Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti

L'objectif général de cette procédure est de recueillir et de colorer les hématocytes provenant de moustiques. Cette étape est réalisée en injectant d'abord un petit volume de diluant anticoagulant dans des moustiques refroidis, afin de détacher les hématocytes et de mettre tous les hématocytes en solution.

La deuxième étape de la procédure consiste à retirer les pattes, les ailes et l'extrémité de l'abdomen du moustique. Troisièmement, un diluant frais est injecté dans un site distinct sur le moustique afin d'initier le processus de perfusion. La dernière étape consiste à diriger l'hémolymphe diluée sur une lame préparée afin que les hémocytes collectés puissent être fixés et colorés.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les principaux types et le nombre de sites hémiques présents chez l'espèce de moustique étudiée, grâce à la microscopie optique de base. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la profusion, est qu'elle allie la simplicité de la profusion à la précision obtenue avec les méthodes à injection élevée, mais en nécessitant moins d'étapes pour atteindre l'objectif final. Notre objectif est d'identifier les types d'hémos et de cytes, ainsi que leur abondance, en réponse à des défis immunitaires.

La démonstration de cette technique est assurée par Amina Abdul Kum, une étudiante de premier cycle de mon laboratoire. Avant de commencer le protocole, préparez la solution diluante d'hémolymphe en aliquotes d'un millilitre. Conservez-les à moins 20 degrés Celsius et ne recongelez jamais la partie non utilisée d'une aliquote.

Maintenant, sur des lames de microscope d'un millimètre d'épaisseur, tracer des cercles d'un centimètre de diamètre. Une lame est nécessaire par moustique. Préparer les aiguilles étirées.

Cassez l'extrémité de chaque aiguille étirée afin de créer une ouverture dans l'aiguille. Insérez une aiguille dans son support, qui est fixé aux composants du tube et de la seringue d'un microinjecteur. Ensuite, éliminez les bulles d'air de l'ensemble tube et support d'aiguille à l'aide d'huile minérale.

Vous aspirez de l'huile minérale dans cette seringue manuelle et vous vous assurez de ne pas introduire de bulles. Vous placez un récipient sous l'aiguille pour recueillir l'huile qui pourrait goutter. Ouvrez cette partie du micro-injecteur, puis ajoutez de l'huile ici afin d'éliminer toutes les bulles.

Et ceci se fixe simplement à cette seringue manuelle, tout comme l'embout précédent. Injectez lentement l'huile minérale afin qu'elle traverse le tube en plastique et élimine toutes les bulles présentes. Ensuite, remplissez à nouveau le réservoir en excès avec de l'huile minérale jusqu'à ce qu'elle commence à déborder.

Ensuite, vous devez rebrancher ceci à cette seringue en verre afin de ne pas introduire de bulles. Remplissez ensuite par le bas les composants assemblés avec de l'huile minérale jusqu'à ce que tout le tube de l'aiguille et la seringue soient pleins. Le micro-injecteur est maintenant prêt à être utilisé pour l'administration du diluant.

Ensuite, préparez les animaux en aspirant 15 femelles adultes dans un petit récipient solide qui sera complètement immergé dans de la glace. Les moustiques sont anesthésiés lorsqu'ils sont immobilisés par le froid, ce qui prend habituellement huit minutes ou moins. Placez un moustique anesthésié sur une lame creuse où aura lieu la microinjection.

Au microscope, prélevez 12 microlitres de diluant hémolymphatique à l’aide du micro-injecteur. Saisissez délicatement le moustique sous le microscope à l’aide de pinces et injectez trois à 3,5 microlitres de diluant. Entre le septième et le huitième segment abdominal, l’abdomen gonflera.

Pendant l'injection du diluant, trois moustiques peuvent être injectés. Avant de recharger la micro-injecteur, placez tous les moustiques injectés dans un gobelet en plastique propre placé sur de la glace, où les moustiques récupéreront pendant environ cinq minutes. Pendant l'incubation, le diluant anticoagulant détache les hémocytes des tissus internes.

Pendant que le premier lot d'animaux récupère en incubation, trois à cinq moustiques supplémentaires peuvent généralement être injectés. Après les cinq minutes, toujours dans le gobelet, préparez les moustiques injectés en sectionnant leurs membres, leurs ailes et les extrémités de leurs abdomens au niveau du huitième segment à l’aide de ciseaux microchirurgicaux. Veillez à ne pas couper les membres et les ailes trop près du thorax ou de l’hémolymphe.

Le limp peut s'échapper. Lavez maintenant une lame gravée à l'aide d'éthanol à 70 % et séchez-la avec un essuie-tout. Sous le microscope, placez un moustique disséqué au niveau du bord extérieur du cercle gravé.

Charger le micro-injecteur avec 12 microlitres de diluant frais. Tenir le moustique avec des pinces et injecter de huit à dix microlitres sur le côté latéral du mésothorax. Veiller à ne pas injecter d'huile minérale après cette injection.

Le lymphohémolymphe s'écoulera depuis l'abdomen vers le cercle tracé ; effleurez doucement l'abdomen avec une pince pour diriger et favoriser l'écoulement du lymphohémolymphe. Laissez maintenant sécher le lymphohémolymphe recueilli sur la lame. Cette étape doit prendre environ 10 minutes.

Il est alors prêt à être coloré. Colorer chaque lame séparément avec Hema trois. Plonger chaque lame dans le fixateur cinq fois, pendant une seconde par immersion.

Suivez cela par trois trempages d'une seconde dans la solution un, puis dans la solution deux. Rincez maintenant uniquement l'arrière de la lame avec de l'eau déionisée, pas l'avant blo. Séchez le côté avant, placez une lame couvre-objet avec un milieu de montage et appuyez doucement sur la lame couvre-objet afin que le milieu recouvre complètement le tissu coloré.

Laissez maintenant la lame sécher pendant au moins trois heures pour des résultats optimaux. Les hématies colorées doivent être visualisées et photographiées dans les deux semaines suivant cette préparation. Ces cellules provenant de femelles adultes ont été identifiées à l'aide de ce protocole.

La première image montre un hémocyte pro d'après sa forme allongée et son rapport élevé entre le noyau et le cytoplasme. Cette image correspond à un cyt ENO en raison de sa forme allongée et de son rapport cytoplasme/noyau. Enfin, ceci est un hémocyte de type granulocyte.

Il présente une texture plus granuleuse et une forme plus proche de l'OID par rapport aux méthodes d'injection précédentes. Ce protocole a permis d'obtenir un nombre total de cytes similaire et a également identifié les sites granuleux comme le type cellulaire le plus courant, une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en une heure pour environ 15 à 20 moustiques si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment injecter correctement les moustiques avec un dent, comment recueillir leur hémolymphe, puis comment préparer l'hémolymphe pour la visualisation et l'imagerie.