Name: Whole mont In Situ de E8.5 à E11.5 embryons de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Apprenez l'hybridation in situ sur embryons de souris E8.5-E11.5 pour visualiser l'expression génique. Cette méthode robuste permet d'étudier l'embryogenèse avec des sondes ribo spécifiques et une détection immunohistochimique.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R21MH082360 (BGC) et R01HD056315 (GRN), ainsi que l&#39;Université de Géorgie.

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les méthodes décrites dans ce protocole ont été adaptés à partir d&#39;un certain nombre de sources différentes et optimisé pour le montage toute E8.5-E11.5 embryons de souris âgés jour. Méthodes de montage toute l&#39;hybridation in situ des embryons de vertébrés est apparu au début des années 1990 2,5-12. Ce protocole a été adapté principalement à partir des méthodes développées pour les embryons de Xénope 7,8 ainsi que la souris 2,11. Dans notre protocole beaucoup d&...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Tapez </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Digoxigénine-11-uridine-5&#39;-triphosphate </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Réglez Triphosphate ribonucléoside </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Colonnes Spin rapide pour la purification d&#39;ARN radiomarqué </td><td> Alimentation </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polymérase </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 ARN polymérase </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 ARN polymérase </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 pCi </td><td> Réactifs </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNase I recombinante, sans RNase </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Urée, incolore à blanc cristaux ou poudre cristalline </td><td> Réactifs </td><td> Fisher </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de chargement de gel </td><td> Réactifs </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Alimentation </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV Stratalinker 2400 </td><td> Équipement </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diéthyl pyrocarbonate </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Héparine sodique </td><td> Réactifs </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> peroxyde d&#39;hydrogène à 30% dans de l&#39;eau </td><td> Réactifs </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glutaraldéhyde, 8% de grade EM </td><td> Réactifs </td><td> Polysciences </td><td> 0 / 710 </td><td> À utiliser avec prudence selon les instructions du fabricant </td></tr><tr><td> Réactif de blocage </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> Faire en stock 5% et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Faire que 10 mg / ml d&#39;actions et de stocker à -20 ° C. </td></tr><tr><td> RNase T1 </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Formamide </td><td> Réactifs </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorhydrate de lévamisole </td><td> Réactifs </td><td> ICN Biomedicals. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide ribonucléique de la levure Torula, type VI </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> R6625 </td><td> phénol / chloroforme extrait plusieurs fois et précipité, remis en suspension dans DEPC dH2O et conservés à -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigénine-AP fragments Fab </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BM Violet AP Substrat, précipitant. Prêt-à-l&#39;emploi. </td><td> Réactifs </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4 ml, transparent, fermé Top, Kit commodité de stockage Vial </td><td> Alimentation </td><td> Scientifique nationale </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr><td> Shake N four à hybridation Cuire </td><td> Équipement </td><td> Boekel Scientific </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Biopsie Sure-Tek </td><td> Alimentation </td><td> Fisherbrand </td><td> 15 à 200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast plus le milieu tissulaire intégration </td><td> Réactifs </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way jetables en plastique moules intégration tissulaire </td><td> Alimentation </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Microscope diapositives Colorfrost plus </td><td> Alimentation </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Nucléaire Rouge Rapide </td><td> Réactifs </td><td> Sigma </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Réactifs </td><td> Richard-Allan scientifique </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mont in situ</emhybridation> de e8.5 à e11.5 embryons de souris

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Monter toute l&#39;hybridation in situ est une approche très instructive pour définir les profils d&#39;expression génique dans des embryons. L&#39;hybridation in situ dans les procédures sont longues et techniquement exigeant avec plusieurs étapes importantes qui contribuent collectivement à la qualité du résultat final. Ce protocole décrit en détail plusieurs étapes clés de contrôle de qualité pour l&#39;étiquetage de sonde d&#39;optimisation et de performance. Globalement, notre protocole fournit une description détaillée des étapes critiques nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles de grande qualité. Premièrement, nous décrivons la génération de digoxygénine (DIG) des sondes ARN marqués par transcription in vitro de matrices d&#39;ADN générés par PCR. Nous décrivons trois critiques des tests de contrôle qualité pour déterminer le montant, l&#39;intégrité et l&#39;activité spécifique de la DIG sondes marquées. Ces étapes sont importantes pour générer une sonde d&#39;une sensibilité suffisante pour détecter des ARNm endogène dans un embryon de souris ensemble. En outre, nous décrivons les méthodes de fixation et le stockage d&#39;embryons jour E8.5-E11.5 vieille souris pour l&#39;hybridation in situ. Ensuite, nous décrivons des méthodes détaillées pour limiter la protéinase K digestion des embryons réhydratés suivie par les détails des conditions d&#39;hybridation, lavages post-hybridation et le traitement RNase pour enlever hybridation de sonde non spécifique. Un anticorps AP-conjugué est utilisé pour visualiser la sonde marquée et de révéler le profil d&#39;expression de la transcription endogène. Résultats représentatifs sont présentés à partir d&#39;expériences réussies et les expériences typiques sous-optimale.

Ce support entière<em&gt; In situ</emProtocole d&#39;hybridation&gt; décrit les étapes essentielles qui assurent des résultats reproductibles de haute qualité pour les études d&#39;expression génique dans des embryons de jour E8.5-E11.5 vieille souris.

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

L'hybridation in situ sur montage entier est une approche très informative pour définir les profils d'expression génique dans les embryons. Les procédures d'hybridation in situ...

L'objectif général de cette procédure est de définir les profils d'expression génique dans des embryons entiers de souris. Cela est réalisé en concevant et en produisant d'abord une sonde ribo spécifique pour le gène d'intérêt. Ensuite, les embryons sont collectés et traités pour l'hybridation.Ensuite, la sonde marquée est hybridée aux embryons. La dernière étape consiste à visualiser la sonde hybridée par détection immunohistochimique. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant les profils d'expression génique dans des embryons entiers ou des sections embryonnaires.Après l'acquisition d'images au moyen d'un stéréomicroscope, d'un microscope de dissection ou d'un microscope ordinaire en champ clair, les personnes novices dans cette méthode éprouvent généralement des difficultés, car les protocoles d'hybridation in situ sont longs et exigeants sur le plan technique ; plusieurs étapes importantes contribuent ensemble à la qualité du résultat final. Tout d'abord, produire de l'ADN matrice en amplifiant la séquence d'intérêt à l'aide d'amorces spécifiques de gène conçues avec des séquences promoteurs de transcription farge aux extrémités 5'. Ensuite, purifier le produit de PCR et inclure une étape de digestion à la protéinase K conformément au protocole écrit.Ensuite, préparez une réaction de transcription in vitro et incubez-la à la température optimale pendant deux heures. Après la digestion de l'ADN matrice, purifiez la sonde ribo par purification sur colonne et estimez le rendement de la sonde à l'aide d'un NanoDrop ou d'un lecteur d'absorption en microplaque. Ajustez ensuite la concentration de la sonde à 100 nanogrammes par microlitre en fonction du rendement estimé.Ensuite, vérifiez la qualité de la sonde par électrophorèse sur gel dénaturant d'acrylamide, comme décrit dans le protocole écrit, et en mesurant l'activité spécifique de la sonde RIBA. Une bonne sonde doit produire une seule bande nette sur le gel, avec une traînée minimale. Pour mesurer l'activité spécifique, effectuez une dilution sériée de la sonde ribo afin d'obtenir une gamme de dilutions allant de 10 à la puissance moins deux à 10 à la puissance moins cinq. Ensuite, pipetez un microlitre de chaque dilution sur un morceau de membrane High Bond N+ de 82 millimètres de diamètre, ainsi qu'un microlitre d'un échantillon d'ADN non marqué servant de témoin. Réalisez immédiatement la réticulation du filtre dans un réticulateur UV à 125 millijoules après la réticulation.Ajouter 10 millilitres de réactif de blocage à 1 % dans du tampon TN 1× et incuber à température ambiante pendant 30 minutes après la fin du blocage. Éliminer la solution de blocage et laver le filtre pendant 15 minutes à température ambiante dans 10 millilitres de tampon TN 1× pendant le lavage de la membrane. Préparer une dilution au 1/5 000 d'anticorps anti-doxygénine en fragment FAB dans 10 millilitres de tampon TN 1× après le lavage.Incuber la membrane dans cette solution pendant 30 minutes. Après l'incubation, laver la membrane deux fois pendant 15 minutes chacune dans 10 millilitres de tampon TN au concentration d'une fois. Après le dernier lavage, aspirer la solution de lavage de la boîte de Pétri et la remplacer par cinq millilitres de substrat BM purple. Incuber la membrane dans cette solution pendant 30 minutes.Une fois 30 minutes écoulées, vérifiez la membrane pour détecter la présence d'un signal visible émis par le point correspondant à la dilution 10 à la puissance moins quatre. Si le signal est visible, arrêtez la réaction colorimétrique en lavant deux fois avec du TE cinq fois, cinq minutes à chaque fois. Si aucun signal n'est visible après 30 minutes, le sonde doit être jetée.Prélevez les embryons de souris dans du PBST glacé. Ensuite, trie les embryons selon leur génotype dans des tubes de quatre millilitres à visser contenant du PBST. Fixez les embryons avec du PARALDÉHYDE à 4 % dans du PBST, sauf indication contraire.Toutes les étapes d'incubation et de lavage sont effectuées avec des solutions remplies jusqu'au niveau inférieur du col du flacon, ce qui correspond à un volume d'environ quatre millilitres. Laisser les embryons toute la nuit à quatre degrés Celsius après la fixation. Aspirer le paraformaldéhyde à 4 % dans le PBST à l'aide d'une pipette en verre type spaghetti et remplacer par du PBST.Placer le flacon sur de la glace pendant cinq minutes pour laver. Répéter ce processus afin de laver le tissu une deuxième fois. Ensuite, aspirer le PBST et déshydrater progressivement les embryons à l'aide d'une série de méthanol dans du PBST jusqu'à atteindre du méthanol à 100 %.Remarquez que la pointe de pipette est maintenue du côté opposé du flacon afin d'éviter d'endommager les embryons ; si désiré, les embryons peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius dans du méthanol à 100 % pendant jusqu'à huit mois, voire plus, jusqu'à leur utilisation. Transférez les embryons dans une boîte, percez le cœur et la tête des embryons de E 10,5 et plus âgés à l'aide d'un couteau de microdissection, alors qu'ils sont encore dans le méthanol. Cela permet aux solutions de lavage d'entrer dans les ventricules cérébraux et les cavités cardiaques et réduit la coloration de fond.Ensuite, réhydratez les embryons par des lavages successifs dans une série de méthanol dans du PBST. Terminez par deux lavages de cinq minutes chacun dans du PBST à 100 %, puis décolorez les embryons en préparant une solution de quatre parties de PBST pour une partie de peroxyde d'hydrogène à 30 % et en incubant les embryons dans cette solution pendant une heure sur de la glace. Pendant l'incubation, placez le tampon d'hybridation fraîchement préparé à 65 degrés Celsius pour le préchauffer.Lavez les embryons deux fois avec du PBST pendant cinq minutes chacun. Pendant le dernier lavage, préparez un stock de protéinase K à 20 milligrammes par millilitre avec de l'eau DEPC. Ensuite, diluez sérialement le stock pour obtenir une concentration de 10 microgrammes par millilitre.Protéinase K dans du PBST : aspirez la solution de lavage finale et remplacez-la par un millilitre de solution de protéinase K à 10 microgrammes par millilitre. Placez le tube verticalement dans un porte-tubes placé dans un bain-marie à 25 degrés Celsius et incubez de 10 à 30 minutes, selon la taille des embryons. Notez l'heure de début comme étant optimale et reproductible.Le temps d'incubation est crucial pour permettre la pénétration de la sonde ribo sans une sur-digestion de l'embryon. Pour arrêter la digestion par la protéase K, aspirez la solution de protéinase K 30 secondes avant la fin du temps d'incubation. Ensuite, lorsque le temps d'incubation est écoulé, ajoutez de la glycine fraîchement préparée à deux milligrammes par millilitre dans du PBST.Restons debout pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, répétez le lavage à la glycine pendant encore cinq minutes. Puis effectuez deux lavages au PBST, chacun de cinq minutes.Ensuite, re-fixez les embryons traités à la protéinase K en immergeant les embryons dans du PARALDÉHYDE 4 % dans du PBST supplémenté avec 0,2 % de glutaraldéhyde pendant 20 minutes. Lavez ensuite les embryons trois fois dans du PBST, cinq minutes à chaque fois. Après le dernier lavage, aspirez le PBST et remplacez-le par un millilitre de tampon d'hybridation préchauffé.Une fois que les embryons se sont déposés, aspirez le tampon d'hybridation et remplacez-le par un millilitre de tampon d'hybridation frais préchauffé. Incubez les tubes verticalement dans un four à 65 degrés Celsius équipé d'une plateforme agitée pendant une heure. Préparez un tampon d'hybridation contenant 0,5 microgramme par millilitre de ribo marqué.Utilisez une sonde pour les embryons jusqu'au stade E 8,5 ou de 0,1 à un microgramme par millilitre de sonde pour les embryons postérieurs au stade E 8,5. Après l'incubation, remplacez la solution de pré-hybridation par 0,4 millilitre de cette solution et effectuez l'hybridation toute la nuit à 65 degrés Celsius. Le lendemain, vérifiez la qualité des embryons.Si les embryons ont été trop longtemps traités à la protéinase K, ils peuvent adhérer à la paroi du flacon, devenir extrêmement transparents ou se désagréger. Les embryons présentant cet aspect doivent être éliminés, car leur traitement ultérieur ne donnera pas de données interprétables. Remplacez le tampon d'hybridation par quatre millilitres de solution.Une à 70 degrés Celsius. Maintenir cette température et effectuer deux fois des lavages de 30 minutes chacun pour les embryons E 8,5, ou trois fois 30 minutes par lavage. Pour les embryons E 9,5 et plus âgés, lors du dernier lavage, préparer quatre millilitres de solution à 50 %, une solution à 50 % deux pour chaque flacon, et préchauffer à 70 degrés Celsius après le dernier lavage.Incuber les embryons dans cette solution pendant 10 minutes, puis rincer trois fois pendant cinq minutes par rinçage avec quatre millilitres de solution. Deux à température ambiante avec agitation après le rinçage. Remplacer la solution par une solution fraîche.Deux contenant 100 microgrammes par millilitre d'ARN A et 100 unités par millilitre d'ARN T, incuber à 37 degrés Celsius deux fois pendant 30 minutes par lavage. Ensuite, la solution de lavage trois à 65 degrés Celsius avec agitation, deux fois pendant 30 minutes par lavage pour E 8,5, trois fois pendant 30 minutes par lavage pour E 9,5 et plus âgé. Enfin, laver trois fois pendant cinq minutes par lavage avec un fois TBST.Procédez ensuite à la détection des anticorps. Aspirez le dernier lavage de TBST du flacon et remplacez-le par 0,5 millilitre de TBST 1× additionné de 10 % de sérum de mouton traité thermiquement. Placez le flacon verticalement sur un agitateur rotatif à température ambiante et incubez en agitant pendant au moins deux heures et demie afin de bloquer les sites de fixation non spécifiques des anticorps.Une fois le temps d'incubation écoulé, aspirez la solution de blocage et remplacez-la par une solution fraîche de TBST 1× contenant 10 % de sérum et une dilution comprise entre un sur 2 000 et un sur 5 000 d'anticorps de fragments FAB conjugués à la phosphatase alcaline, d'antigène ovins soustraits, et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Effectuez trois lavages de cinq minutes chacun avec du TBST 1×. Puis réalisez cinq à six lavages d'une heure chacun à température ambiante, et enfin un lavage toute la nuit à quatre degrés Celsius afin d'éliminer l'excès d'anticorps.Le lendemain, laver les embryons deux fois pendant 20 minutes par lavage avec un tampon de phosphatase alcaline fraîchement préparé. Cette procédure est importante pour réduire le fond non spécifique.Remplacez le dernier lavage par un millilitre de substrat AP violet BM préchauffé. Incubez à température ambiante à l’abri de la lumière et surveillez périodiquement le signal au microscope stéréoscopique. Pour un messager abondant.L'ARN devrait être visible dans les 15 minutes. Lorsque le signal est clairement visible ou si la coloration de fond commence à poser problème, arrêtez la réaction en lavant deux fois pendant cinq minutes par lavage avec du PBST 1× contenant 5 millimolaire de EDTA, puis capturez des images pour documenter le motif de coloration de l'embryon entier. Une fois ceci effectué, remettez les embryons dans un flacon contenant le substrat BM violet et incubez de 16 à 24 heures à température ambiante jusqu'à ce que la surface externe de l'embryon devienne bleu foncé, afin de permettre à la coloration de pénétrer tout l'embryon.Ensuite, transférez les embryons dans du paraldéhyde à 4 % dans du PBST pour une rep fixation de plusieurs heures ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Cette étape de fixation finale est cruciale pour la conservation à long terme du motif de coloration. Enfin, procédez à l'inclusion en paraffine et à la sectionnement selon les procédures décrites dans le protocole écrit afin de révéler cette coloration.Cette image montre un montage réussi en in situ hybride sur un embryon E 10,5 à l'aide d'une sonde ribo spécifique de gata trois. Voici une image montrant un embryon E 11,5 qui a été marqué avec succès à l'aide d'une sonde ribo spécifique de Fox G un. Cette image montre un fond élevé et un signal faible provenant d'une hybridation in situ ratée avec une sonde gata trois partiellement dégradée, illustrant l'importance d'effectuer un contrôle qualité rigoureux des sondes afin d'obtenir des résultats de haute qualité.Voici une image d'une autre procédure infructueuse. Dans ce cas, la procédure a été réalisée sans ponction de la tête, entraînant un niveau élevé de coloration de fond dans les ventricules, comme l'indiquent les têtes de flèches. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une hybridation in situ de haute qualité afin de définir les profils d'expression génique chez des embryons de souris, pour des comparaisons spatiales, temporelles ou selon le génotype.

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Biologie

Cette vidéo montre deux couleurs monter toute l'hybridation in situ, une méthode par laquelle le profil d'expression spatiale et temporelle des deux gènes différents peuvent être visualisées dans des embryons de poulet jeunes. Cette méthode a été initialement présenté par David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil et David Ingham Ish-Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

Nous démontrons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) méthode pour identifier les interactions de facteurs au tissu-spécifique des gènes pendant ou après l'apparition de tissu-spécifique l'expression des gènes dans les tissus embryonnaires de souris. Ce protocole devrait être largement applicable pour l'étude de l'activation de gènes spécifiques de tissus comme il se produit pendant le développement embryonnaire normal.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

Ici, nous développons les outils nécessaires...

Ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

Nous présentons ici un protocole optimisé pour génotypager, colorer et préparer des souris fœtales pour l’imagerie des projections axonales du nocicepteur périphérique chez l’animal entier, comme méthode efficace pour évaluer les phénotypes de croissance des axones sensoriels chez les souris génétiquement modifiées en développement.

Whole-monter imagerie de l&#39;embryon de souris projections sensorielles Axon

Nous démontrons une méthode pour greffer des cellules cultivées dans des sites définis d’embryons de souris précoces afin de déterminer leur potentiel in vivo. Nous introduisons également une méthode d’électroporation optimisée qui utilise des capillaires en verre de diamètre connu, permettant l’administration précise d’ADN exogène dans quelques cellules des embryons.

Méthodes de transfert localisé précisément de cellules ou de l&#39;ADN dans des embryons de souris après l&#39;implantation précoce

Nous décrivons un protocole détaillé utilisant la microscopie épiscopique à haute résolution pour acquérir des images tridimensionnelles (3D) d’embryons de souris. Ce protocole amélioré utilise une méthode modifiée de préparation des tissus pour améliorer la pénétration du colorant fluorescent, permettant ainsi l’analyse morphométrique d’échantillons de petite et de grande taille.

Acquisition rapide des Images 3D Utilisation de haute résolution épiscopique Microscopie

Le nœud et la plaque de la notochorde sont transitoires organisateurs dans le développement des embryons de souris qui peuvent être visualisées à l’aide de plusieurs techniques de signalisation. Ici, nous décrivons en détail comment effectuer deux des techniques pour étudier leur structure et la morphogenèse : 1) microscopie électronique (MEB) ; et 2) support entier immunofluorescence (WMIF).

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

Nous présentons les protocoles afin d’examiner le développement de coeur de souris au microscope de toute monture épifluorescente sur des embryons de souris disséqués de ventriculaire spécifiques MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in. Cette méthode nous permet de directement visualiser chaque étape de la formation ventriculaire au cours du développement de coeur de souris sans fastidieuses méthodes histochimiques.

Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence

Classiquement, l’endocarde de la valve embryonnaire de souris primordium a été analysé en utilisant des coupes transversales, coronales ou sagittales. Notre nouvelle approche pour l’imagerie bidimensionnelle en face de l’endocarde dans les régions valvulogéniques permet une analyse de polarité plane et de réarrangement cellulaire de l’endocarde pendant le développement valvulaire.

En face Préparation d’un coussin endocardique pour l’analyse de morphogenèse planaire chez des embryons de souris

Cet article établit un pipeline pour des suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité d’embryons de souris gaztrulants pour le séquençage de cellules uniques et de noyaux.

Séquençage de l’ARN unicellulaire d’embryons entiers de souris mutantes : de l’épiblaste à la fin de la gastrulation

Apprenez l'hybridation in situ sur embryons de souris E8.5-E11.5 pour visualiser l'expression génique. Cette méthode robuste permet d'étudier l'embryogenèse avec des sondes ribo spécifiques et une détection immunohistochimique.

Whole mont In Situ de E8.5 à E11.5 embryons de souris

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