Name: Lanalyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Apprenez à analyser la morphologie des épines dendritiques dans les neurones corticaux de culture primaire. Cette méthode utilise la microscopie confocale pour visualiser et quantifier les changements de structure synaptique.

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Nous remercions Kelly Jones pour l&#39;édition soignée. Ce travail a été soutenu par NIH R01MH 071316, Association Alzheimer, la National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD), et la National Alliance for Research Autisme (NAAR) (PP), l&#39;American Heart Association de bourses postdoctorales (DPS); américaine Heart Association Bourse prédoctorale (KMW).

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

La production de ce travail a été soutenu par MetaMorph (Molecular Devices, Inc.)

Les techniques décrites ci-dessus pour l&#39;analyse quantitative détaillée de la morphologie des épines dendritiques, densité linéaire et la motilité soit fixe ou vivent les neurones corticaux primaires sont axés sur la compréhension des effets de post-synaptique des mécanismes qui peuvent contribuer à neuropathologies. Une approche similaire peut être utilisée pour quantifier la morphologie ou la motilité du rachis dans tous les neurones épineux, dont l&#39;hippocampe pyramidale, Purkinje, ou neurones épineux moyens. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> 18 mm verre de couverture ronde n ° 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> Carré de 22 mm Couverture en verre n ° 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> 70 MW ~ 150 kDa </td></tr><tr><td> Médias Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Montée scientifique </td><td> Asc-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> MediaTech Cellgro </td><td> 25 à 060-C 1 </td><td> 1M, pH 7 </td></tr><tr><td> Solution de formaldéhyde </td><td> EMD Chemicals </td><td> FX0415-5 </td><td> 36%, histologie de grade </td></tr><tr><td> Chèvres sérum normal </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson Labs Immunoresearch </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros Organics </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (H + L) très croisée adsorbé </td><td> Invitrogen </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (H + L) * hautement croisée adsorbé * </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongez réactif Antifade Or </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Emballage spécial </td></tr><tr><td> Ci-joint la chambre stade de l&#39;imagerie </td><td> Warner </td><td> RC-30HV </td><td></td></tr><tr><td> Unité de contrôle de température </td><td> Warner </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph </td><td> Universal Imaging </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du snc de culture

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Épines dendritiques sont les sites de la majorité des connexions excitatrices dans le cerveau, et la forme du compartiment post-synaptique des synapses. Ces structures sont riches en actine et ont été montrés pour être très dynamique. En réponse à la plasticité Hebbien classiques ainsi que des signaux neuromodulateurs, épines dendritiques peuvent changer de forme et de nombre, ce qui est pensé pour être critique pour le raffinement des circuits neuronaux et le traitement et le stockage d&#39;informations dans le cerveau. Dans épines dendritiques, un réseau complexe de protéines lien avec les signaux extracellulaires cyctoskeleton actine permettant un contrôle de la morphologie des épines dendritiques et le numéro. Études neuropathologiques ont montré qu&#39;un certain nombre d&#39;états pathologiques, allant de la schizophrénie à des troubles du spectre autistique, affichage anormal morphologie des épines dendritiques ou des chiffres. Par ailleurs, de récentes études génétiques ont identifié des mutations dans les gènes qui codent de nombreuses protéines synaptiques, conduisant à des suggestions que ces protéines peuvent contribuer à la plasticité du rachis aberrante que, en partie, sous-tendent la physiopathologie de ces troubles. Afin d&#39;étudier le rôle potentiel de ces protéines dans le contrôle des morphologies épines dendritiques / nombre, l&#39;utilisation de cultures de neurones corticaux offre plusieurs avantages. Premièrement, ce système permet d&#39;imagerie à haute résolution des épines dendritiques dans les cellules fixes, ainsi que imagerie time-lapse de cellules vivantes. Deuxièmement, ce système in vitro permet de manipuler facilement la fonction des protéines par l&#39;expression de protéines mutantes, par les constructions démontables shRNA, ou des traitements pharmacologiques. Ces techniques permettent aux chercheurs de commencer à décortiquer le rôle de la maladie de protéines associées et de prédire comment les mutations de ces protéines peuvent fonctionner in vivo.

De nombreuses études récentes ont identifié des mutations dans les protéines synaptiques associés à des pathologies cérébrales. Primaire des cultures de neurones corticaux offrent une grande flexibilité dans l&#39;examen des effets de ces protéines associées à la maladie sur la morphologie des épines dendritiques et la motilité.

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Les épines dendritiques sont les sites de la majorité des connexions excitatrices au sein du cerveau et constituent le compartiment post-synaptique des synapses. Ces...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer les effets de diverses manipulations moléculaires et pharmacologiques sur la morphologie et la motilité des épines dendritiques. Ceci est réalisé en sectionnant des neurones corticaux primaires cultivés exprimant la GFP, avec ou sans expression exogène de plasmides d'ADN afin de délimiter la morphologie neuronale et de modifier l'expression et la fonction des protéines endogènes. Dans une deuxième étape, les cellules peuvent être traitées pharmacologiquement, puis fixées pour une immunomarquage ou préparées pour une imagerie en laps de temps.Ensuite, un traitement pharmacologique permettra la visualisation des épines dendritiques ainsi que des modifications induites de leur morphologie et de leur mobilité. Puis des images en série Z de cellules fixées ou des images de cellules vivantes prises à des temps précis sont acquises à l’aide d’un microscope confocal. Des mesures détaillées de la morphologie des épines dendritiques peuvent être effectuées à partir de projections 2D d’images en série Z.Les résultats obtenus montrent l'effet de manipulations moléculaires ou pharmacologiques sur la morphologie ou la motilité des épines

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Source : Pekarek, B. T., et. al., Imagerie et quantification des dendrites neuronales intactes via le nettoyage tissulaire CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation, l’imagerie et l’analyse d’un cerveau de souris dégagé pour examiner les arborescences dendritiques, la morphologie de la colonne vertébrale et la distribution neuronale à l’aide de techniques de microscopie confocale et de reconstruction 3D.

Imagerie par microscopie confocale d’arborescences dendritiques intactes et de la morphologie de la colonne vertébrale dans le cerveau d’une souris dégagée

Source : Gouder, et. al. Quantification tridimensionnelle des épines dendritiques des neurones pyramidaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. J. Vis. Exp. (2015).Cette vidéo démontre l’imagerie et l’analyse des épines dendritiques dans des neurones pyramidaux transduits et immunomarqués à l’aide de la microscopie confocale. Le bruit de fond est réduit et les dendrites sont tracées en estimant leur diamètre et leur longueur. La segmentation automatisée de la colonne...

Quantification des épines dendritiques à l’aide de l’imagerie par microscopie confocale

Cet article décrit un protocole de travail à l'image épines dendritiques de neurones de l'hippocampe in vitro utilisant structuré Illumination Microscopy (SIM). Microscopie de super-résolution utilisant la carte SIM offre une résolution d'image de façon significative au-delà de la limite de diffraction de la lumière dans les trois dimensions de l'espace, ce qui permet l'imagerie des épines dendritiques individuelles avec l'amélioration de détail.

Imagerie épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

Nous décrivons deux méthodes de visualisation et de quantification de l’arborisation dendritique dans l’hippocampe de modèles murins : l’imagerie en temps réel et l’imagerie en profondeur de champ étendue. Alors que la première méthode permet un traçage topographique sophistiqué et une quantification de l’étendue de la ramification, la seconde permet une visualisation rapide de l’arbre dendritique.

Évaluation de l&#39;arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l&#39;hippocampe chez la souris

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Nous présentons ici un protocole Golgi-Cox avec beaucoup de détails. Cette méthode de tache tissulaire fiable permet une évaluation de haute qualité de la cytoarchitecture dans l'hippocampe et dans tout le cerveau, avec un dépannage minimal.

Évaluation de la complexité dendritique de l&#39;hippocampe chez les souris vieillies utilisant la méthode de Golgi-Cox

Nous présentons un protocole pour étiqueter et analyser les neurones pyramidaux, qui est essentiel pour évaluer les altérations morphologiques potentielles dans les neurones et les épines dendritiques qui peuvent sous-tendre les anomalies neurochimiques et comportementales.

Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire

Les épines dendritiques sont des caractéristiques cellulaires importantes du système nerveux. Ici, des méthodes d’imagerie en direct sont décrites pour évaluer la structure et la fonction des épines dendritiques chez C. elegans. Ces approches soutiennent le développement de criblages mutants pour les gènes qui définissent la forme ou la fonction de la colonne vertébrale dendritique.

Imagerie des épines dendritiques chez Caenorhabditis elegans

Le protocole décrit une modification de la méthode rapide de Golgi, qui peut être adaptée à n’importe quelle partie du système nerveux, pour colorer les neurones de l’hippocampe et du cortex préfrontal médian du rat.

Coloration rapide de Golgi pour la visualisation de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le cortex préfrontal

Les épines dendritiques sont des compartiments post-synaptiques de la plupart des synapses excitatrices. Des altérations de la morphologie de la colonne dendritique se produisent au cours du neurodéveloppement, du vieillissement, de l’apprentissage et de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, soulignant l’importance d’une analyse fiable de la colonne dendritique. Ce protocole décrit la quantification de la morphologie de la colonne dendritique avec précision et reproductibilité à...

Quantification de la colonne dendritique à l’aide d’un logiciel de reconstruction automatique de neurones tridimensionnels

Apprenez à analyser la morphologie des épines dendritiques dans les neurones corticaux de culture primaire. Cette méthode utilise la microscopie confocale pour visualiser et quantifier les changements de structure synaptique.

L'analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

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