Name: Dans limagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Apprenez l'imagerie in vivo stable de la moelle épinière chez la souris par microscopie à deux photons. Cette méthode réduit les artefacts de mouvement respiratoire et permet l'étude longitudinale des dynamiques cellulaires.

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Ce travail a été soutenu par la National Multiple Sclerosis Society accorde RG4595A1 / T à DD et les subventions des NIH / NINDS NS051470, NS052189 et NS066361 aux figures KA et des films adaptés et / ou tiré à part de Davalos et coll., J Neurosci Méthodes. Mars 2008 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, avec la permission d&#39;Elsevier.

1. Construire le dispositif de stabilisation spinale <ol><li> Ordre de la mission STS-A Narishige Compact Pinces moelle épinière et le Narishige MA-6N adaptateur tenant la tête. </li><li> Conception sur mesure et faire une plaque en acier inoxydable de base pour tenir les deux parties Narishige dans l'alignement de sorte que la tête de l'animal est pris en charge alors que sa colonne vertébrale et la queue sont serrées. Gardez à l'esprit que l'ensemble du dispositif doit pouvoir être placés sous l'objectif du microscope généralement sur une platine de microscope abaissé. </li></ol> 2. La chirurgie des animaux <ol><li> Pré-chauffer la chambre du microscope avec un dispositif de chauffage de l'air et le maintenir à 37 ° C. </li><li> Peser les animaux et faire le mélange anesthésique en utilisant 100 mg de kétamine, 15 mg de xylazine et 2,5 acépromazine mg par kg de poids corporel, dilué dans une solution de NaCl 0,9% dans des conditions stériles. </li><li> Anesthésier les animaux par l'injection de l'anesthésique mélange (KXA) par voie intrapéritonéale. Pincer orteils doivent être effectuées régulièrement pour s'assurer une anesthésie profonde à traversl'expérience. Supplément avec la moitié de la dose initiale horaire ou selon les besoins. </li><li> Utilisez un tapis de petits animaux de chauffage à fournir un soutien thermiques tout en effectuant la procédure chirurgicale. </li><li> Appliquer une pommade artificielle des larmes sur les yeux pour éviter la déshydratation de la cornée et des dommages. </li><li> Rasez le dos de l'animal d'abord avec un dispositif de coupe et ensuite avec une lame tranchante pour supprimer complètement les cheveux de la zone autour de l'incision. </li><li> Enlever les poils rasés et désinfecter la surface de la peau rasée avec un tampon d'alcool. </li><li> Effectuer un petit (~ 1,5 cm) incision longitudinale de la peau sur le niveau souhaité vertébrale (vertèbres thoraciques représenté ici). </li><li> Exposer la musculature arrière par attentivement rétractant le tissu conjonctif sous-cutané. </li><li> Soigneusement séparée des muscles paravertébraux de la colonne vertébrale au niveau désiré. Effectuer le moins possible de détacher les incisions les muscles des deux côtés de chaque processus épineux et puis gratter les muscles détaché unchemin de la surface laminaire. </li><li> Choisissez la lame qui sera enlevé et préparer les sites d'entrée pour les pinces de la colonne vertébrale de chaque côté de la colonne vertébrale, juste rostrale et caudale de la laminectomie. Soigneusement supplanter tissu musculaire pour faire quatre poches où les pinces seront insérés. </li><li> Soulevez la colonne vertébrale avec la denture droite pointe pince pour permettre l'insertion sûre des courbes émoussées la pointe des ciseaux sous la lame sans toucher la moelle épinière. Effectuez la laminectomie par lentement couper les os d'un côté puis de l'autre côté. </li><li> Utilisez un coton-tige ou d'insérer prédécoupés petits morceaux Gelfoam éponge de gélatine absorbable à côté de l'incision pour limiter les saignements mineurs. Utiliser un petit bâtiment cauterizer pour contrôler les saignements supplémentaires si nécessaire. Utilisez préchauffé stériles fluide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) de laver les tissus. </li></ol> 3. Stabilisation de la colonne vertébrale et la préparation pour l'imagerie in vivo <ol><li> Plac e l'animal sur un coussin d'altitude sur la plaque de base du dispositif de stabilisation vertébrale et sécuriser la tête dans l'adaptateur de tête de portefeuille. </li><li> Placer les pinces vertébrale de la mission STS-Un dispositif le long de l'axe antéro-postérieur de l'animal dans les poches pré-préparés flanquant la laminectomie (figure 1). Les deux pinces doivent être placés à un angle de ~ 45 ° par rapport à rostro-caudale de l'animal axe pour laisser un espace suffisant pour faire baisser une lentille à immersion d'eau au cours de la moelle épinière exposée (figure 1). </li><li> Placez la pince tiers de la mission STS-Un dispositif à la base de la queue pour le corps de l'animal peut être en suspension dans l'air après le retrait de la plaquette d'altitude pour la durée des expériences d'imagerie (figure 1). </li><li> Construire un petit puits d'Gelseal (Amersham Biosciences Corp) autour de la moelle épinière exposés afin de faciliter le maintien de la moelle épinière dans l'ACSF et l'immersion de l'objectif du microscope dans cette solution pour l'imagerie in vivo. </li></ol>jove_title "&gt; 4. Dans l'imagerie in vivo de la moelle épinière de souris avec la microscopie à deux photons <ol><li> Transfert de l'animal sur le dispositif de stabilisation spinale intérieur de la chambre préchauffé couvrant le microscope et le fixer sur une platine de microscope abaissé plaçant la laminectomie droites sous la lentille (figure 1). </li><li> Une lentille Lower immersion dans l'eau avec précaution dans la solution ACSF veillant à ce qu'elle ne touche pas les pinces épinière ou du Gelseal. </li><li> Utilisez épifluorescence pour identifier la zone d'intérêt et se concentrer sur elle. Passer en mode balayage laser et d'effectuer l'imagerie in vivo en utilisant l'appropriée à deux photons de longueur d'onde d'excitation laser, dichroïques et de filtres passe-bande pour les fluorophores présents dans le tissu imagée. </li></ol> 5. Imagerie répétitive et soins post-opératoires <ol><li> A la fin des expériences d'imagerie, retirez la souris à partir du dispositif de stabilisation vertébrale et essuyez soigneusement le Gelseal de la zone autour de la laminectomie.Nettoyez bien la région. </li><li> Restaurer et suture les muscles du dos au cours de la laminectomie. </li><li> Restaurer et suture la peau au cours de la laminectomie, il tampon avec la bétadine. </li><li> Fournir une solution de lactate de Ringer ml (Baxter Healthcare) comme un complément nutritif et l'hydratation, ainsi que le traitement antalgique par voie sous cutanée (0,1 mg / kg de buprénorphine). </li><li> Administrer un traitement antiseptique par voie intrapéritonéale (0,03 ml par souris, 2,27% enrofloxacine solution injectable antibactérien). </li><li> Placer sur des animaux d'un coussin chauffant jusqu'à la guérison complète de l'anesthésie et ensuite on la maison individuelle. </li><li> Répétez l'administration antiseptique quotidien pour les 3-5 premiers jours après la chirurgie et le traitement antalgique toutes les 8-12 heures pendant 2-3 jours post-opératoire. Surveiller les animaux quotidiennement pour assurer un comportement normal et le rétablissement complet. </li><li> Pour re-imagerie à travers la laminectomie même, la réouverture de la peau suturée et les muscles et répéter les étapes décrites dans les sections 2 - 4. </li><li> Re-localiser les précéously imagé zone en utilisant la vascularisation artérielle comme une carte, comme décrit précédemment 10. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Toutes les procédures animales ont été réalisées sous les directives établies par les soins des animaux et des comités institutionnels Utiliser à l'Université de Californie, San Francisco et sont conformes à la réglementation fédérale. Une image du dispositif de stabilisation vertébrale et un schéma montrant le positionnement de la souris sur le périphérique sous une lentille de microscope est montré dans la figure 1. Permettre une salle adéquate pour les mouvements de la respiration au-dessous du corps de l'animal assure la stabilité de l'imagerie in vivo dans la moelle épinière. La figure 2 montre la relation étroite entre les microglies et les vaisseaux comme il a été imagé in vivo dans la moelle épinière des CX3CR1 GFP / + souris transgéniques 18, dans lequel les microglies sont étiquetés avec la GFP endogène. Figure 3 montre des exemples répétitifsl'imagerie in vivo tel qu'il a été effectué dans les mêmes régions de la moelle épinière chez la souris exprimant une protéine fluorescente dans des axones épinière (YFP-H ligne 3) et la microglie (CX3CR1 dans la GFP + / souris). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Stabilisation de la colonne vertébrale de souris pour l'imagerie in vivo en utilisant microscopie à deux photons. (A) une plaque personnalisée fait d'acier de base est utilisé pour soutenir et aligner la mission STS-A Narishige compacte pinces de la moelle épinière et la MA-6N Narishige tête de la tenue adaptateur comme indiqué ici. (B) Le positionnement correct de l'adulte de souris transgéniques anesthésiés avec un anesthésique KXA sur le dispositif de stabilisation vertébrale. L'insert montre le placement des pinces épinière immédiatement rostralement et caudalement à la laminectomie et les tissus de la moelle épinière exposées. &lt;img alt = "Figure 2" src = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" /&gt; Figure 2. Dans l'imagerie in vivo des cellules microgliales haute densité et des vaisseaux sanguins dans la moelle épinière des souris anesthésiées. Projections, mais non-alignés z-piles de (A) très dense GFP-positives microglie (vert) dans la moelle épinière d'un CX3CR1 GFP / souris + à proximité de vaisseaux sanguins (rouge, marqué avec injection IV de la rhodamine dextran). (B) l'image à fort grossissement étiquetés comme en (A) d'une seule cellule microgliale attaché à la paroi d'un vaisseau sanguin avec les processus étendus autour du navire et vers le parenchyme de la moelle épinière. Barres d'échelle, 10 microns. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Répétitifs imagerie in vivo des mêmes segments axonaux et microglies comme ils ont été relocalisés et reimaged dans la moelle épinière des souris anesthésiées à des jours différents. (A) YFP-Lab axones ELED aux jours 0 et 5. (B). Les mêmes structures vasculaires et les cellules microgliales autour d'eux imagé in vivo dans la moelle épinière des CX3CR1 GFP / souris + aux jours 0 et 1. Barres d'échelle, 10 microns. Vidéo 1. Séquence timelapse Représentant acquises in vivo de la moelle épinière de souris. Cette séquence montre en détail la dynamique processus de fines microgliales (vert) et leurs interactions avec le système vasculaire (rouge, marqué avec injection IV de la rhodamine dextran) dans le temps dans un tissu densément peuplées avec des structures fluorescentes. Les images brutes ont été corrigées pour que le bruit de fond, la luminosité et le contraste et le film a été construit par timelapse z projetant des piles d'images séquentiellement acquises, sans alignement de l'image, avec une moyenne ou z-sélection des avions individuels. Les vaisseaux sanguins passent par une gamme similaire de plans z que les images de la microglie. Profondeur de plan Z: 38 um.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "&gt; Cliquez ici pour regarder le film. Séquence Timelapse Movie 2. Démontrant la stabilité de la méthode brute d'imagerie à l'échelle d'un seul z-plan. L'acquisition rapide de la même et unique plan z dans la moelle épinière des souris GFP CX3CR1 / + mis sur le dispositif de stabilisation vertébrale sous anesthésie KXA, démontre le déplacement d'image minimale entre les images consécutives à une vitesse de balayage de 1 image / s qui est plus rapide que le rythme respiratoire de la souris. Le déplacement mineure résiduelle est probablement dû au battement de coeur. <a alt="Movie 2" href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">Cliquez ici pour regarder le film.</a>

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
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<li>Christie, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+arrest+of+individual+senile+plaques+in+a+model+of+Alzheimer%27s+disease+observed+by+in+vivo+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy.</a> J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).</li>
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<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li>
<li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li>
<li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4%2B+T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li>
<li>Lindquist, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).</li>
<li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

La méthode décrite ici permet de stable et répétitive en imagerie in vivo de la fluorescence densément peuplées structures cellulaires dans la moelle épinière des souris anesthésiées à l&#39;aide microscopie à deux photons. La stabilité obtenue est le résultat d&#39;un instrument fait sur mesure et une stabilisation de la colonne vertébrale protocole anesthésique qui réduit d&#39;artefact mouvement respiratoire induite. Le dispositif de stabilisation vertébrale permet de répit sous le corps de la souri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Rhodamine B dextrane </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 70 kDa, dilué dans ACSF (3% p / v) </td></tr><tr><td> Kétamine HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC Non: 67457-001-10 </td><td> Injectable, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> Lloyd Labs </td><td> NADA Non: 139-236 </td><td> Injectables xylazine, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acépromazine </td><td> Vedco </td><td> NADA Non: 117-531 </td><td> Injectable, 10mg/ml </td></tr><tr><td> Les larmes artificielles onguent </td><td> Phoenix pharmaceutiques </td><td> NDC Non: 57319-760 - 25 </td><td> Lubrifiant </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Fisher </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> McPherson Westcott Ciseaux </td><td> Précision du Monde Instruments </td><td> 555500S </td><td> Courbé, émoussé pointe ciseaux </td></tr><tr><td> Pince droite </td><td> Précision du Monde Instruments </td><td> 555047FT </td><td> Pince la pointe crantée </td></tr><tr><td> Petit bâtiment cautériser </td><td> Outils Fine Science </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, Pfizer Inc </td><td> Mixer Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Compact de la moelle épinière pinces </td><td> Narishige </td><td> STS-A </td><td></td></tr><tr><td> Adaptateur de tête tenant </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences Corp </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer </td><td> Baxter Healthcare &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc </td><td> NDC Non: 12496 - 6757-1 </td><td> La buprénorphine, injectables </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> NADA 140-913 </td><td> Enrofloxacine, injectable antibactérien 2,27% (20ml) </td></tr><tr><td> Coussin chauffant - Grand </td><td> Outils Fine Science </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

L&#39;imagerie in vivo en utilisant microscopie à deux photons dans une souris qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer des protéines fluorescentes dans des types cellulaires 2-3 a sensiblement élargi notre connaissance des processus physiologiques et pathologiques dans de nombreux tissus in vivo 4-7. Dans les études sur le système nerveux central (SNC), il ya eu une large application de l&#39;imagerie in vivo dans le cerveau, qui a produit une pléthore de nouvelles et les résultats souvent inattendus sur le comportement des cellules comme les neurones, les astrocytes, la microglie, sous conditions physiologiques ou pathologiques 8-17. Toutefois, des complications essentiellement techniques ont limité la mise en œuvre de l&#39;imagerie in vivo dans des études de la moelle épinière de souris vivante. En particulier, la proximité anatomique de la moelle épinière vers les poumons et le cœur génère des artefacts importants mouvements qui permet l&#39;imagerie de la moelle épinière qui vivent une tâche difficile. </p&gt; Nous avons développé une nouvelle méthode qui permet de surmonter les limitations inhérentes à l&#39;imagerie de la moelle épinière par la stabilisation de la colonne vertébrale, réduisant respiratoires induites par les mouvements et en facilitant ainsi l&#39;utilisation de la microscopie à deux photons à l&#39;image de la moelle épinière de souris in vivo. Ce résultat est obtenu en combinant un dispositif de stabilisation spinale personnalisé avec une méthode d&#39;anesthésie profonde, résultant en une réduction significative des maladies respiratoires induites par les mouvements. Ce protocole vidéo montre comment exposer une petite zone de la moelle épinière qui vivent peut être maintenu sous des conditions physiologiques stables sur de longues périodes de temps en gardant une lésion des tissus et des saignements au minimum. Représentant des images brutes acquises en détail in vivo à haute résolution de la relation étroite entre les microglies et la vascularisation. Une séquence timelapse montre le comportement dynamique des processus microgliales dans la moelle épinière de souris vivante. Par ailleurs, une analyse continue de la même z-cadre démontrents la stabilité exceptionnelle que cette méthode peut réaliser pour générer des piles d&#39;images et / ou des films timelapse qui ne nécessitent pas d&#39;alignement d&#39;image post-acquisition. Enfin, nous montrons comment cette méthode peut être utilisée pour revisiter et réimager la même zone de la moelle épinière au timepoints plus tard, permettant des études longitudinales de cours de processus physiologiques ou pathologiques in vivo.

Un protocole minimalement invasive pour stabiliser la colonne vertébrale de souris et d&#39;effectuer répétitives<em&gt; In vivo</emImagerie&gt; moelle épinière en utilisant microscopie à deux photons est décrit. Cette méthode combine un dispositif de stabilisation vertébrale et un régime d&#39;anesthésie afin de minimiser les mouvements induits par des voies respiratoires et de produire des données d&#39;imagerie brutes qui ne nécessitent pas d&#39;alignement ou d&#39;autres post-traitement.

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

L'imagerie in vivo par microscopie biphotonique chez des souris modifiées génétiquement pour exprimer des protéines fluorescentes dans des types cellulaires spécifiques a ...

L'objectif de cette procédure est de réaliser un examen stable in vivo de la moelle épinière chez la souris à l'aide de la microscopie à deux photons. Cela est réalisé en anesthésiant d'abord l'animal avec un mélange anesthésique permettant d'obtenir un rythme respiratoire régulier tout en restant calme. La deuxième étape de la procédure consiste à exposer la colonne vertébrale au niveau souhaité, puis à effectuer une laminectomie afin de découvrir la moelle épinière sous-jacente, ce qui permet son imagerie in vivo.La troisième étape consiste à placer l'animal sur le dispositif de stabilisation vertébrale. La dernière étape est l'isolement du segment de moelle épinière exposé. En prévision de l'imagerie in vivo, des résultats peuvent finalement être obtenus, détaillant le comportement dynamique des cellules et leurs interactions avec d'autres types cellulaires ou structures dans la moelle épinière vivante, grâce à l'imagerie in vivo en laps de temps utilisant la microscopie à deux photons.Le principal avantage de cette technique par rapport aux tentatives antérieures d'imagerie de la moelle épinière in vivo réside dans sa capacité à produire des données d'imagerie in vivo qui ne nécessitent aucun post-traitement et peuvent être évaluées immédiatement et utilisées pour des analyses ultérieures. Les implications de cette technique s'étendent aux traitements après une lésion ou une maladie de la moelle épinière, car elle permet, par exemple, d'étudier en temps réel la progression de la dégénérescence ou de la régénération axonale après une lésion, outre les lésions médullaires elles-mêmes. Cette technique peut être utilisée pour étudier l'évolution de processus inflammatoires ou neurodégénératifs dans des modèles animaux de maladies, telles que la sclérose en plaques ou la sclérose latérale amyotrophique, où la pathologie de la maladie est particulièrement marquée au niveau de la moelle épinière.Commencez la procédure par la pesée de l'animal. Ensuite, anesthésiez l'animal en injectant le mélange anesthésique par voie intrapéritonéale. Effectuez régulièrement une pincée plantaire pour vérifier l'anesthésie profonde de l'animal tout au long de l'expérience, et complétez par une demi-dose de l'anesthésique initial chaque heure, ou selon les besoins.Appliquez ensuite la pommade artificielle pour les yeux sur les paupières afin d'éviter la déshydratation et les lésions cornéennes. Tondez les poils sur le dos de l'animal à l'aide d'un appareil de tonte, puis rasez les poils résiduels avec une lame bien aiguisée. Après avoir désinfecté la zone rasée, placez l'animal sous un microscope et commencez la procédure en pratiquant une petite incision longitudinale d'environ 1,5 centimètre au niveau vertébral souhaité.Exposer la musculature dorsale en rétractant soigneusement le tissu conjonctif sous-cutané. Ensuite, séparer délicatement les muscles paravertébraux de la colonne vertébrale au niveau souhaité. Effectuer le moins d'incisions possible pour détacher les muscles des deux côtés de chaque apophyse épineuse.Ensuite, grattez les muscles détachés de la surface du lamellé. Utilisez un cautère à petit vaisseau pour contrôler tout saignement mineur si nécessaire. Poursuivez le grattage des muscles jusqu'à ce que le lamellé sous-jacent soit suffisamment exposé et que vous puissiez clairement identifier celui que vous allez retirer.Pour préparer les sites d'entrée des pinces rachidiennes de chaque côté de la colonne vertébrale, insérez les pointes d'une paire de ciseaux courbes entre les muscles paravertébraux et déplacez délicatement le tissu musculaire afin de créer quatre poches où seront insérées les pinces. Soulevez la colonne vertébrale à l’aide de la pince à pointes droites pour permettre l’insertion en toute sécurité des ciseaux courbes à pointes émoussées sous la lame, sans toucher la moelle épinière. Procédez ensuite à la laminectomie en coupant lentement l’os d’un côté, puis de l’autre. Utilisez un coton-tige ou insérez un petit morceau de gel mousse absorbable en gélatine préalablement découpé à côté de l’incision afin de limiter les saignements mineurs.Ensuite, utilisez le liquide céphalorachidien artificiel stérile préchauffé pour laver le tissu. Un dispositif de stabilisation vertébrale a été conçu sur mesure, composé principalement des pinces pour moelle épinière Nagate STSA et de l'adaptateur de maintien de tête Nagate MA six N. Une plaque de base en acier inoxydable a été fabriquée afin de maintenir deux pièces naga alignées, de sorte que la tête de l'animal soit soutenue tandis que sa colonne vertébrale et sa queue sont fixées.Gardez à l'esprit que l'appareil entier doit pouvoir tenir sous l'objectif du microscope avec la platine abaissée afin de stabiliser l'animal. Commencez par le placer sur un tampon surélevé situé sur la plaque de base du dispositif de stabilisation rachidienne. Après avoir fixé la tête dans l'adaptateur de maintien de la tête, positionnez la pince rachidienne du dispositif SDSA le long de l'axe antéropostérieur de l'animal, dans les poches préparées à l'avance, de part et d'autre de la laminectomie.Placer les deux pinces à un angle d'environ 45 degrés par rapport à l'axe cordal ROS de l'animal afin de laisser suffisamment d'espace pour abaisser l'objectif à immersion dans l'eau au-dessus de la moelle épinière exposée. Ensuite, placer la troisième pince à la base de la queue afin que le corps de l'animal puisse être suspendu après le retrait du coussin d'élévation lors de l'expérience d'imagerie. Puis, former un petit puits de gel scellant autour de la moelle épinière exposée afin de faciliter le maintien de celle-ci dans un liquide CSF.Ensuite, retirez le coussin surélevé lorsque vous êtes prêt à commencer l'imagerie in vivo, amenez le dispositif de stabilisation dans la chambre du microscope préchauffée et placez-le sur la platine du microscope abaissée. Veillez à aligner la laminectomie avec l'objectif. Abaissez soigneusement l'objectif à immersion dans la solution ACSF, et assurez-vous qu'il ne touche ni les pinces rachidiennes ni le joint en gel.Utilisez la fluorescence épiscopique pour identifier la zone d’intérêt, puis focalisez-vous dessus. Passez en mode de balayage laser et effectuez l’imagerie in vivo en utilisant l’excitation laser à deux photons appropriée, la longueur d’onde, les dichroïques et les filtres passe-bande adaptés aux fluorophores présents dans le tissu à imager. À la fin des expériences d’imagerie, retirez l’animal du dispositif de stabilisation spinale.Essuyez soigneusement le joint du gel dans la zone entourant la laminectomie et nettoyez-la. Suturez correctement les muscles du dos par-dessus la laminectomie. Ensuite, suturez l'incision cutanée et passez du Bétadine à l’aide d’un coton-tige, comme illustré ici sous forme de projection d’images de Zack telles qu’elles ont été obtenues in vivo, puis projetées ultérieurement le long de l’axe Z sans alignement d’image.L'image montre des cellules microgliales positives pour la GFP très denses en vert, en proximité étroite avec les vaisseaux sanguins en rouge dans la moelle épinière. Voici une image à fort grossissement d'une cellule microgliale unique attachée à la paroi d'un vaisseau sanguin, montrant en détail certains de ses prolongements s'étendant autour du vaisseau et d'autres en direction du parenchyme médullaire. Voici un exemple d'imagerie in vivo répétée des mêmes segments axonaux marqués par la YFP, tels qu'ils ont été localisés à nouveau et reimager dans la moelle épinière du même souris de lignée YFPH lors de deux séances distinctes espacées de cinq jours. Il s'agit d'un autre exemple d'imagerie répétée montrant les mêmes structures vasculaires et cellules microgliales imagées in vivo dans la moelle épinière lors de deux jours consécutifs.Voici une séquence représentative en lapso-temporel acquise in vivo à partir de la moelle épinière. Cette séquence montre en détail le comportement dynamique des prolongements fins des cellules microgliales en vert et leurs interactions avec la vascularisation en rouge. Au fil du temps, les images brutes ont uniquement été corrigées pour le bruit de fond, la luminosité et le contraste, et le film en lapso-temporel a été construit par rejet séquentiel des piles d'images sans alignement d'image.En moyennant la sélection australienne de plans individuels, les vaisseaux sanguins traversent une gamme similaire de plans Z que les images de microglie. La profondeur du volume image est de 38 micromètres. Il s'agit d'une séquence en lapse de temps montrant la stabilité de la méthode d'imagerie au niveau d'un seul plan Z.L'acquisition rapide du même plan Z unique dans la moelle épinière d'une souris hétérozygote CX trois, CR un GFP anesthésiée avec le mélange KXA et placée sur le dispositif de stabilisation vertébrale démontre un déplacement d'image minimal entre les images consécutives. Notamment, la fréquence de cette séquence était d'une image par seconde, ce qui est plus rapide que la fréquence respiratoire de la souris. Le léger déplacement résiduel est probablement dû aux battements cardiaques de l'animal.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de limiter le nombre d'incisions au minimum et de tenter d'arrêter tout saignement mineur dès qu'il apparaît. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez maintenant bien comprendre comment effectuer un imagerie stable in vivo dans le muscle pectoral de la souris en utilisant la microscopie biphotonique.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Source : Nishimura, C.  et al. Quantification de l’architecture vasculaire cérébrale à l’aide de la microscopie à deux photons dans un modèle murin de neuroinflammation induite par le VIH. J. Vis. Exp. (2016). Cette vidéo démontre la visualisation in vivo des capillaires corticaux dans le cerveau de la souris à l’aide de la microscopie à deux photons. Il décrit les étapes à suivre pour injecter un colorant fluorescent dans une souris anesthésiée avec une fenêtre corticale crânienne mince,...

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Apprenez l'imagerie in vivo stable de la moelle épinière chez la souris par microscopie à deux photons. Cette méthode réduit les artefacts de mouvement respiratoire et permet l'étude longitudinale des dynamiques cellulaires.

Dans l'imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

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