Une technique basée Impédance électrique en temps réel pour mesurer Invasion de monocouche de cellules endothéliales par les cellules cancéreuses

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Cette vidéo présente une méthode pour surveiller l’invasion d’une monocouche de cellules endothéliales par des cellules cancéreuses à l’aide d’une technique basée sur l’impédance électrique en temps réel. Tout d’abord, les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine appelées VE sont placées dans des EPL à 16 puits recouverts d’électrodes en or au fond du puits. Pour générer une monocouche confluente, des cellules cancéreuses sont ajoutées, qui se fixent à l’EV et envahissent la monocouche CVC, perturbant les jonctions cellulaires endothéliales.

L’étendue de l’invasion peut ensuite être déterminée en fonction des changements d’impédance électrique. Le principal avantage de cette technique ou des méthodes existantes, telles que les tests en chambre vide et METROGEL, est que les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules tumorales imitent plus étroitement le processus métastatique in vivo, et les données sont obtenues en temps réel et sont plus facilement quantifiables par rapport à l’analyse des points finaux pour d’autres méthodes. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’invasion des cellules cancéreuses.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que l’étude des interactions cellulaires dans le système immunitaire. De plus, la phase initiale de l’expérience où nous observons la croissance des cellules UX peut être utilisée pour évaluer la prolifération cellulaire de n’importe quelle lignée cellulaire sans autres étapes d’invasion démontrant que la procédure sera site Rahim étudiant diplômé de mon laboratoire. Toutes les étapes de ce protocole doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte de culture tissulaire.

Le système Xcel utilisé pour cette expérience est conservé en permanence dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone, uniquement dédié à cet instrument lors de sa première utilisation. L’instrument doit être laissé dans l’incubateur pendant au moins 16 heures pour s’équilibrer avec le nouvel environnement de température et d’humidité. Ensuite, préparez Thence EPL 16 en l’enrobant de gélatine à 0,1 % pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Une fois la plaque enduite, lavez-la une fois avec du PBS. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu e gm two reconstitué pour effectuer une lecture à blanc. Pour mesurer l’impédance de fond en l’absence de cellules.

Placez l’EPL dans le système d’agent Excel de l’ordinateur. Ouvrez le logiciel de l’agent Excel en cliquant sur l’icône du logiciel RTCA sur le bureau dans la fenêtre du logiciel. Cliquez sur l’onglet Mise en page et sélectionnez les puits contenant les échantillons.

Pour programmer la fréquence d’acquisition des données en temps réel. Cliquez sur l’onglet Horaire, puis cliquez sur l’icône Ajouter une étape, balayages indique le nombre de lectures et intervalles indique l’intervalle de temps entre les lectures. Ceux-ci sont automatiquement réglés sur 1 et 1,00 minute respectivement.

Cela programme le système pour effectuer une lecture de fond. Cliquez sur ajouter une étape et entrez 300 dans la case des balayages et 10 minutes dans la case des intervalles. Cela programmera l’instrument pour effectuer des mesures d’impédance jusqu’à 50 heures.

Pour commencer l’expérience, cliquez sur l’icône Démarrer une étape. L’impédance de fond de chaque puits sera mesurée après que la mesure de fond a été effectuée. La fenêtre affiche le message.

Prêt pour l’étape suivante, veuillez cliquer. Prochaine étape pour commencer. À ce moment-là, des cellules peuvent être ajoutées et la formation d’une monocouche peut être surveillée comme décrit.

Dans la section suivante, la veine ombilicale humaine, les cellules endothéliales ou l’EV utilisées ici sont cultivées dans un milieu EGM deux reconstitué avec le kit EGM à deux balles contenant des suppléments de facteurs de croissance, et les cellules FBS à 5 % doivent être maintenues dans un incubateur à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone. Le jour de l’expérience, vérifiez la compatibilité de HUB E Au microscope, les cellules doivent avoir un faible nombre de passages, de préférence pas plus de six et moins de 75 % de confluence pour générer une teinte, monocouche récolter les cellules par trypsine. Une fois que les cellules se sont détachées du ballon, toutes les traces de trypsine doivent être éliminées par centrifugation à 200 G.Après l’essorage, laver les cellules une fois avec du PBS.

Ensuite, mettez les cellules en suspension et reconstituez deux milieux génétiquement modifiés à une concentration de 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre. Une fois les cellules remises en suspension, retirez l’EPL calibré en arrière-plan du système EXOGEN et ajoutez 100 microlitres de suspension HX aux 100 microlitres de E GM deux milieux déjà présents dans la plaque. Placez immédiatement l’EPL dans l’analyseur de cellules du système Excel.

Commencez à acquérir des lectures d’impédance en cliquant sur le bouton Démarrer dans la fenêtre du logiciel. Permettez aux cellules endothéliales de se développer. Le système continuera à prendre des relevés d’impédance toutes les 10 minutes.

Ils montrent un aplatissement transitoire caractéristique de l’indice cellulaire quatre à six heures après l’ensemencement, suivi d’une autre stabilisation après 16 à 18 heures. Par conséquent, il est important de laisser les cellules former une monocouche confluente pendant au moins 18 heures. Une fois qu’une monocouche s’est formée, il est temps d’ajouter les cellules envahissantes en préparation de l’essai d’invasion.

Préparez les cellules tumorales envahissantes. Ici, les cellules d’ostéosarcome sont utilisées. Commencez par récolter les cellules à l’aide de la trypsine.

Éliminez toute trace de trypsine en faisant tourner les cellules à 200 G et en les lavant une fois avec du PPS. Après le lavage, suspendez les cellules pendant une densité finale de un fois 10 à la cinquième cellules par millilitre dans le milieu utilisé pour la croissance des cellules tumorales tel que le milieu RPMI ou DMEA contenant 10 % FBS. Interrompez l’expérience en cliquant sur l’icône de l’étape de pause dans la fenêtre du logiciel.

Retirez l’EPL et aspirez le milieu EGM two de la monocouche de l’aspirateur. Ajoutez 100 microlitres de suspension de cellules tumorales contenant un fois 10 à la quatrième cellule. Généralement, un rapport de 1 à 2,5 cellules tumorales par rapport aux cellules endothéliales fonctionne le mieux pour le test.

Cependant, le rapport peut être optimisé pour des lignées cellulaires individuelles. Replacez l’EPL dans le système d’agent Excel de l’incubateur. Cliquez sur l’étape de continuation pour continuer à prendre des lectures d’impédance à des intervalles de 10 minutes.

Surveillez l’invasion en temps réel au cours des six à 12 prochaines heures. Une baisse de l’indice cellulaire résultera de la rétraction des jonctions endothéliales et de la pénétration par les cellules tumorales envahissantes. Lorsque l’expérience est terminée, utilisez le logiciel exergen pour normaliser les résultats au moment de l’addition des cellules tumorales envahissantes.

Le logiciel exergen permet la normalisation à n’importe quel point temporel où les VEX ont été cultivés sur le système exergen, comme le montre cette vidéo, et soit K sept M deux cellules, soit K 12 cellules ont été ajoutées après la formation de la monocouche. Comme le montre ici, une forte diminution de l’indice cellulaire se produit quelques heures après l’introduction de K sept M deux cellules. K seven M two est une lignée cellulaire d’ostéosarcome hautement métastatique.

Ces cellules expriment des niveaux élevés de la protéine de liaison cytosquelettique, l’ène, ce qui explique les propriétés invasives de la lignée cellulaire. Les cellules K 12, en revanche, sont moins métastatiques et ne peuvent pas pénétrer la monocouche endothéliale aussi efficacement que les cellules K sept M deux cellules. Ceci est représenté par une diminution moins profonde de l’indice de cellule, comme indiqué ici.

La commande illustrée ici représente l’impédance de la monocouche uve. En l’absence de cellules cancéreuses, les expériences ont été réalisées en trois exemplaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’invasion en temps réel en générant une monocouche de cellules endothéliales et en défiant la monocouche avec des cellules cancéreuses.

Les premières étapes de l’expérience impliquant la formation d’une monocouche HU XL peuvent être utilisées pour évaluer la prolifération cellulaire par impédance. Deux.