Name: Whole mont In Situ de E8.5 à E11.5 embryons de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Apprenez l'hybridation in situ sur embryons de souris E8.5-E11.5 pour visualiser l'expression génique. Cette méthode robuste permet d'étudier l'embryogenèse avec des sondes ribo spécifiques et une détection immunohistochimique.

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<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les méthodes décrites dans ce protocole ont été adaptés à partir d&#39;un certain nombre de sources différentes et optimisé pour le montage toute E8.5-E11.5 embryons de souris âgés jour. Méthodes de montage toute l&#39;hybridation in situ des embryons de vertébrés est apparu au début des années 1990 2,5-12. Ce protocole a été adapté principalement à partir des méthodes développées pour les embryons de Xénope 7,8 ainsi que la souris 2,11. Dans notre protocole beaucoup d&...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Tapez </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Digoxigénine-11-uridine-5&#39;-triphosphate </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Réglez Triphosphate ribonucléoside </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Colonnes Spin rapide pour la purification d&#39;ARN radiomarqué </td><td> Alimentation </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polymérase </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 ARN polymérase </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 ARN polymérase </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 pCi </td><td> Réactifs </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNase I recombinante, sans RNase </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Urée, incolore à blanc cristaux ou poudre cristalline </td><td> Réactifs </td><td> Fisher </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de chargement de gel </td><td> Réactifs </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Alimentation </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV Stratalinker 2400 </td><td> Équipement </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diéthyl pyrocarbonate </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Héparine sodique </td><td> Réactifs </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> peroxyde d&#39;hydrogène à 30% dans de l&#39;eau </td><td> Réactifs </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glutaraldéhyde, 8% de grade EM </td><td> Réactifs </td><td> Polysciences </td><td> 0 / 710 </td><td> À utiliser avec prudence selon les instructions du fabricant </td></tr><tr><td> Réactif de blocage </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> Faire en stock 5% et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Faire que 10 mg / ml d&#39;actions et de stocker à -20 ° C. </td></tr><tr><td> RNase T1 </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Formamide </td><td> Réactifs </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorhydrate de lévamisole </td><td> Réactifs </td><td> ICN Biomedicals. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide ribonucléique de la levure Torula, type VI </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> R6625 </td><td> phénol / chloroforme extrait plusieurs fois et précipité, remis en suspension dans DEPC dH2O et conservés à -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigénine-AP fragments Fab </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BM Violet AP Substrat, précipitant. Prêt-à-l&#39;emploi. </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4 ml, transparent, fermé Top, Kit commodité de stockage Vial </td><td> Alimentation </td><td> Scientifique nationale </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr><td> Shake N four à hybridation Cuire </td><td> Équipement </td><td> Boekel Scientific </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Biopsie Sure-Tek </td><td> Alimentation </td><td> Fisherbrand </td><td> 15 à 200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast plus le milieu tissulaire intégration </td><td> Réactifs </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way jetables en plastique moules intégration tissulaire </td><td> Alimentation </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Microscope diapositives Colorfrost plus </td><td> Alimentation </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Nucléaire Rouge Rapide </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Réactifs </td><td> Richard-Allan scientifique </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mont in situ</emhybridation> de e8.5 à e11.5 embryons de souris

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Monter toute l&#39;hybridation in situ est une approche très instructive pour définir les profils d&#39;expression génique dans des embryons. L&#39;hybridation in situ dans les procédures sont longues et techniquement exigeant avec plusieurs étapes importantes qui contribuent collectivement à la qualité du résultat final. Ce protocole décrit en détail plusieurs étapes clés de contrôle de qualité pour l&#39;étiquetage de sonde d&#39;optimisation et de performance. Globalement, notre protocole fournit une description détaillée des étapes critiques nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles de grande qualité. Premièrement, nous décrivons la génération de digoxygénine (DIG) des sondes ARN marqués par transcription in vitro de matrices d&#39;ADN générés par PCR. Nous décrivons trois critiques des tests de contrôle qualité pour déterminer le montant, l&#39;intégrité et l&#39;activité spécifique de la DIG sondes marquées. Ces étapes sont importantes pour générer une sonde d&#39;une sensibilité suffisante pour détecter des ARNm endogène dans un embryon de souris ensemble. En outre, nous décrivons les méthodes de fixation et le stockage d&#39;embryons jour E8.5-E11.5 vieille souris pour l&#39;hybridation in situ. Ensuite, nous décrivons des méthodes détaillées pour limiter la protéinase K digestion des embryons réhydratés suivie par les détails des conditions d&#39;hybridation, lavages post-hybridation et le traitement RNase pour enlever hybridation de sonde non spécifique. Un anticorps AP-conjugué est utilisé pour visualiser la sonde marquée et de révéler le profil d&#39;expression de la transcription endogène. Résultats représentatifs sont présentés à partir d&#39;expériences réussies et les expériences typiques sous-optimale.

Ce support entière<em&gt; In situ</emProtocole d&#39;hybridation&gt; décrit les étapes essentielles qui assurent des résultats reproductibles de haute qualité pour les études d&#39;expression génique dans des embryons de jour E8.5-E11.5 vieille souris.

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

L'hybridation in situ sur montage entier est une approche très informative pour définir les profils d'expression génique dans les embryons. Les procédures d'hybridation in situ...

L'objectif général de cette procédure est de définir les profils d'expression génique dans des embryons entiers de souris. Cela est réalisé en concevant et en produisant d'abord une sonde ribo spécifique pour le gène d'intérêt. Ensuite, les embryons sont collectés et traités pour l'hybridation.Ensuite, la sonde marquée est hybridée aux embryons. La dernière étape consiste à visualiser la sonde hybridée par détection immunohistochimique. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant les profils d'expression génique dans des embryons entiers ou des sections embryonnaires.Après l'acquisition d'images au moyen d'un stéréomicroscope, d'un microscope de dissection ou d'un microscope ordinaire en champ clair, les personnes novices dans cette méthode éprouvent généralement des difficultés, car les protocoles d'hybridation in situ sont longs et exigeants sur le plan technique ; plusieurs étapes importantes contribuent ensemble à la qualité du résultat final. Tout d'abord, produire de l'ADN matrice en amplifiant la séquence d'intérêt à l'aide d'amorces spécifiques de gène conçues avec des séquences promoteurs de transcription farge aux extrémités 5'. Ensuite, purifier le produit de P

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