C, et la bioluminescence (AVC) a été suivi dans le temps. Une augmentation significative des AVC (* Etudiants t-test, p &lt;0,05) est évidente dans les 15 min.

<ol><li>Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threats+in+bioterrorism.+I%3A+CDC+category+A+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Med+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents.</a> Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22Laboratory+manual+of+plague+diagnostic+tests.%22">Laboratory manual of plague diagnostic tests.</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).</li>
<li>, (1999).</li>
<li>Inglesby, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthrax+as+a+biological+weapon%2C+2002%3A+updated+recommendations+for+management%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management.</a> JAMA. 287, 2236-2252 (2002).</li>
<li>Schuch, R., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+genomic+analysis+of+the+Wbeta+and+gamma+phages+infecting+Bacillus+anthracis%3A+implications+for+evolution+of+environmental+fitness+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance.</a> J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).</li>
<li>Garcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Yersinia+pestis+bacteriophage+phiA1122+reveals+an+intimate+history+with+the+coliphage+T3+and+T7+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes.</a> J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).</li>
<li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+bioluminescent+phage+for+detection+of+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).</li>
<li>Schofield, D. A., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-mediated+bioluminescent+detection+of+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22CDC%3A+Basic+laboratory+protocols+for+the+presumptive+identification+of+Yersinia+pestis%22">CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).</li>
<li>Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+differentiation+between+Pasteurella+pestis+and+Pasteurella+pseudotuberculosis+by+action+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage.</a> J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).</li>
<li>Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Action+of+Pasteurella+pestis+Bacteriophage+on+Strains+of+Pasteurella%2C+Salmonella%2C+and+Shigella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella.</a> J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).</li>
<li>Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Yersinia+pestis+using+amplification+of+plague+diagnostic+bacteriophages+monitored+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR.</a> PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).</li>
</ol>

Cette méthode démontre la capacité du phage journaliste de détecter rapidement Y. pestis depuis le phage journaliste peut transduire un signal de réponse à la culture bioluminescents Y. cellules pestis dans les 20 minutes après l&#39;addition de phages. Le phage journaliste est également capable de détecter directement Y. pestis dans des matrices cliniques, sans le préalable de l&#39;isolement et la culture 7 ultérieures. Par rapport à la lyse de phages tests standard qui e...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> LB agar Difco, Miller </td><td> VWR </td><td> 90003-346 </td></tr><tr><td> Difco LB bouillon, Miller </td><td> VWR </td><td> 90003-350 </td></tr><tr><td> 17 x 100 mm tubes de culture </td><td> USA Scientific </td><td> 1485-0810 </td></tr><tr><td> n-décanale </td><td> Sigma </td><td> D7384 </td></tr><tr><td> Veritas microplaques luminomètre </td><td> Turner Biosystems </td><td> 9100-001 </td></tr><tr><td> Microlite microtitration 96 puits </td><td> VWR </td><td> 62402-984 </td></tr></tbody></table>

phage »bioluminescent&quot; reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie a

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis et Bacillus anthracis sont de catégorie A des bactéries pathogènes qui sont les agents responsables de la peste et l'anthrax, respectivement 1. Bien que la présence naturelle de ces deux maladies est maintenant relativement rare, la possibilité à des groupes terroristes d'utiliser ces agents pathogènes comme une arme biologique est bien réelle. En raison de la communicabilité inhérente de la maladie, l'évolution clinique rapide, et le taux de mortalité élevé, il est essentiel qu'une flambée être détectés rapidement. Par conséquent les méthodes qui permettent la détection et le diagnostic rapides sont essentiels pour assurer la mise en œuvre immédiate de mesures de santé publique et l'activation de la gestion de crise. Recombinante de phage journaliste peut fournir une approche rapide et spécifique pour la détection de Y. pestis et B. anthracis. Les Centers for Disease Control and Prevention utilisent actuellement les tests classiques lyse de phages pour l'identification confirmée de ces bactéries pathogènes 2-4. Ces dosages profiter des phages naturels qui sont spécifiques et lytique pour leurs hôtes bactériens. Après une croissance de nuit de la bactérie cultivée en présence du phage spécifique, la formation de plaques (lyse bactérienne) fournit une identification positive de la cible bactérienne. Bien que ces tests sont robustes, ils souffrent de trois défauts: 1) ils sont en laboratoire, 2) ils ont besoin d'isolement bactérien et la culture de l'échantillon suspect, et 3) ils prennent 24 à 36 h pour terminer. Pour répondre à ces questions, recombinante de phage "lumière taggés« journaliste ont été génétiquement modifiées en intégrant les Vibrio harveyi gènes luxAB dans le génome de Y. pestis et B. anthracis phage spécifique 5-8. Le phage résultant luxAB journaliste ont été capables de détecter leurs cibles spécifiques par rapidement (quelques minutes) et sensible conférant un phénotype bioluminescent dans des cellules receveuses. Surtout, la détection a été obtenue soit avec des cellules cultivées bénéficiaires ou avec maquette infectés échantillons cliniques 7. Pour fins de démonstration, ici nous décrire la méthode pour la détection de phages à médiation d'un appelé Y. pestis isoler en utilisant un phage journaliste luxAB construit à partir du phage CDC peste diagnostic ΦA1122 6,7 (figure 1). Une méthode similaire, avec des modifications mineures (par exemple changement de la température de la croissance et les médias), peuvent être utilisés pour la détection de B. anthracis isole à l'aide de la B. Wβ anthracis phage journaliste:: luxAB 8. La méthode décrit la transduction de phages à médiation d'un phénotype biolumescent d'cultivées Y. pestis cellules qui sont ensuite mesurés à l'aide d'un luminomètre pour microplaques. Les principaux avantages de cette méthode sur les tests traditionnels lyse de phages est la facilité d'utilisation, les résultats rapides, et la possibilité de tester plusieurs échantillons en même temps dans un format de 96 puits de plaques de microtitration. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma de détection. Les phages sont mélangées avec l'échantillon, les phages infecte la cellule, luxAB sont exprimés, et le bioluminesces cellule. Le traitement des échantillons n'est pas nécessaire; le phage et les cellules sont mélangés et ensuite évalués pour la lumière.

Une méthode simple pour l&#39;identification de pathogènes bactériens priorité est d&#39;utiliser le phage journaliste génétiquement modifiés. Ces phages journaliste, qui sont spécifiques à leur espèce hôte particulier, sont capables de transduire rapidement une réponse de signal bioluminescent aux cellules hôtes. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de phages journaliste pour la détection de<em&gt; Yersinia pestis</em&gt;.

Phage »Bioluminescent&quot; Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A

Yersinia pestis et Bacillus anthracis sont des agents pathogènes bactériens de catégorie A, respectivement responsables de la peste et de l'anthrax 1. ...

Yesinia Pestis et Bacillus Anthracis sont des pathogènes bactériens de catégorie A responsables respectivement de la peste et du charbon. Bien que l'occurrence naturelle de ces deux maladies soit désormais relativement rare, la possibilité qu'un groupe terroriste utilise ces agents pathogènes comme arme biologique est réelle. Cette vidéo démontre une méthode permettant de détecter et d'identifier Yersinia pestis.Tout d'abord, le microorganisme est cultivé sur des boîtes de Petri agri et en milieu liquide. Ensuite, un pH rapporteur spécifique de y pesti est ajouté à la culture. Ce pH rapporteur contient dans son génome les gènes codant pour la luciférase bactérienne, luxE AB.Si des cellules de Y. pestis sont présentes, le phage rapporteur se lie spécifiquement à la cellule, injecte son ADN recombinant portant les gènes luxe AB, puis utilise les machineries transcriptionnelle et traductionnelle de l'hôte pour transcrire et traduire les gènes rapporteurs luxe AB. Les résultats obtenus montrent que les échantillons ont acquis un phénotype bioluminescent, indiquant que le microorganisme inconnu a été positivement identifié comme étant Y. pestis. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le test classique de lyse par phage, est que le temps nécessaire pour détecter et identifier Y. pestis est de quelques minutes au lieu de plusieurs jours. Cette méthode permet d'identifier rapidement et de détecter la présence de Yersinia pestis à partir de cultures isolées ou directement à partir d'échantillons cliniques ou environnementaux complexes.Les implications de cette technique s'étendent à un diagnostic de la peste, car cette maladie est généralement mortelle si elle n'est pas traitée dans les 24 premières heures suivant l'apparition des symptômes. Ainsi, l'identification rapide de Yesenia pests est essentielle pour un pronostic favorable. Étant donné que des bactériophages existent pour presque toutes les espèces bactériennes, la méthodologie pourrait potentiellement être adaptée à toute espèce médicalement, écologiquement ou agricole-ment importante de Y. pestis.A 1122 est une souche d'agent sélectionné exclue de niveau de biosécurité deux. Elle possède une délétion des deux éléments requis pour la virulence : le plasmide de virulence de 75 kilobases associé à la réponse calcique (LCR) et le locus PGM. Commencer cette procédure dans une cabine de sécurité de type II, en utilisant une technique stérile pour effectuer une stries sur gélose Yersinia pestis A 1122.Conserver les cultures souches sur gélose LB comme indiqué ici. Placer les boîtes de Petri retournées dans un incubateur à air statique contrôlé en température à 28 degrés Celsius pendant 48 heures. La vitesse de croissance de Y. pestis est lente, avec un temps de génération de 1,25 heure après deux jours.Utilisez une boucle d'ensemencement métallique stérile pour prélever une colonie unique de Y. pestis. Sélectionnez une colonie uniforme en taille, représentative des autres colonies et clairement séparée du reste des colonies sur la boîte. Transférez la colonie dans un tube de culture stérile de 17 sur 100 millimètres contenant deux millilitres de bouillon LB.Fermer le tube, le vortexer brièvement, puis le placer dans un incubateur agité à 225 tr/min à 28 degrés Celsius pendant environ 20 heures. Pour ce test, des cellules en croissance active sont préférables pour la détection. Étant donné la capacité du bactériophage à transduire, une réponse bioluminescente est corrélée à la viabilité et à la capacité adaptative des bactéries hôtes.Néanmoins, le système de détection s'est révélé compatible avec des cellules récoltées à tous les stades du cycle de croissance. Après 20 heures de croissance, diluez la culture de Y pestis d’un facteur 1 à 20 dans un tube conique de 50 millilitres en ajoutant 500 microlitres de cellules à 10 millilitres de bouillon lb. Replacez la culture dans l’incubateur agité à 28 degrés Celsius.Laisser la culture croître jusqu'à une densité optique à 600 nanomètres de 0,2. Cela devrait prendre environ cinq heures pour générer le substrat de la réaction bioluminescente. Préparer une solution de N-décanal à 2 % en mélangeant 200 microlitres de N-décanal avec 9,8 millilitres de bouillon LB.Vortexez vigoureusement pendant cinq secondes. Ensuite, amorcez l'injecteur du luminomètre de microplaque. Placez une extrémité du tube d'injecteur dans un tube de 13 millilitres contenant une solution de décapage à 2 %, et l'autre extrémité du tube d'injecteur dans un récipient de déchets.À l’aide du logiciel de l’équipement, indiquez à la machine d’amorcer la ligne d’injecteur avec deux millilitres de la solution de décanal. Une fois l’opération terminée, la ligne doit être remplie de substrat ; replacez l’extrémité de la ligne d’injecteur dans sa position initiale, prête à injecter dans les puits. Ensuite, programmez le luminomètre pour qu’il injecte automatiquement 67 microlitres de la solution de déel dans chaque microplaque.Ensuite, mesurez immédiatement le niveau de bioluminescence émise pendant 10 secondes. Préparez ensuite chaque échantillon et étiquetez trois tubes de culture par condition. Ici, des témoins phase uniquement et des témoins cellules uniquement seront préparés en plus d'un échantillon test.Ainsi, neuf tubes sont nécessaires pour préparer les échantillons témoins contenant uniquement des phages ; répartir un millilitre d'aliquote de bouillon LB dans trois tubes de culture. Ajouter 20 microlitres du phage rapporteur. Ajouter à chaque tube une solution mère contenant cinq fois 10 puissance 9 unités formant des plaques, ou UFC, par millilitre.En l'absence de cellules de Y pesti, l'ajout du bactériophage rapporteur ne devrait pas provoquer de réponse bioluminescente. Ensuite, pour préparer les échantillons d'essai, distribuez des aliquotes d'un millilitre de la culture de Y pesti dans trois tubes de culture. Ajoutez 20 microlitres de la souche de bactériophage rapporteur à trois des cultures.Mélangez les cultures en vortexant brièvement pour préparer les cellules seules. Pour les contrôles négatifs, utilisés afin de déterminer l'autoluminescence de fond, prélevez des aliquotes d'un millilitre de la culture de Y. pestis et répartissez-les dans trois tubes de culture supplémentaires. Une fois les échantillons préparés, transférez 200 microlitres de chaque culture dans les puits d'une plaque microtitration blanche à 96 puits pour la lecture au temps zéro.Placer le reste de chaque culture dans l'agitateuse à 28 degrés Celsius en utilisant un luminomètre microplaque. Mesurer le temps. Effectuer le zéro des échantillons pour la bioluminescence ou les unités de lumière relative.Effectuez des mesures de bioluminescence en prélevant 200 microlitres de chaque culture et en réalisant les lectures sur le luminomètre à microplaque aux temps de 20, 30, 40 et 60 minutes. Après ajout du bactériophage rapporteur afin d'accélérer le processus de détection sans nécessiter la croissance de Y. pestis, transférez une colonie provenant d'une plaque fraîchement cultivée dans un tube microfuge contenant 200 microlitres de milieu LB, additionné du bactériophage rapporteur. Mélangez l'échantillon par vortex, puis distribuez le mélange cellules-phage dans une cavité d'une plaque de microtitration.Incuber la plaque microtitration à 28 degrés Celsius pendant 60 minutes. Ensuite, mesurer l'échantillon pour la bioluminescence. Le test illustré dans cette vidéo détecte la présence de cellules de Y pestis comme décrit dans l'introduction.Lorsque Y. pestis est présent, le phage rapporteur se lie à un récepteur spécifique sur la cellule, injecte son ADN et utilise les systèmes transcriptionnel et traductionnel de l'hôte pour transcrire et traduire le gène rapporteur luxE. L'intensité du signal et le temps de réponse du signal sont proportionnels au nombre de cellules présentes, pour des concentrations élevées de cellules, allant de 10 à la puissance 5 à 10 à la puissance 8 UFC par millilitre.Une augmentation significative des RLU par rapport aux témoins doit être évidente dans les 20 minutes pour des concentrations cellulaires plus faibles, allant de 10² à 10⁴ UFC par millilitre. Une augmentation significative des RLU doit être évidente entre 40 et 60 minutes. Une expérience représentative de suivi temporel de la détection du rapporteur par phage médiation de Y. pestis est présentée ici aux temps zéro.Les phages rapporteurs et les cellules ont été mélangés et incubés à 28 degrés Celsius, et la bioluminescence, exprimée en unités de lumière relative (RLU), a été surveillée au cours du temps. Une augmentation des RLU est devenue évidente dans les 12 minutes, ce qui était significatif avec une valeur P inférieure à 0,05. Les contrôles négatifs composés uniquement de phages ou uniquement de cellules ont fourni des niveaux de base de bioluminescence d’environ 20 RLU tout au long de l’incubation de 60 minutes. Noter que les niveaux de base sont spécifiques au luminomètre.En revanche, une augmentation de la bioluminescence chez les cellules hôtes rapportant des échantillons témoins est évidente 12 minutes après l'ajout du bactériophage. L'intensité du signal devrait augmenter régulièrement pendant 50 minutes ; bien que cela ne soit pas montré ici, des incubations prolongées au-delà de 80 minutes entraîneront une diminution du signal par rapport au pic maximal en raison de la lyse des cellules hôtes induite par le bactériophage. Des résultats similaires sont obtenus à une température d'incubation de 37 degrés Celsius, même si la température optimale pour la croissance de Y. pestis est de 28 degrés Celsius.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser le rapport recombinant pour la détection. Une fois maîtrisée l'identification de Yesenia Pestis, cette technique peut être réalisée en 30 minutes en utilisant des colonies S Golden comme inoculum initial. Lors de la réalisation de cette procédure et de l'utilisation de phages en laboratoire, il est important de garder à l'esprit qu'il est très facile de contaminer vos cultures bactériennes de stock avec le phage, ce qui réduit la possibilité de contamination.Utilisez des équipements en plastique jetables avec des embouts propres et changez régulièrement vos gants. La capacité du rapporteur à induire une réponse de Blum est corrélée à la viabilité de la cellule. Ainsi, après l'identification de Yesenia Pesta, le rapporteur peut être utilisé pour déterminer la sensibilité aux antibiotiques de l'isolat.Par exemple, les cellules de Yesenia pesta incubées avec une concentration inhibitrice de l'antibiotique seront soit incapables, soit fortement limitées dans leur capacité à produire un signal bioluminescent. En revanche, les cellules de Yesenia pesta résistantes à l'antibiotique ne seront pas compromises par la présence de cet antibiotique et pourront déclencher une réponse bioluminescente analogue à celle des cellules non inhibées. Ainsi, un profil de sensibilité du pathogène aux antibiotiques peut être déterminé rapidement.À des fins d'illustration, nous avons utilisé une souche atténuée de Yesenia pesta. Dans cette expérience, Yesenia pests constitue une catégorie, un agent pathogène bactérien. Lorsque cette technique est utilisée avec des échantillons susceptibles de contenir Yesenia Pestis, des précautions appropriées de biosécurité et de risque biologique doivent être respectées.

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Bioluminescent imagerie bactérienne<em&gt; In Vivo</em

Source : de Vries, C. R., et al., Un modèle d’inoculation retardée de l’infection chronique de la plaie par Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo présente une technique d’imagerie bioluminescente pour surveiller la progression de l’infection bactérienne dans un modèle murin vivant. Des bactéries pathogènes conçues avec le système rapporteur luxABCDE émettent de la lumière au site d’infection, permettant la visualisation des bactéries métaboliquement actives. En imageant la...

Imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez la souris

Cette vidéo présente l’imagerie par fluorescence enzymatique rapporteure (REF) pour la détection in vivo de l’infection à Mycobacterium tuberculosis. Les souris infectées sont injectées par voie intrapéritonéale avec un substrat pour l’imagerie REF. Lorsqu’il est hydrolysé par l’enzyme bactérienne β-lactamase, le substrat émet une fluorescence dont la détection facilite l’évaluation de l’infection.

Imagerie par fluorescence enzymatique rapporteure pour le suivi in vivo d’une infection bactérienne

Les bactéries produisent des composés sécrétés qui ont le potentiel d'affecter la physiologie de leurs voisins microbiennes. Nous décrivons ici un écran de co-culture qui permet la détection de ces médiation chimiquement interspécifiques interactions en mélangeant les microbes du sol avec des souches rapporteurs fluorescents transcription de Bacillus subtilis sur milieu solide.

Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

Extension de la fondation et de l'applicabilité de la fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) en interrogeant les principes pertinents et démontrer sa compatibilité avec une multitude de fluorophores et les conditions d'anticorps ciblés.

A Step Beyond BRET: Fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL)

Un protocole détaillé d’un modèle de souris pour entérohémorragique Escherichia coli (EHEC) colonisation en utilisant des bactéries marquées bioluminescence est présenté. La détection de ces bactéries bioluminescentes par un non invasif in vivo d’imagerie système animaux vivants peut avancer notre compréhension actuelle de la colonisation de l’ECEH.

Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo

Bactéries bioluminescentes réglementent la production légère au moyen de divers mécanismes, tels que quorum sensing. Cette nouvelle méthode permet l’enquête in situ de la bioluminescence et la corrélation de l’émission de lumière densité cellulaire. Un artificiel bioluminescentes Escherichia coli système permet la caractérisation des opérons lux , Lux protéines et leur interaction.

In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes

Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Nous décrivons ici une procédure qui permet de détecter les bactéries pathogènes à l’échelle de l’organe pendant l’infection et de quantifier les activités des rapporteurs fluorescents.

Tomographie tridimensionnelle à haute résolution des infections microbiennes

Découvrez la détection rapide de Yersinia pestis par phage rapporteur bioluminescent. Cette méthode utilise la luciférase bactérienne pour identifier les pathogènes de catégorie A en minutes.

Phage »Bioluminescent" Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A

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