Name: Techniques de laboratoire aseptiques: Transferts en volume avec pipettes sérologiques et Micropipettes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Apprenez les techniques de laboratoire aseptiques pour les transferts de volume avec pipettes sérologiques et micropipettes. Cette méthode minimise la contamination et assure la précision des expériences microbiologiques.

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Un merci spécial à Cori Sanders aux conceptions IROC pour la préparation des illustrations et de Kris Reddi à l&#39;UCLA pour la mise en place des cultures d&#39;échantillons de chiffres. Le financement de ce projet a été fourni par HHMI (HHMI Grant n ° 52006944).

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Je n&#39;ai rien à communiquer.

Une technique aseptique se réfère à une série de procédures de routine effectuées afin de prévenir des solutions stériles et des cultures de devenir contaminés par des micro-organismes indésirables dans les laboratoires. Ces techniques sont indispensables pour des expériences qui nécessitent des cellules en croissance. Bien qu&#39;un cadre de travail qui est complètement stérile ne peut être atteint, des procédures telles que la désinfection des surfaces de laboratoire, la création d&#39;un champ stérile à l&#39;aide d&#39;un bec Bunsen, en limitant l&#39;exposition des cultures non plafonnés et les médias à l&#39;air, de stérilisation de matériaux tels que des bouteilles, tubes et pipettes en verre, et en évitant tout contact avec des instruments stériles non-stériles surfaces réduit la possibilité de contamination des solutions et des cultures dans une expérience. L&#39;objectif est pour ces mesures de précaution pour devenir une seconde nature, ce qui est livré avec la formation et la pratique tout en travaillant dans un laboratoire. Transferts de volume avec des solutions stériles et des cultures en utilisant des instruments tels que pipettes sérologiques et des microropipettors sont l&#39;un des nombreux types de techniques de routine effectués dans un laboratoire. Différentes applications expérimentales appel à des instruments capables de transférer des volumes distincts, mais précis et exacts. Pipettes sérologiques sont utilisés dans les laboratoires de microbiologie pour préparer les cultures cellulaires nécessitant des préparations des médias portant sur des volumes millilitre, alors que micropipettes sont indispensables pour des expériences de biologie moléculaire qui ont besoin de montants ne microlitres de solutions. Lorsque la technique aseptique est pratiquée avec ces instruments, la contamination est réduit au minimum pendant les transferts de volume indépendamment de la quantité de liquide ou de type d&#39;expérience. Bien que n&#39;étant pas discuté dans le présent protocole, un autre moyen couramment utilisés pour prévenir la contamination est de travailler au sein d&#39;une hotte à flux laminaire (Figure 10). Cet équipement est essentiel pour la culture de tissus et pour des expériences effectuées avec des micro-organismes classés comme BLS-2 ou plus. Une hotte à flux laminaire contient un filtre HEPA (haute efficacitéparticulaire de l&#39;air) de filtre qui supprime les contaminants en suspension dans l&#39;air s&#39;écoulant le capot tout en empêchant l&#39;air non filtré de la chambre de perméation de l&#39;espace de travail. Fait à noter, un bec Bunsen ne peuvent pas être utilisés à l&#39;intérieur d&#39;une hotte à flux laminaire, car la chaleur de la flamme perturbe l&#39;écoulement de l&#39;air indispensable à la fonctionnalité de la hotte. Il est souvent utile de vérifier la qualité de votre technique aseptique lors de la réalisation d&#39;expériences. Pour valider des solutions, et des milieux de culture ne se contaminent au cours des manipulations expérimentales, toujours préparer un contrôle négatif. Par exemple, si la préparation des tubes de bouillon pour la croissance des cultures bactériennes, ne pas ensemencer un tube ne laissant que les médias stériles. Incuber le milieu aux côtés des tubes inoculés ensuite inspecter le tube témoin non inoculé des signes de contamination tels que la turbidité de la croissance de cellules indésirables involontairement introduits dans le tube. Si le tube de contrôle est contaminé, le tube d&#39;expérienceest probable sont contaminés en tant que bien, et l&#39;expérience devra être répétée. Ces mesures de précaution doit être fait avec toutes les expériences.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Bouillon LB </td><td> Difco </td><td> 244620 </td><td> Recette également disponible en référence 6 </td></tr><tr><td colspan="4"> TE Buffer: </td></tr><tr><td> Dihydraté EDTA disodique </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HCl </td><td> Sigma </td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td> CiDecon </td><td> Decon Laboratories, Inc </td><td> 8504 </td><td> Désinfectant </td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A406 </td><td> Pour utilisation comme désinfectant, préparer 70% (v / v) avec de l&#39;eau distillée </td></tr></tbody></table>

techniques de laboratoire aseptiques: transferts en volume avec pipettes sérologiques et micropipettes

Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors

Micro-organismes sont partout - dans l&#39;air, le sol, et le corps humain ainsi que sur des surfaces inanimées comme des bancs de laboratoire et les claviers d&#39;ordinateur. L&#39;omniprésence des microbes crée une offre abondante des contaminants potentiels dans un laboratoire. Pour assurer le succès expérimental, le nombre de contaminants sur les surfaces de l&#39;équipement et les travaux doivent être minimisés. Commune parmi les nombreuses expériences en microbiologie sont des techniques associées à la mesure et le transfert des cultures contenant des cellules bactériennes ou des particules virales. Pour ce faire, sans contact avec les surfaces non stériles ou de contaminer les médias stériles exige (1) préparer un espace de travail stérile, (2) à un réglage précis et avec précision la lecture des instruments pour le transfert aseptique des liquides, et (3) correctement la manipulation des instruments, des flacons, des bouteilles et des cultures des tubes à l&#39;intérieur d&#39;un champ stérile. L&#39;apprentissage de ces procédures exige une formation et la pratique. Dans un premier temps, les actions devraient être lent, délibéré et contrôlé par l&#39;objectif étant pour t aseptiquesechnique pour devenir une seconde nature lorsque l&#39;on travaille sur le banc. Nous présentons ici les étapes à suivre pour mesurer les volumes utilisant des pipettes sérologiques et Micropipettes dans un champ stérile créée par un bec Bunsen. Plage de volumes de microlitres (ul) en millilitres (ml) en fonction de l&#39;instrument utilisé. Liquides couramment transférés comprennent bouillon stérile ou des solutions chimiques, ainsi que des cultures bactériennes et des stocks de phages. En suivant ces procédures, les élèves devraient être en mesure de: <ul><li> Le travail au sein du champ stérile créée par la flamme du brûleur Bunsen. </li><li> N&#39;utiliser que des pipettes sérologiques sans compromettre la stérilité instrument. </li><li> Aspirer des liquides avec des pipettes sérologiques, précisément la lecture des volumes calibrés en alignant le ménisque formé par le liquide à des marques de graduation de la pipette. </li><li> Conservez les bouteilles, flacons, culture tubes et leurs casquettes respectives stériles lors des transferts de liquides. </li><li> Identifier les différentes applications pour le plastique contre verre sérologique pipettes. </li><li> Limites de précision d&#39;État pour micropipettes. </li><li> Précisément, et régler avec précision des volumes sur micropipettes. </li><li> Savoir comment utiliser correctement l&#39;arrêt de première et deuxième sur une micropipette pour aspirer et transférer des volumes corrects. </li></ul>

Lorsque vous travaillez dans un laboratoire, il est impératif de minimiser les sources de contamination. Une technique aseptique se réfère aux procédures qui permettent le transfert des cultures et des réactifs, tout en évitant le contact avec les surfaces non stériles. Pipettes sérologiques et Micropipettes sont utilisés pour mesurer des volumes précis sans compromettre la stérilité des solutions utilisées dans les expériences.

Techniques de laboratoire aseptiques: Transferts en volume avec pipettes sérologiques et Micropipettes

Les microorganismes sont omniprésents : dans l'air, le sol et le corps humain, ainsi que sur des surfaces inertes telles que les paillasses de laboratoire et les claviers d'ordinateur. Le ...

Cette démonstration présente des techniques de laboratoire aseptiques pour le transfert de volumes à l’aide de pipettes serologiques et de pipettes micrométriques sur le plan de travail du laboratoire. Travaillez à l’intérieur du champ stérile créé par la flamme d’un bec Bunsen. Sélectionnez l’instrument de transfert de volume approprié en fonction de l’application.Ensuite, utilisez-les correctement sans compromettre leur stérilité, tout en maintenant la stérilité des réactifs et des matériaux de culture, et aspirez les liquides avec précision, considérés dans leur ensemble. Ces procédures sont essentielles pour minimiser les sources de contamination et assurer la précision dans les expériences de base. Au départ, il est difficile de régler précisément les instruments, de lire leurs valeurs avec exactitude, et de coordonner les mouvements avec les instruments et les matériaux de laboratoire sans compromettre la stérilité des liquides transférés.La pratique d'une technique aseptique en laboratoire est essentielle pour la réussite expérimentale lorsqu'on travaille avec des échantillons vivants ; prenez donc le temps d'apprendre ces procédures afin qu'elles deviennent automatiques. Lorsque vous travaillez au laboratoire, le Dr Chris Reddy, mon responsable de laboratoire, démontrera les protocoles. Lavez toujours soigneusement les mains avec un savon antiseptique et de l'eau tiède avant de commencer toute manipulation en laboratoire. Mouillez d'abord les mains avec de l'eau courante tiède.Appliquez ensuite du savon et répartissez-le soigneusement en frottant énergiquement. Frottez les mains en exerçant une friction sur toutes les surfaces, y compris les pouces, le dos des doigts, le dos des mains et sous les ongles. Rincez ensuite abondamment pour éliminer tout résidu de savon et séchez à l’aide de serviettes en papier distribuées depuis un support.Enfin, à l’aide d’une serviette en papier propre, fermez le robinet et débarrassez la zone de travail de la paillasse du laboratoire. Ensuite, retirez une lingette désinfectante préhumidifiée du récipient et nettoyez entièrement la surface. Laissez le désinfectant s’évaporer à l’aide d’un brûleur.Le bec Bunsen. Ajustez la flamme de manière à faire apparaître le cône bleu au centre. Disposez à proximité du champ stérile de la paillasse du laboratoire tous les fournitures nécessaires à la procédure.Assurez-vous également que tous les matériaux sont correctement étiquetés. Il existe de nombreux types de pipettes serologiques, en plastique ou en verre, jetables ou réutilisables, avec ou sans embout filtrant. Les différentes tailles sont étalonnées avec des embouts qui servent de barrière contre le remplissage excessif de la pipette.Remarquez que les pipettes serologiques sont également étalonnées de deux manières. Les pipettes de type « TD », marquées par deux anneaux doubles à l'extrémité supérieure, sont étalonnées de sorte que le volume présent dans la pointe ne doive pas être délivré. Ceci n'est pas illustré ici, mais les pipettes de type « TC » doivent être soufflées, car elles sont étalonnées pour délivrer la totalité du volume. Utilisez une technique aseptique avec une pipette serologique en plastique stérile, emballée individuellement : commencez par l'extrémité bouchée et commencez à décoller soigneusement le papier.Ne retirez pas entièrement le manchon. Protégez plutôt l'extrémité du manche de la pipette, uniquement la partie supérieure de la pipette située au-dessus des graduations, et fixez un accessoire de pipetage, tel qu'une poire ou un pistolet, à l'extrémité supérieure de la pipette serologique. Tenez l'accessoire de pipetage d'une main et retirez le manchon en papier de la pipette en plastique de l'autre main.Pour les pipettes sérologiques en verre conservées dans des récipients métalliques, desserrer le couvercle du récipient et retirer le bouchon en passant les extrémités ouvertes du bouchon et du récipient à la flamme. Ensuite, poser le bouchon sur le côté, sur la paillasse désinfectée. Tenir le récipient horizontalement et secouer pour faire sortir les embouts d'une ou deux pipettes.Dépassez d'environ un pouce. Placez le récipient sur le côté et retirez une pipette sans toucher les autres pipettes. Veillez à ce que l'extrémité inférieure de la pipette ne soit pas en contact avec les mains ni avec des surfaces non stériles.Procédez à la fixation de l'aspirateur pour pipette. Passez ensuite le tiers inférieur d'une pipette en verre à travers le cône bleu de la flamme du bec Bunsen pendant une à trois secondes. Retirez maintenant le bouchon du flacon contenant le milieu stérile.Placez-le entre l'annulaire et la paume d'une main tout en manipulant l'aspirateur pour pipette avec le pouce, l'index et le majeur de la même main ; de l'autre main, tenez le flacon en biais à un angle de 45 degrés et passez le bord du flacon à travers la flamme du bec Bunsen. Introduisez l'embout stérile de la pipette dans le milieu. Aspirez ensuite à l’aide de l’aspirateur pour pipette en contrôlant le débit selon les graduations.Surveillez le volume aspiré dans la pipette afin de lire précisément le volume. Tenez la pipette verticalement et observez le ménisque du liquide de face, au niveau des yeux. Passez à nouveau le bord du flacon à travers la flamme du bec Bunsen.Ensuite, le boucher. Mettre la bouteille de milieu de côté. Puis prendre un tube stérile de manière aseptique.Retirer le bouchon comme décrit précédemment. Créer un champ stérile en flamant le bord du tube. Dispenser le milieu à l’aide de la pipette dans le tube en contrôlant l’écoulement de l’échantillon afin qu’il ne gicle pas.Flambez le bord. Remettez à nouveau le bouchon et mettez le tube de côté. Retirez maintenant l'aspirateur pour pipette, jetez les pipettes en plastique dans un contenant désigné pour objets tranchants, et immergez les pipettes en verre dans une solution d'eau de Javel à 10 %.Un micropipeteur permet une mesure et une distribution précises de volumes minuscules à l'aide d'instruments de tailles différentes selon les plages de volume spécifiques. Tubes et embouts en plastique pré-stérilisés. Utilisez également une lingette désinfectante pré-humidifiée pour nettoyer les micropipeteurs. Remarque.Le Volter affiche trois chiffres dont l'interprétation dépend du type de micropipette, la précision correspondant au plus petit trait de graduation. Par exemple, le P 20 est utilisé pour des volumes compris entre 2,0 et 20,0 microlitres. Le chiffre supérieur en noir indique les dizaines de microlitres.Le deuxième chiffre noir indique le volume en microlitres. Le chiffre rouge indique les dixièmes de microlitre, de sorte que chaque graduation correspond à un incrément de 0,02 microlitre. Commencez par tourner le bouton de réglage pour ajuster le volume du distributeur tel qu'indiqué sur le voltmètre numérique.Lorsque vous réduisez le volume sur la micropipette, tournez lentement la molette avec le pouce jusqu'au repère gradué. Lorsque vous augmentez le volume, tournez la molette au-delà du repère gradué souhaité d'environ un tiers de tour. Ensuite, tournez lentement la molette vers le bas pour atteindre le volume souhaité.Utilisez toujours des embouts jetables en plastique stériles. Fixez un embout fermement à l'extrémité du corps de la micropipette. Appuyez vers le bas et tournez légèrement pour garantir un joint étanche à l'air.Tenez la micropipette en position verticale. Notez que la micropipette possède trois positions : repos, premier arrêt et second arrêt.Appuyez sur le bouton poussoir du piston depuis la position de repos jusqu'au premier arrêt afin de déplacer un volume d'air équivalent au volume réglé. Plongez ensuite la pointe dans le liquide tout en maintenant le bouton poussoir enfoncé jusqu'au premier arrêt. Relâchez lentement le bouton poussoir pour aspirer le liquide dans la pointe.Lorsque le bouton-poussoir atteint la position de repos, attendez que le liquide soit aspiré dans l'embout. Retirez ensuite l'embout du liquide. Vérifiez visuellement le niveau d'aspiration du liquide dans l'embout, en vous assurant qu'aucune bulle d'air n'est présente.Placer la pointe à un angle de 10 à 45 degrés par rapport à la paroi du tube qui reçoit le liquide. Appuyer ensuite lentement sur le bouton poussoir du piston jusqu'au premier arrêt. Expulser le liquide.Après un instant, appuyez sur le bouton-poussoir jusqu'au deuxième cran pour expulser tout liquide résiduel. Dans l'embout, retirez ensuite l'embout du liquide puis relâchez le piston en position de repos. Enfin, jetez les embouts dans le conteneur désigné pour les déchets tranchants en appuyant sur le bouton d'éjection de la micropipette.Désactivez d'abord le brûleur à becs. Après avoir rangé tous les fournitures et réactifs, passez une lingette désinfectante sur les surfaces extérieures du matériel de laboratoire avant de les déplacer vers leur lieu de stockage. Ensuite, placez le matériel en verre contaminé et les déchets dangereux dans les conteneurs d'élimination appropriés.Procéder à l'essuyage de toute la zone de travail une fois de plus, en laissant l'agent désinfectant s'évaporer. Enfin, se laver soigneusement les mains avec un savon antiseptique et de l'eau tiède. En l'absence de technique stérile, les cultures peuvent être contaminées et retarder les expériences.Le transfert aseptique de liquides à l’aide de pipettes sérologiques est essentiel pour amplifier des cultures bactériennes pures, comme cette préparation d’E. coli de 25 millilitres. De plus, les pipettes sérologiques permettent le transfert aseptique de liquides dans des tubes à essai stériles. Cet exemple illustre une culture pure par rapport à une culture contaminée d’E. coli lors d’une distribution de milieu de bout en bout dans les tubes.Parfois, des volumes précis sont nécessaires. Il est évident qu'il y a dans ce cas un transfert imprécis du milieu. Cet exemple montre un volume incorrect de tampon transféré.Au lieu de distribuer 12,5 microlitres, l'étudiant a distribué 125 microlitres. Bien que les chiffres soient réglés de manière identique sur le volpipeteur, le micro-pipeteur inapproprié a été sélectionné pour cette tâche. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez maîtriser l'application de la technique aseptique aux procédures de laboratoire courantes, telles que le transfert de solutions et de cultures à l'aide de pipettes serologiques et de micro-pipeteurs, sans compromettre leur stérilité.L'objectif est que les procédures de précaution, telles que la stérilisation à la flamme du matériel en verre, des embouts de pipette, des tubes de culture et des flacons, ainsi que le travail à l'intérieur d'un champ stérile sur la paillasse du laboratoire, deviennent habituelles lors de chaque expérience. Il est également essentiel de mesurer et de distribuer des volumes précis et exacts lors de la réalisation d'expériences. Apprendre à utiliser correctement ces instruments de transfert de volume améliorera la fiabilité des résultats expérimentaux.

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Lorsque vous travaillez avec les médias et des réactifs utilisés pour les micro-organismes de la culture, une technique aseptique doit être pratiqué afin d'assurer la contamination est réduit au minimum. Une variété de méthodes de placage sont couramment utilisés pour isoler, de propager ou de bactéries et de phages énumérer, toutes les procédures qui incorporent qui maintiennent la stérilité des matériaux expérimentaux.

Techniques de laboratoire aseptiques: Méthodes de placage

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Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

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Infection expérimentale avec<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En tant que modèle pour l&#39;étude de l&#39;hôte Réponses Interféron-y

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