Name: Modèle murin docclusion artère cérébrale moyenne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Découvrez le modèle d'occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne chez la souris pour étudier l'ischémie cérébrale focale. Cette méthode chirurgicale permet d'évaluer la taille de l'infarctus par coloration au TTC sans craniectomie.

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Ce travail a été soutenu par NIH NS057195, UCSF REAC prix, et la Kent State University fonds de démarrage à WH Chou.

1. Méthode MCAO Ce protocole a été approuvé par le soin des animaux et des comités institutionnels Utiliser à l'UCSF et la Kent State University, et respecte les National Institutes of Health des lignes directrices pour l'utilisation des animaux de laboratoire. <ol></ol><ol><li> Couper une suture monofilament 5-0 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) en 20 segments mm. Autour de la pointe de chaque segment en le chauffant près d'un cauterizer (Braintree Scientific, Inc, Boston, MA). Mesurer le diamètre de la pointe à l'aide d'un micromètre (Applied Image Inc, Rochester, NY). Nous utilisons une suture avec un diamètre de l'extrémité finale de 0,21 à 0,22 mm pour une souris dont le poids corporel de 25-30 g. </li><li> Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage (minimum 121 ° C, 15 psi, pendant 15 min.) Désinfectez la table d'opération et des équipements associés à l'aide d'éthanol à 70%. </li><li> Anesthetize une semaine, âgé de 8 à 12 souris (25-30 g) avec 5% d'isoflurane (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) dans 30% d'O 2 / 70% N 2 O en utilisant le système V-10 d'anesthésie (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Après l'induction de l'anesthésie, de réduire le niveau de l'isoflurane et le maintenir à 1,5%. </li><li> Placez la souris dans la position couchée sur un coussin chauffant. Insérez une sonde rectale, et de surveiller et de maintenir la température corporelle de 36,5 à 37,5 ° C entre l'aide de la TR-200 du système de température homéothermes (Beaux-Sciences Tools Inc, Foster City, CA). </li><li> Rasez la fourrure sur la région du cou ventrale avec une tondeuse électrique (Braintree scientifique) afin d'exposer la peau. Désinfecter le site chirurgical en utilisant trois applications d'éthanol à 70%. </li><li> Sous un microscope stéréo dissection (Nikon, Japon), faire une longue incision de 1 cm sur la ligne médiane du cou. Utilisez écarteurs (Braintree scientifique) pour exposer le champ opératoire et d'identifier les artère carotide commune droite (CCA), artère carotide externe (CEA), et l'artère carotide interne (ACI). Soigneusement disséquer les artères entourant libre de nerfs et le fascia. </li><li> Disséquer le CEA encore distal et coaguler le CEA et son artère thyroïdienne supérieure (STA) branche en utilisant un coagulateur bipolaire (Howard Instrument Inc, Tuscaloosa, AL). Couper le CEA et STA au segment coagulé. </li><li> Librement lier deux 8-0 sutures de soie autour du moignon de la CEA. Appliquer une pince vasculaire (Outils Fine Science) à la bifurcation de la CCA dans le CEA et l'ICA. </li><li> Faire une petite incision à la fin de la CEA souche avec des ciseaux à ressort Vannas style (Outils Fine Science). Mesurer et noter la longueur d'une suture monofilament 5-0 arrondies à leur extrémité. Insérez le fil de suture dans l'incision et l'avance à la pince. Serrez les deux fils de soie autour de la lumière juste assez pour sécuriser tout en préservant la mobilité de la suture monofilament à demeure. </li><li> Retirez la pince de la bifurcation. Doucement avancer la suture de monofilament de la lumière de la CEA dans le ICA pour une distance de 9-10 mm au-delà de la bifurcation de l'ACC pour occlure l'origine de la MCA. La durée de la chirurgie est d'environ 30-45 min. </li><li> Suture de l'incision sur le cou et placez la souris dans une boîte de 35 ° C de soins infirmiers à se remettre de l'anesthésie, et le retourner à la cage. Il prend généralement 5-10 min pour les souris à se remettre de l'anesthésie. Pour effectuer MCAO transitoire, le chercheur peut re-anesthésier la souris et de retirer la suture de nouveau dans la souche de la CEA, après une période de temps, généralement entre 0.5 à 2 h. </li><li> Vingt-quatre heures après l'induction de la MCAO, anesthésier la souris avec 5% d'isoflurane et de l'euthanasier par dislocation cervicale. Décapitez la souris et de recueillir le cerveau. Trancher le cerveau coronaire en quatre tranches de 2 mm avec une matrice de cerveau (Braintree scientifique) sur la glace. Incuber les coupes de cerveau de 2% de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) (Sigma-Aldrich) dans du PBS 1X pendant 20 min à température ambiante pour déterminer la taille et l'étendue de l'infarctus. Fixer les tranches de cerveau de 10% tamponné neutre solution de formol (Sigma-Aldrich) à 4 ° C jusqu'à ce que l'imagerie. L'étendue de l'infarctus peut être quantifiée comme décrit dans le protocole JoVE 955 ( <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955</a> ) 9. </li></ol> 2. Les résultats représentatifs <ol></ol> L'infarctus généré par MCAO sont vus dans le striatum et le cortex dorsolatéral. Le striatum est plus sensible à l'ischémie que le cortex cérébral. Trente minutes de MCAO va produire un infarctus que dans le striatum, tandis que plus d'une heure de MCAO va endommager à la fois le striatum et le cortex. Après 24 h MCAO permanente, le pourcentage d'infarctus totale est ~ 40 ± 5% de l'hémisphère et le taux de mortalité après chirurgie est ~ 10%. Nous excluons les souris à partir d'études supplémentaires si saignement excessif survient pendant la chirurgie, le temps de fonctionnement supérieur à 90 min, les souris ne parviennent pas à remettre de l'anesthésie dans les 15 min, ou une hémorragie se trouve dans les tranches de cerveau ou à la base du cercle de Willis lors de l'examen post-mortem . jove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2761/2761fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Images représentant la figure 1. Des tranches de cerveau TTC teinté (niveau coronal 1-4) après 24 h de MCAO permanente. Dans les tissus vivants TTC est enzymatiquement réduite par les déshydrogénases au 1,3,5-triphenylformazan (TPF), qui est de couleur rouge, tandis que dans les zones nécrotiques elle reste blanche en raison de l'absence d'activité enzymatique de type. Par conséquent, la zone de l'infarctus peut être identifié par sa couleur blanche en raison de l'absence de conversion de TTC de TPF. Remarque: TTC est un peu de chaleur et de lumière instables afin de protéger les coupes colorées de la chaleur et la lumière autant que possible.

<ol><li>Howard, G., Howard, V. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+G+%22Distribution+of+stroke%3A+hetrogeneity+of+stroke+by+age%2C+and+sex%22">Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex</a>. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).</li>
<li>Thom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2006+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 113, e85-e151 (2006).</li>
<li>Mohr, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohr%2C+JP+%22Middle+cerebral+artery+disease%22">Middle cerebral artery disease</a>. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).</li>
<li>Longa, E. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20, 84-91 (1989).</li>
<li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+protein+kinase+Cdelta+as+a+mediator+of+stroke-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury.</a> J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).</li>
<li>Hudgins, W. R., Garcia, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+electrocautery%2C+atmospheric+exposure%2C+and+surgical+retraction+on+the+permeability+of+the+blood-brain-barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier.</a> Stroke. 1, 375-380 (1970).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx. 2, 396-409 (2005).</li>
<li>Durukan, A., Tatlisumak, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ischemic+stroke%3A+overview+of+major+experimental+rodent+models%2C+pathophysiology%2C+and+therapy+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Biochem.+Behav%22%5BJournal%5D)">Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).</li>
<li>Taniguchi, H., Andreasson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypoxic-ischemic+encephalopathy+model+of+perinatal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons pas tous les intérêts potentiels conflictuels de divulguer.

MCAO chez la souris est couramment utilisé pour le modèle d&#39;ischémie cérébrale focale chez les humains. Utilisez la souris pour des études de course est devenue plus fréquente en raison de la disponibilité de souches transgéniques et knock-out. Il ya quelques détails essentiels à noter dans le protocole: <ol><li> Il est essentiel de maintenir la température corporelle de souris pendant la chirurgie et avant qu&#39;il récupère pleinement de l&#39;anesthésie. La température corporelle a des effets sur l&#39;étendue de l&#39;infarctus; diminue l&#39;hypothermie et d&#39;hyperthermie augmente la taille de l&#39;infarctus. </li><li> Alors que d&#39;exposer et d&#39;isoler le CCA et la CEA, d&#39;éviter d&#39;endommager le nerf pneumogastrique proximité et de la trachée, ce qui pourrait augmenter la taille de l&#39;infarctus et la viabilité diminuer. </li><li> Ne jamais insérer le fil de suture monofilament plus de 10 mm passent de la bifurcation. Une suture inséré trop loin peut perforer l&#39;artère cérébrale antérieure et entraîner des hémorragies cérébrales. Une résistance peut se faire sentir lorsque la suture est avancé environ 9-10 mm au-delà du point de bifurcation. Si cela se produit, le chercheur doit cesser d&#39;avancer la suture et de confirmer la distance. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Produit chimique</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>95045-588</td><td></td></tr><tr><td>Système d'anesthésie V-10</td><td>Équipement</td><td>VetEquip</td><td>901807</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de température TR-200</td><td>Équipement</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060</td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse électrique</td><td>Équipement</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>CLP-9931</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Équipement</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Système de rétracteur</td><td>Équipement</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>ACD-014</td><td></td></tr><tr><td>Coagulateur bipolaire</td><td>Équipement</td><td>Howard Instrument</td><td>64000</td><td></td></tr><tr><td>Fil de suture en soie</td><td>Matériau</td><td>Harvard Apparatus</td><td>510479</td><td></td></tr><tr><td>Fil de suture monofilament</td><td>Matériau</td><td>Harvard Apparatus</td><td>723351</td><td></td></tr><tr><td>Pinces vasculaires</td><td>Équipement</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de Vannas</td><td>Équipement</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Matrice cérébrale</td><td>Équipement</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>BS-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium</td><td>Produit chimique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Formol tamponné neutre à 10 %</td><td>Produit chimique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td></td></tr></tbody></table>

modèle murin d&#39;occlusion artère cérébrale moyenne

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

L&#39;AVC est la plus commune des maladies neurologiques mortelles aux Etats-Unis 1. La majorité des accidents vasculaires cérébraux (88%) résulte d&#39;un blocage des vaisseaux sanguins dans le cerveau (AVC ischémique) 2. Comme la plupart des accidents vasculaires cérébraux ischémiques (~ 80%) se produisent sur ​​le territoire de l&#39;artère cérébrale moyenne (MCA) 3, de nombreux modèles animaux AVC qui ont été développés ont porté sur cette artère. Le modèle monofilament intraluminale de l&#39;artère cérébrale moyenne d&#39;occlusion (MCAO) consiste en l&#39;insertion d&#39;un filament chirurgicale dans l&#39;artère carotide externe et le filetage vers l&#39;avant dans l&#39;artère carotide interne (ACI) jusqu&#39;à la pointe occulte l&#39;origine de la MCA, ce qui entraîne une cessation du flux sanguin et l&#39;infarctus cérébral ultérieur dans les quatre territoires du MCA. La technique peut être utilisée pour modéliser l&#39;occlusion permanente ou transitoire 5. Si la suture est enlevée après un certain intervalle (30 min, 1 h ou 2 h), la reperfusion est obtenue (transitoire MCAO); si le filament est laissé en place (24 h) la procédure est approprié comme un modèle de permanente MCAO . Cette technique ne nécessite pas craniectomie, une intervention neurochirurgicale pour enlever une partie du crâne, qui peuvent affecter la pression intracrânienne et de la température 6. Elle est devenue la méthode la plus fréquemment utilisée pour imiter permanents et transitoires ischémie focale cérébrale chez les rats et les souris 7,8. Afin d&#39;évaluer l&#39;étendue de l&#39;infarctus cérébral, nous coloration des tranches de cerveau avec le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) pour identifier le tissu cérébral ischémique 9. Dans cette vidéo, nous démontrons la méthode MCAO et la détermination de la taille de l&#39;infarctus par coloration TTC.

Nous démontrons dans la vidéo un procédé pour produire une occlusion de l&#39;artère cérébrale moyenne chez des souris adultes en utilisant un monofilament intraluminale. Nous montrons aussi comment évaluer l&#39;étendue de l&#39;infarctus cérébral par le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) coloration.

Modèle murin d&#39;occlusion artère cérébrale moyenne

L'accident vasculaire cérébral (AVC) est la maladie neurologique mortelle la plus fréquente aux États-Unis 1. La majorité des AVC (88 %) résultent de l'obstruction de vaisseaux sanguins dans le ...

Bonjour, je m'appelle Terrence Jam. Je m'appelle Hai Joe. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment réaliser un modèle murin d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne.Commençons. Cette expérience débute par la préparation du fil de suture. Commencez par couper le fil en morceaux de 20 millimètres.Ensuite, arrondissez l'extrémité en dirigeant le point vers un cautère. Après cela, mesurez l'extrémité du point de suture. Nous sommes maintenant prêts à commencer la chirurgie avec le masque placé sur le dos.Pratiquer une incision le long de la ligne médiane. Utiliser une pince pour exposer l'artère carotide externe. L'artère carotide externe présente de nombreuses branches le long de l'artère carotide externe.Une de ces branches est l'artère thyroïdienne supérieure (ATS). L'ATS doit être coagulée à l'aide d'une pince bipolaire. Ensuite, l'ATS doit être sectionnée afin de permettre une meilleure isolation de l'artère carotide externe (ACE).Ensuite, l'artère carotide externe est coagulée et réduite au maximum, aussi éloignée que possible de l'artère carotide commune. À ce stade, vous pouvez isoler l'artère carotide externe pour un meilleur accès. Puis, placez deux ligatures autour de l'artère carotide externe, espacées de quelques millimètres.Appliquer le clamp au niveau du branchement de l'ACI vers l'ACE et l'ACI. Ensuite, pincer l'extrémité du moignon d'ACE. Puis, repositionner l'ACE afin de l'aligner avec l'ACI.Cela permet au fil de suture d'entrer de façon continue de l'artère carotide externe (ECA) vers l'artère carotide interne (ICA). Mesurer la longueur totale du fil de suture avant l'insertion. Insérer le fil de suture dans l'ouverture créée en sectionnant le moignon d'artère carotide externe (ECA).Lorsque le fil passe le nœud distal, fixez le nœud en le serrant. Ensuite, retirez la pince et insérez davantage le fil dans l'artère carotide externe. Lorsque le fil passe le nœud proximal, fixez le nœud en le serrant.Après avoir fermé les deux nœuds, insérez soigneusement le fil de suture le long de l'artère jusqu'à ce que neuf à dix millimètres de suture soient passés. Le point de bifurcation, cela peut être déterminé en soustrayant la longueur du fil de suture jusqu'au point de bifurcation de la longueur totale du fil de suture. Lorsque le fil de suture atteint l'origine de l'artère cérébrale moyenne.L'artère cérébrale moyenne est obstruée. Après 24 heures, les animaux sont sacrifiés et le cerveau est isolé. Pour la coloration au TTC, le cerveau isolé est placé dans un moule et sectionné à l'aide d'une lame de rasoir.Ensuite, le cerveau est placé dans du TTC à 2 % pendant 20 minutes à température ambiante. Enfin, le cerveau est fixé, de manière neutre, pendant une nuit. Formol tamponné.La préparation du fil de suture est un processus délicat. Voici quelques conseils utiles. Positionnez le fil de suture et le cautère comme suit.Ensuite, tout en maintenant le cautérisateur immobile, rapprochez lentement la suture. Mesurez ensuite la suture pour vous assurer qu'elle a la bonne taille. La taille de la suture utilisée dans cette expérience est d'environ 0,21 à 0,22 millimètres.Pour commencer la chirurgie, placez le masque en position dorsale et induisez l'anesthésie avec 30 % d'oxygène et 70 % d'azote. Pratiquez une incision le long de la ligne médiane, puis appliquez des rétracteurs pour accéder à la zone. Cela doit ressembler à ceci.Séparez le tissu délicatement à l’aide de la pince. Ensuite, exposez et isolez l’ACÉ ; lors de l’isolement de l’ACÉ, il est nécessaire de coaguler et de couper l’AST afin de permettre l’isolement d’un segment d’ACÉ plus long.Ensuite, l'artère carotide externe (ECA) doit être coagulée à l’aide de forceps bipolaires. Après la coagulation, l’ECA doit être sectionnée. Ensuite, isolez l’ECA et placez deux fils de suture lâchement autour de celle-ci, à quelques millimètres d’intervalle. Le résultat doit ressembler à ceci.Appliquez maintenant le clamp à la bifurcation de l'artère carotide commune en artère carotide interne et artère carotide externe. Veillez à ce que le clamp obstrue complètement le flux sanguin vers l'artère carotide externe. Ensuite, clippez l'extrémité du moignon d'artère carotide externe.Mesurez le point de suture avant l'insertion, après avoir pratiqué une ouverture sur l'artère carotide externe. Insérez le point de suture et faites-le passer au-delà du nœud distal. Une fois le point de suture passé le nœud distal, serrez le nœud.Ensuite, retirez le clamp. Après avoir vérifié que le nœud distal est bien serré, insérez le point de suture plus en avant le long de l'artère carotide externe, au-delà du nœud proximal. Ensuite, serrez le nœud proximal.Insérez maintenant soigneusement le fil de suture le long de l'artère carotide externe (ECA) dans l'artère carotide interne (ICA). Poursuivez l'insertion du fil de suture le long de l'ICA jusqu'à ce que neuf à dix millimètres du fil dépassent le point de bifurcation. Cela peut être réalisé en soustrayant la longueur du fil jusqu'au point de bifurcation de la longueur totale du fil de suture.Ensuite, coupez le point de suture de manière à ne pas endommager les tissus environnants. Puis refermez l'incision et laissez la Souris se remettre. Préparez la coloration au TTC 24 heures après l'intervention chirurgicale.Commencez par sacrifier la souris par dislocation cervicale. Ensuite, isolez le cerveau du crâne et placez-le dans un moule. Puis découpez à l’aide d’une lame de rasoir et coloriez le cerveau dans du TTC à 2 % pendant 20 minutes à température ambiante.Ensuite, fixer toute la nuit dans du formol tamponné neutre à 10 % pour la méline. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Course de modélisation chez la souris - Moyen-occlusion artérielle cérébrale avec le modèle filamentaire

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Modèle murin d&#39;MCAO intraluminale: Évaluation infarctus cérébral par coloration au violet de crésyl

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