Name: Cryoconservation dembryons pré-implantatoire de bovins, ovins et caprins (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Découvrez la cryoconservation d'embryons pré-implantatoires de bovins, ovins et caprins. Cette méthode utilise la déshydratation cellulaire et l'azote liquide à -196°C pour préserver la viabilité des embryons de qualité.

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Un financement partiel du projet de l&#39;USDA de recherche multi-état W-2171 &quot;de cellules germinales et le développement de l&#39;embryon et de manipulation pour l&#39;amélioration de l&#39;élevage&quot; est grandement appréciée. Les talents artistiques de Ryan Callahan, qui a préparé les illustrations techniques pour la partie vidéo de cet article, sont également appréciés.

1. Évaluer Aptitude cryoconservation d&#39;embryons pour une <ol><li> Les spécimens récoltés dans le tractus reproducteur des femelles de chaque donateur doit être placé dans un milieu isotonique embryon tenant pendant 10 minutes avant l&#39;évaluation à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope. Soyez certain de garder embryons de chaque femelle donneuse séparés les uns des autres pour permettre l&#39;identification de filiation des descendants de transfert d&#39;embryons. </li><li> En utilisant un faible grossissement (10X ≤), des spécimens d&#39;une femelle de chaque donateur doivent être séparés en groupes distincts comprenant des ovules non fécondés, les embryons dégénérés, ou des embryons de qualité transférables. Niveau de qualité que de 1 ou 2 embryons au stade morula compacte par des stades de développement élargi blastocyste sont adaptés à la cryoconservation, et tous les autres doivent être écartées (à moins que des femelles receveuses synchrones sont disponibles pour la qualité de grade 3 embryons et un taux de grossesse après transfert d&#39;environ 25 -30% est jugé acceptable). </li><li> Inspectez une classe de qualité et 2 morula compact grâce élargi embryons stade blastocyste à un grossissement 50X ≥ afin de s&#39;assurer que la zone pellucide de l&#39;embryon est intact et qu&#39;il n&#39;ya pas de matériel (par exemple, les cellules, le mucus) adhérant à la zone pellucide. Tout embryon par un fissurée ou manquante zone pellucide ou avec une zone pellucide ayant matières adhérentes doivent être séparés des autres embryons et, soit être éliminés ou traités séparément. </li></ol> 2. Les embryons de lavage pour réduire la probabilité de 2 transmission des maladies <ol><li> Déplacer zone pellucide intacte embryons dans un volume minimal de milieu isotonique embryon exploitation dans le premier puits de milieu de l&#39;embryon à laver (par exemple, tampon phosphate salin augmentée avec des antibiotiques et l&#39;albumine sérique bovine, sérum de veau nouveau-né, ou de l&#39;alcool de polyvinyle). Gardez embryons de chaque femelle donneuse séparés, et ne pas essayer de laver plus de 10 embryons à la fois. Déplacer des embryons dans un volume minimal de milieu dans chaque lavage successifs pour parvenir à une dilution en série ≥ 1:100, et être certain d&#39;utiliser stériles conseils de manipulation d&#39;embryons qui sont changés entre chaque lavage successifs. </li><li> Déplacer embryons à 4 lavages comme décrit en 2.1. </li><li> Si la transmission de maladies virales est préoccupante, se laver deux fois embryons dans une solution de trypsine à 0,25%, pour un temps d&#39;exposition totale combinée à la trypsine de pas plus de 90 secondes. </li><li> Après les deux lavages trypsine, se laver les embryons 5 fois plus dans le milieu de l&#39;embryon à laver comme décrit en 2.1. </li><li> Après le lavage embryon final, placez-le dans l&#39;embryon embryons isotonique tenant moyenne. </li></ol> 3. La déshydratation des embryons Avant de Cryoconservation 3 <ol><li> Les embryons devraient être transférés dans un volume minimal de milieu d&#39;embryon tenant isotonique dans une solution hypertonique (01/04 à 01/05 concentration molaire) d&#39;un agent cryoprotecteur (CPA), tels que l&#39;éthylène glycol ou de glycérol. </li><li> Autoriser les embryons de s&#39;asseoir dans un milieu de congélation (hypertonique solution CPA) jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent l&#39;équilibre osmotique. Parce que l&#39;éthylène glycol imprègne les cellules embryonnaires plus rapidement que ne le glycérol, les temps d&#39;équilibration sont généralement moins d&#39;embryons dans l&#39;éthylène glycol (5 min) que dans le glycérol (10 min). Une partie de cette période d&#39;équilibration peut être réalisé pendant et après les embryons sont chargés dans des pailles (décrit à l&#39;étape suivante). </li></ol> 4. Chargement des embryons dans une paille en plastique de 0,25 ml pour la cryopréservation <ol><li> Fixez l&#39;extrémité du tampon de coton avec une paille en plastique de 0,25 ml (11,5 cm de longueur de travail) à un dispositif de chargement d&#39;embryon, et aspirer environ 1,3 cm du CPA solution hypertonique dans une paille correctement étiquetés. Une variété de procédures d&#39;étiquetage existe, y compris l&#39;utilisation d&#39;étiquettes imprimées soit attachée à un bouchon d&#39;étanchéité de la paille ou à un autre de paille connecté avec un adaptateur de paille. </li><li> Retirez la paille de la solution de l&#39;APC, et aspirer environ 0,15 cm d&#39;air pour créer une bulle d&#39;air minuscules dans la paille. </li><li> Aspirer un seul embryon à environ 0,8 cm du CPA solution hypertonique dans la paille. </li><li> Retirez la paille de la solution de l&#39;APC et aspirer environ 0,15 cm d&#39;air pour créer une bulle d&#39;air minuscules secondes au sein de la paille (bulles d&#39;air servent à isoler physiquement l&#39;embryon au sein de la paille). </li><li> Aspirer environ 9,1 cm d&#39;une solution de CPA pour remplir complètement la paille, être certain de tirer dans un volume suffisant de solution CPA pour humidifier le polychlorure de vinyle (PVC) de poudre qui existe au sein de la fin bouchon de coton de la paille. La solution CPA entraîne la poudre de PVC au gel et sceller cette extrémité de la paille. </li><li> Sceau l&#39;autre bout de la paille avec de la poudre de PVC, plastique bouchons de paille, ou une thermoscelleuse. </li></ol> 5. Placer embryons dans une machine de congélation d&#39;embryon Taux contrôlée <ol><li> Soit bain de méthanol liquide ou de gel des machines d&#39;azote vapeur peut être programmé pour la cryoconservation des embryons pré-implantatoire. </li><li> Chargez les pailles contenant les Embry<html> OS dans une machine de congélation dont la température a été refroidi de la température ambiante à -6 ° C. Pailles Charge fin bouchon de coton vers le haut (à moins de plastique bouchons de paille ou de paille adaptateurs sont utilisés, dans lequel extrémité de la bougie cas du coton est placée vers le bas). </li><li> Autoriser embryons pour siéger à cette température pendant au moins 2 minutes avant de procéder. </li></ol> 6. Semis <ol><li> Une fois que les embryons ont refroidi à -6 ° C, utiliser une paire de pinces en surfusion dans l&#39;azote liquide (ou un bâton de coton-tige plongé dans l&#39;azote liquide) pour induire la formation de cristaux de glace dans la solution de l&#39;ACP à l&#39;intérieur de la paille en touchant les pinces (ou de coton bâton de pointe) à la colonne de la solution soit au-dessus ou en dessous de l&#39;embryon. </li><li> L&#39;eau dans la solution de l&#39;ACP va se cristalliser dans la région exposée à l&#39;azote liquide, et des cristaux de glace se propage à la colonne de solution CPA entourant immédiatement l&#39;embryon. </li><li> Tenez embryons au moment du semis température pendant 10 minutes avant de refroidir davantage. </li></ol> 7. La déshydratation continue d&#39;embryons <ol><li> Refroidir les embryons à un taux de 0,5 ° C / min jusqu&#39;à une température de -34 ° C. Ce taux de refroidissement est important d&#39;assurer la déshydratation continue de l&#39;embryon. </li><li> Tenez embryons à -34 ° C pendant 10 minutes avant de plonger dans les embryons azote liquide (-196 ° C). </li><li> Placez cryoconservés embryons dans un gobelet convenablement étiquetés (rempli d&#39;azote liquide) attaché à une canne à correctement étiquetés, et le lieu de la canne dans un bidon d&#39;azote liquide une Dewar pour le stockage à court ou à long terme. </li></ol> 8. La décongélation des embryons cryoconservés <ol><li> Tirez la cartouche dans le col de l&#39;azote liquide Dewar, veillant à ce que la cartouche reste en dessous de la ligne de gel dans le Dewar. </li><li> Localisez la canne contenant l&#39;embryon d&#39;être décongelé, et rapidement et soigneusement enlever la paille de la coupe, étant certain de ne pas réchauffer les autres pailles dans le gobelet. </li><li> Tenez la paille dans l&#39;air pendant 3-5 secondes (pour réduire l&#39;incidence d&#39;une zone pellucide craqué 4), puis plonger dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pour un 25-30 secondes supplémentaires. </li><li> Retirer la paille du bain d&#39;eau, essuyez-la paille (en faisant attention de ne pas maculer l&#39;identification des embryons sur la paille), utiliser un appareil de la paille de coupe pour couper le bouchon d&#39;extrémité non-coton de la paille (s&#39;ils sont scellés ou de chaleur à l&#39;aide de PVC en poudre ), ou bien enlever le bouchon d&#39;étanchéité en plastique, et soit: <ol type="a"><li> charger la paille dans un dispositif de transfert d&#39;embryons et le transfert le plus rapidement possible à un destinataire embryon synchrones (mais seulement si l&#39;embryon a été cryoconservés en utilisant l&#39;éthylène glycol comme l&#39;ACP), ou </li><li> tenir l&#39;extrémité ouverte de la paille sur un plat contenant une concentration de 1,0 molaire de saccharose (un composé non-imprégnant), et utiliser une paire de ciseaux pour couper la fin bouchon de coton de la paille. Contenu de la paille doit circuler librement dans la solution de saccharose, mais poussant une petite colonne d&#39;air à travers la paille peut être nécessaire si tout support résiduelle existe dans la paille. Autoriser les embryons de rester dans une solution de sucrose pendant 10 minutes, puis le transfert d&#39;embryons dans l&#39;embryon isotonique tenant moyen pendant 10 minutes. Évaluer embryons après décongélation, charger dans une paille nouvelle, et le transfert aux femelles receveur approprié. </li></ol></li></ol> 9. Les résultats représentatifs: Une variété de facteurs peuvent influer sur la grossesse et de vivre des taux de natalité résultant du transfert d&#39;embryons décongelés préimplantatoire aux femelles receveuses synchrones 5. Les embryons à des stades de développement moins avancée que morula compact ou plus avancé que blastocyste élargi souvent ne survivent pas au processus de cryoconservation des embryons ainsi que la morula compact, blastocyste précoce blastocyste, et élargi les stades du développement embryonnaire du blastocyste. Les embryons de grade 1 et 2 de la qualité de rendement plus élevé des taux de grossesse après décongélation que ne le font la qualité de grade 3 embryons (qui ne sont généralement pas cryoconservés en raison de la faiblesse des taux de grossesse après décongélation). Embryons malmené pendant la congélation des embryons ou à l&#39;embryon le dégel des procédures sont susceptibles de présenter des taux de grossesse réduit. Les embryons transférés à des femelles receveuses dont les œstral cycles ne sont pas synchronisé avec celui de la femelle donneuse produisent généralement des taux de grossesse plus faible. Les embryons produits in vitro ou manipulé d&#39;une certaine manière (par exemple, biopsie ou de traversée) donnent habituellement des taux de grossesse plus faible. Dans des conditions optimales, les taux de grossesses obtenues après transfert de décongelés embryons obtenus in vivo est généralement de 60-70% chez les bovins 6,7, 65-75% chez les ovins 8,9,10,11, et 60-70% chez les chèvres 12,13,14,15. De même, les taux de grossesses obtenues après transfert de décongelés dans des embryons produits in vitro est généralement de 40-50% chez les bovins 6,16, 25-35% chez les ovins 17, et 30-40% chez les chèvres 18. bles 1 &quot;/&gt; Tableau 1. Les taux de grossesse attendue après le transfert d&#39;embryons décongelés à partir des espèces domestiques ruminants aux femelles receveuses synchrones.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Parce que les embryons sont constitués principalement de l&#39;eau, il est crucial que les embryons pré-implantatoire être adéquatement déshydratée et lentement refroidie en conformité avec le protocole décrit aux présentes afin d&#39;éviter la formation de cristaux de glace intracellulaire. Une fois le processus de refroidissement a commencé, il est important de maintenir un changement de température unidirectionnel et d&#39;éviter les fluctuations de température. Lancement de la formation de cristaux de glace («ensemencement») à une température appropriée pour la solution spécifique CPA est critique. Toute modification de ce refroidissement lent / rapide méthode de décongélation pour la cryoconservation d&#39;embryons pré-implantatoire comprennent la méthode en une étape (où la dernière colonne du milieu chargé dans la paille est le saccharose, au lieu d&#39;une solution de CPA) 19 et la méthode de transfert direct (où des embryons congelés dans l&#39;éthylène glycol sont décongelés et transférés directement à l&#39;utérus d&#39;une femelle receveuse sans d&#39;abord enlever l&#39;éthylène glycol à partir de l&#39;embryon) 20. Pour réduire le volume de l&#39;éthylène glycol déposés dans l&#39;utérus d&#39;un transfert direct (DT) femelle receveuse, il est recommandé de remplir la paille 0,25 ml avec 6 cm tenant moyenne avant de continuer comme décrit précédemment. Il convient de noter que d&#39;une norme volontaire existe au sein de l&#39;industrie du transfert de l&#39;embryon préimplantatoire commerciales que les embryons cryoconservés pour DT devrait être congelés dans de couleur jaune paille et stockés dans des gobelets de couleur jaune dans l&#39;azote liquide Dewar. L&#39;industrie commerciale a aussi des exigences spécifiques d&#39;étiquetage pour tous les embryons cryoconservés qui devraient être suivies. Une alternative à cette méthode est la vitrification 21, une méthode non-équilibre de la cryoconservation, où une plus forte concentration (6-8 M) solution de l&#39;APC est refroidi ultra-rapide provoquant la solution CPA de changer de liquide à une &quot;glassy&quot; état ​​sans glace cristal de la formation. La vitrification est probablement mieux adapté pour la cryoconservation des embryons qui sont moins avancés que développemental morula compacte en raison de leur sensibilité à la température augmente. Cette technique a des applications pour la conservation des ressources génétiques uniques 22, ainsi que pour l&#39;industrie internationale des embryons commerciaux de transfert où plus de 55% d&#39;environ 500.000 embryons bovins préimplantatoire transféré dans l&#39;année civile 2008 ont été cryopréservés. 23

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Le numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Moyennes gel BioLife </td><td> Agtech, Inc </td><td> C18, C18A </td><td> 1,5 M d&#39;éthylène glycol </td></tr><tr><td> Emcare d&#39;éthylène glycol solution de gel de </td><td> ICPBio reproduction </td><td> IC8, IC10 </td><td> 1,5 M d&#39;éthylène glycol </td></tr><tr><td> Gel des Vigro éthylène glycol ainsi </td><td> Bioniche Animal Health </td><td> EVM835 </td><td> 1,5 M d&#39;éthylène glycol </td></tr><tr><td> Emcare solution à 10% de glycérol gel </td><td> ICPBio reproduction </td><td> IC12 </td><td> 1,34 M de glycérol </td></tr><tr><td> Emcare une dégel M de saccharose </td><td> ICPBio reproduction </td><td> IC16 </td><td> 1,0 M de saccharose </td></tr><tr><td> Vigro une étape de dégel </td><td> Bioniche Animal Health </td><td> EVM247, EVM847 </td><td> 1,0 M de saccharose </td></tr><tr><td> Vigro dégel 1-2-3, plus </td><td> Bioniche Animal Health </td><td> EVM248, EVM848 </td><td> 5%, 2,5%, 0% de glycérine avec 0,5, 0,5, 0,6% de saccharose </td></tr><tr><td> Emcare CSU dégel kit </td><td> ICPBio reproduction </td><td> IC20 </td><td> 6%, 3%, 0% de glycérine avec du saccharose de 10,3% </td></tr><tr><td> BioLife holding et moyen de transfert </td><td> Agtech, Inc </td><td> C15, C15A </td><td> modifiés PBS avec 0,4% de BSA (sérum albumine bovine) </td></tr><tr><td> Emcare tenant solution </td><td> ICPBio reproduction </td><td> IC2, IC4, IC6 </td><td> 0,4% de BSA (sérum albumine bovine), tampon MOPS (zwitterions inerte) </td></tr><tr><td> Vigro détenant plus de </td><td> Bioniche Animal Health </td><td> EVM024, EVM824 </td><td></td></tr><tr><td> Tenir SYNGRO moyennes </td><td> Bioniche Animal Health </td><td> ESM024, ESM224, ESM828 </td><td> contient hyaluronane; aucun produit d&#39;origine animale </td></tr><tr><td> BioLife modifiés D-PBS </td><td> Agtech, Inc </td><td> C06 </td><td> phosphate de Dulbecco modifié saline tamponnée </td></tr><tr><td> BioLife Fraction V BSA </td><td> Agtech, Inc </td><td> B09 </td><td> lyophilisée de sérum albumine bovine fraction V </td></tr><tr><td> BioLife antibiotiques antimycosiques </td><td> Agtech, Inc </td><td> B01 </td><td> amphotéricine B, la pénicilline G, du sulfate de streptomycine </td></tr><tr><td> BioLife trypsine kit </td><td> Agtech, Inc </td><td> C22A </td><td> 25 g de trypsine lyophilisée, de l&#39;eau stérile, stérile D-PBS </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Nom de l&#39;équipement </th><th> Société </th><th> Le numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Biol-Cool congélateur vitesse contrôlée </td><td> Systèmes FTS </td><td> BC-IV -40 </td><td> Congélateur bain de méthanol </td></tr><tr><td> Gel congélateur taux de contrôle contrôlé </td><td> Cryologic </td><td> CL2200 </td><td> Congélateur à azote liquide </td></tr></tbody></table>

cryoconservation d&#39;embryons pré-implantatoire de bovins, ovins et caprins

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Embryons pré-implantatoire des bovins, ovins et caprins peuvent être cryoconservés pour le stockage à court ou à long terme. Embryons pré-implantatoire sont constitués principalement de l&#39;eau, et l&#39;évitement de la formation de cristaux de glace intracellulaire pendant le processus de cryoconservation est d&#39;une importance primordiale pour maintenir la viabilité des embryons. Les embryons sont placés dans une solution hypertonique (1,4 - 1,5 m) d&#39;un agent cryoprotecteur (CPA), tels que l&#39;éthylène glycol (EG) ou glycérol (glyc) pour créer un gradient osmotique qui facilite la déshydratation cellulaire. Après embryons atteindre l&#39;équilibre osmotique dans la solution de l&#39;ACP, ils sont individuellement chargés dans la solution hypertonique CPA dans 0,25 ml pailles en plastique pour la congélation. Les embryons sont placés dans un congélateur à vitesse contrôlée à une température de -6 ° C. La formation de cristaux de glace est induite dans la solution CPA entourant l&#39;embryon, et la cristallisation entraîne une augmentation de la concentration de l&#39;APC en dehors de l&#39;embryon, entraînant une déshydratation encore cellulaire. Les embryons sont refroidis à un taux de 0,5 ° C / min, ce qui permet encore la déshydratation, à une température de -34 ° C avant d&#39;être plongés dans l&#39;azote liquide (-196 ° C). Les embryons cryoconservés doivent être décongelés avant le transfert à un destinataire (substitut) des femmes. Pailles contenant les embryons sont retirés de l&#39;azote liquide Dewar, tenue à la température ambiante de l&#39;air pendant 3 à 5 secondes, et placé dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 25 à 30 sec. Les embryons cryoconservés dans Glyc sont placés dans une solution 1 M de saccharose de 10 min pour le retrait du CPA avant le transfert à un destinataire (substitut) des femmes. Les embryons cryoconservés dans EG, cependant, peuvent être directement transférés dans l&#39;utérus d&#39;un destinataire.

Embryons peuvent être cryoconservés préimplantatoire après le placement dans une solution hypertonique cryoprotecteurs pour provoquer une déshydratation cellulaire. Après équilibration, la formation de cristaux de glace est induite dans la solution environnante de l&#39;embryon. Déshydratation survient plus que l&#39;embryon est refroidi lentement à des températures inférieures à zéro avant de plonger dans l&#39;azote liquide pour le stockage.

Cryoconservation d&#39;embryons pré-implantatoire de bovins, ovins et caprins

Les embryons préimplantatoires de bovins, de ovins et de caprins peuvent être cryoconservés pour un stockage à court ou à long terme. Les embryons préimplantatoires sont principalement constitués de...

L'objectif général de cette procédure est de cryoconserver avec succès des embryons pré-implantatoires provenant de bovins, de moutons et de chèvres. Cela est réalisé en examinant d'abord les échantillons prélevés chez la femelle donneuse afin d'identifier ceux qui conviennent à la cryoconservation. Qualité. Les embryons de grade un et deux sont adaptés à la cryoconservation.Cependant, les embryons d'ovules non fécondés, les embryons de qualité médiocre et les embryons de troisième catégorie ne conviennent pas à la congélation, tout comme les embryons moins développés qu'un module compact ou ceux qui ont commencé ou achevé le processus d'éclosion. Ces derniers ne conviennent pas non plus à la congélation. La deuxième étape de la procédure consiste à déshydrater fortement l'embryon en le plaçant dans une solution hypertonique d'un agent cryoprotecteur, tel que l'éthylène glycol.L'embryon illustré ici est placé dans un milieu de maintien isotonique, où les points bleus représentent les molécules d'eau au début du processus de déshydratation. L'embryon est ensuite mis en contact avec une solution hypertonique d'éthylène glycol, une molécule représentée par des points rouges. Lorsque l'embryon reste dans la solution d'éthylène glycol, plusieurs modifications interviennent au niveau de l'embryon.L'eau s'écoule rapidement hors des cellules de l'embryon, provoquant une diminution de la taille de celui-ci. Parallèlement, l'éthylène glycol pénètre dans les cellules de l'embryon, entraînant une augmentation de sa taille jusqu'à ce qu'il atteigne finalement l'équilibre osmotique. La troisième étape de la procédure consiste à induire la formation de cristaux de glace dans la solution entourant l'embryon.Une procédure appelée « seeding » permet une déshydratation supplémentaire de l'embryon lorsqu'il est lentement refroidi en touchant les parois de la paille contenant l'embryon. À l'aide d'une pince métallique préalablement refroidie et de cristaux de glace d'azote liquide, des cristaux de glace commenceront à se former dans la solution entourant l'embryon. Les cristaux de glace continuent ensuite de se propager dans la solution jusqu'à ce que la cristallisation soit complète.La dernière étape de la procédure de congélation consiste à plonger l'embryon dans de l'azote liquide pour un stockage à court ou à long terme à moins 196 degrés Celsius. En fin de compte, les résultats obtenus peuvent indiquer qu'une déshydratation adéquate de l'embryon avant et pendant la procédure de cryoconservation peut conduire à la production d'une descendance viable après le transfert d'embryons correctement T pensés dans une femelle réceptrice synchronisée. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison des problèmes rencontrés pour distinguer quels spécimens sont adaptés à la cryoconservation.Pour charger correctement les embryons dans les pailles de 0,25 ml destinées au congélation, ainsi que pour éviter les erreurs involontaires lors de la manipulation des embryons pendant les procédures de congélation et de décongélation, les échantillons prélevés du tractus reproducteur doivent être soigneusement gérés. Chaque femelle donneuse doit d'abord être évaluée au microscope stéréoscopique afin de déterminer son aptitude à la cryoconservation. Placer les embryons dans un milieu isotonique de maintien des embryons pendant 10 minutes avant l'évaluation.Veillez à maintenir séparés les embryons provenant de chaque femelle donneuse afin de permettre l'identification de la parenté des descendants issus du transfert embryonnaire ; à l’aide d’un grossissement faible, séparez les spécimens provenant d’une même femelle donneuse en groupes distincts comprenant les ovocytes non fécondés destinés à la production d’embryons ou les embryons de qualité transférable. La qualité des embryons est évaluée selon de nombreux facteurs décrits précédemment par Lindner et Wright, afin de déterminer s’ils sont ou non de qualité transférable. Seuls les embryons aux stades de blastocyste compact à blastocyste expansé, de grade de qualité un ou deux, conviennent à la cryoconservation.Les embryons de grade trois, bien qu'inappropriés pour la cryoconservation, peuvent être transférés à une femelle receveuse et produire un taux de gestation aussi élevé que 25 à 30 %. Tous les embryons dégénérés et les ovules non fécondés doivent être éliminés ; les embryons moins avancés dans leur développement qu'un stade compacté doivent être cultivés ou éliminés. Examiner les embryons de grade un et deux à un grossissement supérieur ou égal à 50 x afin de s'assurer que la zone pellucide de l'embryon est intacte et qu'aucun matériau n'adhère à la zone pellucide.Tout embryon présentant une zoma palita fissurée ou manquante, ou une zoma palita avec un matériau adhérent, doit être séparé des autres embryons et traité individuellement. Après avoir évalué la présence d'une zop lucita intacte chez les embryons sélectionnés, on les lave afin de réduire le risque de transmission de maladies. Conserver séparément les embryons de chaque donneuse femelle, et ne pas tenter de laver plus de 10 embryons à la fois.Pour laver les embryons, transférez-les dans cinq microlitres de milieu de maintien isotone pour embryons dans 500 microlitres de milieu de lavage pour embryons. Dans le premier puits d'une plaque à six puits, faites tourbillonner les embryons dans le puits afin de diluer tout agent pathogène éventuel qui pourrait être présent.Changer la pointe stérile pour la manipulation des embryons avant de transférer les embryons dans un nouveau puits pour l'étape de lavage suivante. Ensuite, transférer les embryons dans le deuxième puits, en assurant une dilution de un à 100 avec du milieu de lavage frais pour embryons, comme lors du premier lavage.Faire tourbillonner les embryons dans la cavité. Passer les embryons par un total de cinq lavages en utilisant une dilution d'au moins un à 100 à chaque lavage successif, et en changeant les embouts stériles de manipulation des embryons entre chaque lavage successif. Laver les embryons deux fois dans une solution de tryine à 0,25 % pendant un temps total n'excédant pas 90 secondes, avant la série finale de cinq lavages dans le milieu de lavage des embryons.Lorsque le lavage est terminé, placer les embryons dans un milieu de maintien isotonique avant la cryoconservation. Déshydrater les embryons en les transférant, avec un volume minimal de milieu de maintien isotonique, dans une solution hypertonique d'un agent cryoprotecteur, tel que l'éthylène glycol. Après que les embryons aient subi la déshydratation initiale, ils doivent être chargés dans des pailles de 0,25 ml pour la congélation.Étant donné qu'il s'agit de l'aspect le plus technique de la procédure, il est important que les techniciens s'entraînent à charger les pailles en utilisant uniquement du milieu, sans embryons, jusqu'à ce qu'ils acquièrent une maîtrise suffisante. Avec cette technique, la position de l'embryon à l'intérieur de la paille ainsi que la taille et la position des bulles d'air sont cruciales pour une cryoconservation embryonnaire réussie. Pour commencer à charger un embryon dans une paille en plastique de 0,25 millilitre destinée à la cryoconservation, fixez le bouchon de coton d'une paille correctement étiquetée à un dispositif de chargement embryonnaire, qui, dans cette démonstration, est un cathéter tomcat raccourci fixé à une seringue tout en plastique d'un cc ; aspirez environ 0,05 millilitre de solution CPA hypertonique dans la paille.Retirez la paille de la solution d'agent de protection contre le gel (APG) et aspirez un petit volume d'air pour créer une minuscule bulle d'air à l'intérieur de la paille. Ensuite, aspirez un embryon unique entouré d'environ 0,025 millilitre de solution d'APG hypertonique dans la paille. Retirez la paille de la solution d'APG et aspirez un petit volume d'air pour créer une deuxième minuscule bulle d'air à l'intérieur de la paille.Les deux bulles d'air servent à isoler physiquement l'embryon dans la solution d'APA aspirée dans la paille afin de remplir complètement la paille en toute certitude. Il faut aspirer un volume suffisant de solution d'APA pour humidifier la poudre de chlorure de polyvinyle présente à l'extrémité de la paille, où se trouve le bouchon de coton. La solution d'APA provoquera la gélification de la poudre de PVC et obturera cette extrémité de la paille.Enfin, scellez l'autre extrémité de la paille à l'aide du scelleur thermique. La machine de congélation à vitesse contrôlée utilisée ici pour la cryoconservation d'embryons pré-implantatoires est une machine à congélation par vapeur d'azote liquide dont la température a été abaissée de la température ambiante à moins six degrés Celsius. Pour commencer cette procédure, insérez les pailles contenant les embryons, le bouchon de coton vers le haut, dans la machine de congélation.Laisser les embryons reposer à cette température pendant au moins deux minutes avant de procéder à l'ensemencement. Une fois que les embryons ont atteint une température de moins six degrés Celsius, utiliser une pince préalablement refroidie à l'azote liquide pour induire la formation de cristaux de glace dans la solution CPA à l'intérieur de la paille, en touchant la colonne de solution située soit au-dessus, soit au-dessous de l'embryon. Étant donné que les embryons ne doivent pas rester à l'extérieur de la machine de congélation plus longtemps que nécessaire, nous utiliserons, à des fins de démonstration dans cette vidéo, une paille sans embryon afin d'illustrer ce qui se produit à l'intérieur de la paille durant l'ensemencement.Lorsque les pinces refroidies touchent la région de la paille contenant la solution de CPA, l'eau présente dans la solution de CPA cristallisera dans la zone exposée aux températures froides provoquées par les pinces refroidies à l'azote liquide, et les cristaux de glace se propageront dans la colonne de solution de CPA entourant immédiatement l'embryon. Après 10 minutes à moins six degrés Celsius, refroidir les embryons à un taux de 0,5 degré Celsius par minute, jusqu'à une température de moins 34 degrés Celsius. Maintenir les embryons à moins 34 degrés Celsius pendant 10 minutes. Enfin, placer les embryons cryopréservés dans un godet correctement étiqueté rempli d'azote liquide, fixé à une canne correctement étiquetée, puis placer la canne dans un récipient d'un diar à azote liquide pour un stockage à court ou à long terme à moins 196 degrés Celsius en vue de la décongélation des embryons cryopréservés.Tout d'abord, insérez le récipient dans le col du D uar d'azote liquide, en veillant à ce que le récipient reste en dessous de la ligne de givrage. Dans le doer, repérez la canne contenant l'embryon à décongeler et retirez rapidement et soigneusement la paille du godet. Veillez à ne pas réchauffer les autres pailles présentes dans le godet.Retenez la paille en l'air pendant trois à cinq secondes afin de réduire l'incidence d'une fissure en forme de Z dans la lucite, puis immergez la paille dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius. Laissez-la encore 25 à 30 secondes supplémentaires, retirez la paille du bain d'eau et essuyez-la soigneusement en prenant garde de ne pas effacer l'identification de l'embryon sur la paille. Utilisez ensuite un appareil de coupe pour sectionner l'extrémité de la paille ne comportant pas le bouchon conique.Bien que les embryons cryopréservés dans l'éthylène glycol puissent être transférés directement dans l'utérus d'une femelle receveuse synchronisée immédiatement après décongélation, les techniciens souhaitant effectuer une évaluation visuelle post-décongélation de l'embryon avant le transfert doivent d'abord éliminer l'éthylène glycol de l'embryon. Pour ce faire, placez l'extrémité ouverte de la paille au-dessus d'une boîte contenant une solution de saccharose à une concentration d'un molaire, puis utilisez une paire de ciseaux pour couper l'extrémité de la paille munie du bouchon de coton. Le contenu de la paille doit s'écouler librement dans la solution de saccharose, mais il peut être nécessaire de faire passer une petite colonne d'air à travers la paille.S'il reste un milieu résiduel à l'intérieur de la paille, laisser les embryons dans la solution de saccharose pendant 10 minutes, puis transférer les embryons dans un milieu isotonique de conservation des embryons pendant 10 minutes. Après 10 minutes dans un milieu isotonique de conservation des embryons, ceux-ci peuvent être évalués au microscope. Ce tableau indique le taux de gestation attendu après transfert d'embryons congelés provenant d'espèces domestiques de ruminants élevés.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cryoconserver des embryons pré-implantatoires provenant de bovins, de moutons et de chèvres. Cette procédure peut constituer un ajout précieux au répertoire de compétences de votre laboratoire et s'avérer très utile pour préserver des lignées génétiques uniques.

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