Une technique basée Impédance électrique en temps réel pour mesurer Invasion de monocouche de cellules endothéliales par les cellules cancéreuses
1 avril 2011
Cet article décrit une In vitro Technique pour les cellules cancéreuses de surveillance d'invasion par une monocouche de cellules endothéliales. Les données sont acquises en temps réel en fonction des variations d'impédance sur la surface des électrodes en fond de puits.
Ce vidéo montre une méthode permettant de surveiller l'envahissement d'une monocouche de cellules endothéliales par des cellules cancéreuses, en utilisant une technique basée sur l'impédance électrique en temps réel. Tout d'abord, des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine, appelées VE, sont mises en culture dans des plaques EPL à 16 puits revêtues d'électrodes d'or au fond de chaque puits. Pour former une monocouche confluente, des cellules cancéreuses sont ajoutées ; elles s'attachent aux cellules VE et envahissent la monocouche HVAC, perturbant ainsi les jonctions entre les cellules endothéliales. Des mesures d'impédance, qui dépendent de la surface totale du fond du puits recouverte par les cellules, sont ensuite enregistrées.
L'ampleur de l'invasion peut ensuite être déterminée en fonction des changements d'impédance électrique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests de chambre à vide et les dosages METROGEL, est que les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules tumorales imitent plus fidèlement le processus métastatique in vivo, et que les données sont obtenues en temps réel et sont plus facilement quantifiables, contrairement à l'analyse ponctuelle utilisée pour d'autres méthodes. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'invasion des cellules cancéreuses.
Il peut également être appliqué à d'autres systèmes, comme l'étude des interactions entre cellules dans le système immunitaire. De plus, la phase initiale de l'expérience, durant laquelle nous observons la croissance des cellules UX, peut être utilisée pour évaluer la prolifération cellulaire de n'importe quelle lignée cellulaire, sans étapes supplémentaires d'envahissement, ce qui démontre que la procédure sera utile sur le site. Rahim, étudiante diplômée de mon laboratoire. Toutes les étapes de ce protocole doivent être réalisées dans des conditions stériles, dans une hotte de culture tissulaire.
Le système Xcel utilisé pour cette expérience est conservé en permanence dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, dédié exclusivement à cet instrument dès sa première utilisation. L'instrument doit rester dans l'incubateur pendant au moins 16 heures afin de s'équilibrer avec le nouvel environnement de température et d'humidité. Ensuite, préparez le Thence EPL 16 en le recouvrant de gélatine à 0,1 % pendant une heure à 37 degrés Celsius.
Une fois la plaque enrobée, lavez-la une fois avec du PBS. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu e gm deux reconstitué pour effectuer une mesure de blanc, afin de mesurer l'impédance de fond en l'absence de cellules.
Placer l'EPL dans le système d'agent Excel sur l'ordinateur. Ouvrir le logiciel d'agent Excel en cliquant sur l'icône du logiciel RTCA sur le bureau dans la fenêtre du logiciel. Cliquer sur l'onglet disposition et sélectionner les puits contenant les échantillons.
Pour programmer la fréquence d'acquisition de données en temps réel, cliquez sur l'onglet planification, puis sur l'icône ajouter une étape. Sweeps indique le nombre de mesures et intervals indique l'intervalle de temps entre les mesures. Ces paramètres sont automatiquement réglés respectivement sur un et 1,00 minute.
Ceci programme le système pour effectuer une lecture de fond. Cliquez sur ajouter une étape et saisissez 300 dans la case balayages et 10 minutes dans la case intervalles. Ceci programmera l'appareil pour effectuer des mesures d'impédance pendant jusqu'à 50 heures.
Pour commencer l'expérience, cliquez sur l'icône démarrer une étape. L'impédance de fond de chaque puits sera mesurée après la réalisation de la mesure de fond. La fenêtre affiche le message.
Prêt pour l'étape suivante, veuillez cliquer. Prochaine étape à démarrer. À ce stade, les cellules peuvent être ajoutées et la formation d'une monocouche peut être surveillée comme décrit.
Dans la section suivante, les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine, ou VE utilisées ici, sont cultivées dans un milieu EGM deux reconstitué avec le complément EGM deux bullet kit contenant des suppléments de facteurs de croissance et 5 % de FBS. Les cellules doivent être maintenues dans un incubateur à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone. Le jour de l'expérience, vérifiez la confluence des HUB E au microscope. Les cellules doivent avoir un numéro de passage faible, de préférence pas plus de six et une confluence inférieure à 75 %, afin de produire une monocouche homogène. Récoltez les cellules par trypsine. Une fois que les cellules se sont détachées du flacon, éliminez toute trace de trypsine par centrifugation à 200 ×g. Après la centrifugation, lavez les cellules une fois avec du PBS.
Ensuite, resuspendre les cellules et le milieu e GM deux reconstitué à une concentration de 2,5 × 10⁵ cellules par millilitre. Une fois les cellules resuspendues, retirer le EPL étalonné en fond du système EXOGEN et ajouter 100 microlitres de la suspension HX aux 100 microlitres de milieu E GM deux déjà présents dans la plaque. Placer immédiatement le EPL dans l'analyseur cellulaire du système Excel.
Commencez à acquérir les mesures d'impédance en cliquant sur le bouton de démarrage dans la fenêtre du logiciel. Laissez les cellules endothéliales se développer. Le système continuera à effectuer des mesures d'impédance toutes les 10 minutes.
Les UVE présentent un aplatissement transitoire caractéristique de l'indice cellulaire quatre à six heures après l'ensemencement, suivi d'une nouvelle stabilisation après 16 à 18 heures. Il est donc important de laisser les cellules former une monocouche confluente pendant au moins 18 heures. Une fois la monocouche formée, il est temps d'ajouter les cellules invasives en prévision du test d'invasion.
Préparez les cellules tumorales envahissantes. Ici, des cellules d'ostéosarcome sont utilisées. Commencez par récolter les cellules à l'aide de trypsine.
Éliminer toutes les traces de trypsine en centrifugeant les cellules à 200 G et en les lavant une fois avec du PPS. Après le lavage, resuspendre les cellules à une densité finale de un fois dix puissance cinq cellules par millilitre dans le milieu utilisé pour cultiver les cellules tumorales, comme le milieu RPMI ou le milieu DMEA contenant 10 % de FBS. Interrompre l'expérience en cliquant sur l'icône d'étape de pause dans la fenêtre du logiciel.
Retirez l'EPL et aspirez le milieu EGM-2 du monocouche. Ajoutez 100 microlitres de suspension de cellules tumorales contenant 1 × 10⁴ cellules. Généralement, un ratio de 1 à 2,5 cellules tumorales pour une cellule endothéliale donne les meilleurs résultats pour le test.
Cependant, le ratio peut être optimisé pour chaque lignée cellulaire. Remettez l'EPL dans le système Excel Agent dans l'incubateur. Cliquez sur l'étape continuer pour poursuivre la prise de mesures d'impédance à des intervalles de 10 minutes.
Surveillez l'invasion en temps réel pendant les six à douze heures suivantes. Une diminution de l'indice cellulaire résulte du rétrécissement des jonctions endothéliales et de la pénétration par les cellules tumorales envahissantes. À la fin de l'expérience, utilisez le logiciel exergen pour normaliser les résultats par rapport au moment de l'ajout des cellules tumorales envahissantes.
Le logiciel exergen permet la normalisation à n'importe quel point temporel où les VEX ont été cultivés sur le système exergen, comme illustré dans cette vidéo, et soit les cellules K7M2, soit les cellules K12 ont été ajoutées après la formation de la monocouche. Comme indiqué ici, une diminution importante de l'indice cellulaire se produit quelques heures après l'ajout des cellules K7M2. K7M2 est une lignée cellulaire d'ostéosarcome hautement métastatique.
Ces cellules expriment des niveaux élevés de la protéine de liaison cytosquelettique ene, ce qui explique les propriétés invasives de la lignée cellulaire. Les cellules K 12, en revanche, sont moins métastatiques et incapables de pénétrer la monocouche endothéliale aussi efficacement que les cellules K seven M two. Ceci se traduit par une diminution moins marquée de l'indice cellulaire, comme indiqué ici.
Le témoin illustré ici représente l'impédance de la monocouche uvéale. En l'absence de cellules cancéreuses, les expériences ont été réalisées en triplicata. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer l'envahissement en temps réel en générant une monocouche de cellules endothéliales et en soumettant cette monocouche à des cellules cancéreuses.
Les premières étapes de l'expérience impliquant la formation d'une monocouche HU XL peuvent être utilisées pour évaluer la prolifération cellulaire par impédance. Deux.
Aperçu
Cet article décrit une technique basée sur l'impédance électrique en temps réel permettant de suivre l'invasion de cellules cancéreuses à travers une monocouche de cellules endothéliales. La méthode permet de quantifier les interactions cellulaires qui imitent les processus métastatiques in vivo.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Recherche sur le cancer
- Biologie des cellules endothéliales
Contexte
- Comprendre l'envahissement des cellules cancéreuses est essentiel pour élaborer des stratégies thérapeutiques.
- Les méthodes traditionnelles reposent souvent sur une analyse ponctuelle, qui peut être moins informative.
- Cette technique fournit des données en temps réel, améliorant ainsi la compréhension des interactions cellulaires.
- Elle peut également être adaptée à l'étude d'autres interactions cellulaires, comme celles du système immunitaire.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant la surveillance en temps réel de l'invasion des cellules cancéreuses.
- Fournir des informations sur les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules tumorales.
- Améliorer la quantification de l'invasion cellulaire par rapport aux méthodes existantes.
Méthodes utilisées
- Des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) sont cultivées pour former une monocouche.
- Des cellules cancéreuses sont introduites afin de surveiller leur invasion par des changements d'impédance.
- Des mesures d'impédance sont effectuées à intervalles réguliers pour évaluer les interactions cellulaires.
- L'expérience est réalisée dans des conditions stériles afin d'assurer la précision.
Résultats principaux
- La surveillance en temps réel de l'impédance permet de suivre efficacement l'invasion des cellules cancéreuses.
- Les variations d'impédance sont corrélées au degré de perturbation des jonctions endothéliales.
- La méthode permet d'optimiser les rapports cellulaires pour différents tests.
- Les données obtenues offrent des informations sur la dynamique de l'invasion cellulaire.
Conclusions
- Cette technique offre une représentation plus précise de l' invasion des cellules cancéreuses.
- L'acquisition de données en temps réel améliore la compréhension des processus métastatiques.
- La méthode peut être appliquée à diverses études sur les interactions cellulaires au-delà du cancer.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette technique d'impédance électrique en temps réel permet aux équipes de recherche et développement en biopharmacie d'évaluer quantitativement l'invasion de cellules cancéreuses à travers des monocouches endothéliales avec une pertinence physiologique. En enregistrant les changements dynamiques et sans marquage de l'impédance, corrélés à la rupture des jonctions et à la pénétration des cellules tumorales, cette méthode soutient l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés aux cibles anti-métastatiques. Elle offre une prédiction fiable en phase précoce de découverte, en distinguant les phénotypes envahissants des non-envahissants selon un format reproductible et évolutif.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant en temps réel les interactions tumeur-endothélium qui imitent la dissémination métastatique in vivo.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle de cibles grâce à des lectures basées sur l'impédance, reflétant l'intégrité des jonctions endothéliales et l'invasivité des cellules tumorales.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en distinguant les lignées d'ostéosarcome hautement métastatiques (par exemple, K7M2) de celles faiblement métastatiques (par exemple, K12) selon l'ampleur de la décroissance de l'impédance.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des sorties quantitatives normalisées d’indice cellulaire, adaptées au criblage à haut débit de composés ciblant les voies d’envahissement.
- Reproductibilité : Permet des mesures d’impédance cohérentes entre réplicats lorsque les monocouches endothéliales sont équilibrées pendant ≥18 heures avant l’ajout des cellules tumorales.
- Évolutivité : Compatible avec des réseaux d’électrodes de 16 puits, permettant des tests parallèles de conditions et l’optimisation des réactifs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise l'étape d'invasion endothéliale de la métastase, un goulot d'étranglement critique pour la survie des cellules tumorales circulantes et leur extravasation.
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre la découverte et les travaux précliniques en fournissant une lecture quantitative en temps réel des dynamiques d'invasion, applicable aux études de corrélation avec des biomarqueurs.
- Décisions ajustées au risque : Permet de prendre des décisions d'orientation (go/no-go) en associant les variations d'impédance à l'invasivité fonctionnelle, réduisant ainsi la dépendance aux tests terminaux.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs, où des métriques d'invasion en temps réel permettent d'établir précocement des relations structure-activité ainsi que des études sur le mécanisme d'action.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les interactions endothélio-tumorales en fournissant des données d'impédance sans marquage et en temps réel, reflétant l'adhésion cellulaire, l'expansion et la réorganisation des jonctions.
- Criblage : Fournit des niveaux de base d'impédance prêts à l'emploi et reproductibles, ainsi que des courbes dynamiques d'invasion, permettant le criblage de bibliothèques de composés contre des phénotypes d'invasion.
- Analyse : Produit des valeurs d'indice cellulaire sans dimension et des cinétiques temporelles d'invasion, permettant une comparaison quantitative des conditions et une normalisation par rapport aux temps initiaux d'invasion.
- Recherche translationnelle : S'intègre à la validation préclinique en modélisant une étape métastatique clé accessible à une intervention thérapeutique et à une modélisation pharmacocinétique-pharmacodynamique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable fondée sur l'impédance pour l'étude de diverses interactions cellule-cellule, notamment l'adhésion immuno-endothéliale, au-delà de l'oncologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans la modélisation des métastases.
- Valeur opérationnelle : Assure une standardisation, un suivi en temps réel et une quantification sans marquage, améliorant ainsi le débit par rapport aux tests terminaux comme la chambre de Boyden.
- Valeur stratégique : Renforce l'efficacité du capital en permettant des décisions « aller/ne pas aller » plus précoces, fondées sur des données, et réduisant ainsi le risque d'échec biologique en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des candidats anti-invasion grâce à des lectures phénotypiques quantifiables liées aux mécanismes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en culture cellulaire, en instrumentation basée sur l'impédance (par exemple, xCELLigence) et en technique stérile pour la formation reproductible d'une monocouche.
- Dépend de plaques à électrodes en or (EPL) et de systèmes d'analyse d'impédance dotés d'un contrôle environnemental (37 °C, 5 % de CO₂) afin d'assurer la stabilité du signal.
- Nécessite une standardisation inter-équipes de la densité d'ensemencement des cellules endothéliales, du numéro de passage (<6) et du temps d'équilibrage préalable à l'invasion (≥18 heures) pour assurer la comparabilité des données.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'extension à d'autres types cellulaires, comme les cellules immunitaires, notamment l'optimisation des rapports effecteurs/cibles et la compatibilité des milieux.
- Limite pratique : l'interprétation du signal suppose que les variations d'impédance reflètent principalement la couverture cellulaire et la morphologie ; des facteurs perturbateurs tels que la conductivité du milieu ou l'encrassement des électrodes doivent être maîtrisés.
