Name: Immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux suivants lésions axonales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Découvrez l'immunoprécipitation de la chromatine dans les ganglions de la racine dorsale après lésion axonale. Cette méthode permet d'identifier les sites de liaison des facteurs de transcription et les modifications épigénétiques impliqués dans la régénération nerveuse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier Andrea Tedeschi pour les aider à mettre les expériences de ChIP initiales en laboratoire et Ricco Lindner pour sa contribution à affiner les conditions de ChIP. Ce travail a été soutenu par la Fondation Hertie, la subvention de Fortune, Université de Tübingen, et la DFG DI subventions 1497/1-1 (tous accordés à Simone Di Giovanni).

1. Sciatique et une lésion du nerf dorsal colonne <ol><li> L'animal est placé sur une serviette en chirurgie et en dessous une thermopad est présent pendant toute la procédure garder la température du corps de la souris à 37 ° C. Tous les animaux sont anesthésiés à la chirurgie avec une constante isoflurane / O 2 de l'administration. Les instruments chirurgicaux sont autoclavés avant la procédure. </li><li> Pour les dommages sciatique, deux membres postérieurs sont soigneusement rasé, et l'épilation est complété par épilateur génériques avant nettoyage de la peau avec de l'alcool suivie par Betadyne 3 fois. </li><li> Le nerf sciatique est exposée par une incision de 4 mm postérieur et parallèlement au fémur à mi-cuisse à travers la peau et en répartissant les muscles en dehors de l'biceps avec des pinces fines. </li><li> Le nerf sciatique est exposée, puis blessé, et la peau est fermée avec deux clips de suture. </li></ol> REMARQUE: La même incision est faite pour exposer le nerf sciatique, mais la plaie est suturée fermée laissant intacte le nerf de la blessure imposture. <ol start="5"><li> Pour des blessures de la colonne dorsale, le dos de la souris est soigneusement rasé, et l'épilation est complété par épilateur génériques avant de nettoyer la peau avec de l'alcool de pulvérisation / glisser. </li><li> La moelle épinière est exposée par une incision de 2,5 cm environ T7 à T13. La peau est écartées, et le tissu conjonctif est enlevée le long de la vertèbre de T9 à T11. </li><li> Une laminectomie est réalisée à T10 niveau </li></ol> NOTE: Pour la plupart des expériences, la laminectomie est considéré comme la blessure Sham. <ol start="8"><li> Quelques gouttes de xylocaïne sont ajoutées au tissu pour anesthésier le cordon, et la dure-mère est enlevée, en accordant une attention à ne pas toucher la moelle épinière. </li><li> Les colonnes dorsales sont blessés et le muscle est suturé proches, encore une fois attention à ne pas toucher la moelle épinière. Enfin, la peau est suturée fermé avec des clips de suture. La buprénorphine (0,1 mg / kg) doit être administré deux fois par jour pendant 48 heures ou jusqu'à ce que ne sont plus nécessaires. </li></ol> 2. Réticulation <ol><li> Disséquer DRG L4 et L5 de souris blessées après l'euthanasie. Collecter un total de 16 GHM dans glacée HBSS + inhibiteurs de la protéase à cocktails (2 blessés et 2 simulacre DRG de chaque animal, pour un total de 4 animaux). </li><li> Centrifuger brièvement le DRG, puis retirez délicatement le HBSS et ajouter 500 ul de 1% de formaldehyde dans du PBS + cocktail inhibiteurs de la protéase et incuber l'échantillon pendant 30 minutes à 37 ° C. </li></ol> Étape critique. Utilisez fraîche, le formaldéhyde moléculaires de qualité de biologie. <ol start="3"><li> Ajouter 125 mM de glycine pour arrêter la fixation et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Centrifuger brièvement, aspirer hors de tampon, et lavez le tissu à deux reprises avec 500 ul PBS glacé + cocktail inhibiteurs de la protéase. </li></ol> 3. Préparation de noyaux et de cisaillement chromatine <ol><li> Aspirer le PBS, ajouter 400 ul de tampon de lyse SDS, transférer dans un tube à centrifuger pré-réfrigérés, et de perturber le tissu avec environ 30 coups à la micropestle. </li></ol> Étape critique. Lyse et des perturbations du tissu sont vitales pour un bon rendement de la chromatine réticulé. <ol start="2"><li> Soniquer l'échantillon avec 8 impulsions, 10 secondes chacun à la sortie de 70% (Bandelin, Sonoplus GM70). </li></ol> ATTENTION. Le cisaillement de la chromatine doit être optimisé pour votre sonication notamment mis en place et la fragmentation de la chromatine correcte doit être vérifié avant de lancer l'expérimentation IP réelle (voir la section 3). NOTE. Fragmentation de la chromatine pourrait également être effectuée par micrococcal nucléase (MNase) la digestion. En règle générale, la fragmentation par ultrasons est préféré pour des tissus fixés, tandis que la digestion est favorisée pour MNase immunoprécipitation tissus chromatine native. Réticulé, cisaillé chromatine peuvent être stockés à -80 ° C pendant 2 mois, mais éviter la répétition des cycles gel / dégel. 4. Analyse de la digestion de chromatine (recommandé) <ol><li> Retirer 10 ul de votre échantillon cisaillé chromatine pour l'analyse. Ajouter 200 mM de NaCl à l'échantillon et d'inverser le cross-link par une incubation à 65 ° C pendant 2h. </li><li> Purifier l'ADN (voir section 8) et d'exécuter un gel d'agarose 1%. ADN devraient être fragmentée à une longueur d'environ 200-1000 pb (figure 1). </li></ol> ATTENTION. Plus de la fragmentation de la chromatine peut conduire à de signal diminué, tandis que la fragmentation incomplète conduira à la résolution diminuée et le fond a augmenté. 5. Immunoprécipitation <ol><li> Déterminer le nombre de réactions d'immunoprécipitation (voir note ci-dessous), et diviser des échantillons aussi dans de nouveaux tubes. Porter le volume de chaquejusqu'à 500 ul avec un tampon de puce + inhibiteurs de la protéase cocktail. </li><li> Retirer 5 ul de votre échantillon dilué et le transfert dans un nouveau tube. Ceci est votre échantillon d'entrée de 1% et il sera stocké à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire (article 7). </li><li> Pour chaque immunoprécipitation, ajouter des anticorps appropriés ou IgG normales de contrôle et incuber à 4 ° C pendant la nuit avec la rotation. </li></ol> NOTE. Lors de la détermination du nombre d'immunoprécipitation, un contrôle positif (par exemple des anticorps histone H3) et un contrôle négatif (IgG normale) doit être envisagée. La quantité d'anticorps utilisés pour chaque IP varie entre anticorps et doit être déterminée empiriquement. Cependant, il est généralement dans une fourchette de 2-10? G / immunoprécipitation. <ol start="4"><li> Pour votre immunoprécipiter anticorps / protéine / ADN complexes, ajouter 30 ul de ChIP grade Perles protéines G magnétique et incuber pendant 2 h à 4 ° C avec rotation. </li></ol> 6. Lavage <ol><li> Pour déroulant liés chromatine perles complexes, placer le tube sur le support magnétique. Attendez jusqu'à ce que la solution est claire et ensuite retirer soigneusement votre surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de lavage faible teneur en sel (tampon ChIP) pour les perles et incuber à 4 ° C pendant 3-5 minutes avec une rotation, puis tirez vers le bas perles et aspirer hors laver comme à l'étape 6.1. Répétez cette étape pour un total de 3 lavages. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon de lavage élevées de sel (tampon puce + 350 mM NaCl) pour les perles et incuber pendant 3-5 minutes avec une rotation, puis tirez vers le bas perles et aspirer hors laver comme à l'étape 6.1. </li></ol> 7. Élution et le renversement de réticulation <ol><li> Prenez vos échantillons d'entrée de la -20 ° C, ajouter 150 ul de tampon d'élution ChIP et mis de côté à température ambiante jusqu'à l'étape 7.5. </li><li> Ajouter 150 pi de tampon d'élution ChIP 1x pour chaque échantillon IP de l'étape 6.3. </li><li> Placer les tubes dans un thermomixer et éluer la chromatine des billes en incubant les échantillons à 65 ° C pendant 30 minutes avec vortex doux. </li><li> Pull-down des perles sur le rack magnétique, et transférer soigneusement la chromatine éluée (surnageant) dans de nouveaux tubes. </li><li> Pour tous les tubes, y compris vos échantillons d'entrée, ajouter 200 mM de NaCl et 40 ug / réaction de la protéinase K et incuber à 65 ° C pendant 2 heures. </li></ol> NOTE. L'étape d'élution peut être effectuée à température ambiante, aussi, mais il pourrait ne pas être aussi efficace. 8. Récupération de l'ADN <ol><li> Ajouter 1 volume de phénol / chloroforme à vos échantillons provenant de l'étape 7.5 et vortex pendant 30 secondes. </li><li> Centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Soigneusement récupérer les aqueuse (supérieure) de phase dans de nouveaux tubes, ajouter 1 volume de chloroforme à la phase aqueuse, et le vortex pendant 30 secondes. </li><li> Centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Soigneusement récupérer les aqueuse (supérieure) de phase dans de nouveaux tubes, puis ajouter 300mm de NaOAc, 20 ug / réaction du glycogène, et 2,5 volumes d'éthanol glacé de 100%. </li></ol> ATTENTION. L'ajout d'un transporteur, comme le glycogène, est nécessaire pour améliorer la précipitation de relativement petite taille des fragments d'ADN. <ol start="6"><li> Incuber à -80 ° C pendant 2 heures pour précipiter l'ADN. </li></ol> NOTE. L'étape de précipitation peut aussi être effectuée durant la nuit à -20 ° C. <ol start="7"><li> Centrifuger les échantillons à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse pendant 20 minutes à 4 ° C. </li><li> Retirer délicatement le surnageant et laver les culots d'ADN précipité avec 300 pi de la glace froide d'éthanol à 70%. </li><li> Centrifuger les échantillons à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse pendant 10 minutes à 4 ° C. </li><li> Retirer délicatement le surnageant que possible et laisser les granulés séchés à l'air. </li><li> Remettre en suspension dans 20 pl de stériles H 2 O. Les échantillons sont maintenant prêts pour la PCR, ou l'ADN peuvent être conservés à -20 ° C. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Un résultat représentatif d'une expérience de ChIP dans les GHM suivants lésion sciatique est montré (figures 1 et 2). Premièrement, nous montrons l'ADN fragmenté à une longueur d'environ 200-1000 pb (figure 1). Deuxièmement, nous démontrons une puce PCR signaux suivants à partir du promoteur proximal de la croissance associée protéines-43 (GAP-43) que lors d'une lésion du nerf sciatique (couloir 4, la figure 2, 5 '). Aucun signal PCR est présent lorsque l'animal reçoit une blessure au simulacre seulement (piste 3), et lors de l'utilisation normale des IgG sériques pour la propriété intellectuelle (piste 5 et 6). Pour tester la spécificité de l'anticorps, nous avons analysé les échantillons d'ADN identiques, mais a utilisé un ensemble d'amorces de contrôle qui détecte une région dans le 3'-UTR de notre gène d'intérêt où aucune occupation est attendue. Signaux de PCR sont absents de toutes les voies (voies 3-6, Figure 2, 3 '), sauf pour le signal d'entrée, ce qui représente des échantillons d'ADN non-IP comme standard de contrôle PCR (voies 1-2, Figure 2). Cette procédure peut être effectuée ChIP suivants soit des lésions de la colonne dorsale sciatique ou épinière telles que résumées dans un schéma (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Gel d'agarose des inversé réticulé ADN qui a été cisaillé par sonication à la bonne plage de longueurs de fragment. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Semi-quantitative des résultats de PCR à partir de tissus DRG suivants lésion du nerf sciatique montrant que p53 acétylée se lie à la région de GAP-43 promoteur proximal 48 heures après une lésion du nerf sciatique. Contrôle de PCR de l'émission des tissus DRG mêmes que p53 acétylés ne pas se lier à une région de contrôle de l'ADN située dans la région 3 'non traduite (UTR) du gène GAP-43 (S = Sham, I = blessé). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Un schéma général montrant la localisation des sites de lésion sur le nerf sciatique, et la colonne dorsale.

<ol><li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li>
<li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarey%2C+MF+%22Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%22">Chromatin immunoprecipitation (ChIP)</a>. , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).</li>
<li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28%26mu%3BChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li>
<li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Makwana, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li>
<li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+p53-CBP%2Fp300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression%2C+axon+outgrowth%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li>
<li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li>
</ol>

Ce protocole fournit une méthode pour poser directement sur l&#39;environnement chromatine lors de la régénération axonale dans le système nerveux adulte après une lésion axonale. Il intègre le modèle de blessures avec des DRG immunoprécipitation de la chromatine à sonder l&#39;environnement et épigénétiques de la transcription à la suite de blessures ni à la SNP ou SNC. Il est particulièrement utile pour les enquêteurs qui voudraient caractériser les sites putatifs de liaison pour le facteur de transcription de leurs p...

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactifs </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Tampon ChIP 10x </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> 2x Elution Buffer ChIP </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> ChIP grade protéines G Perles magnétiques </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> Rack Grip Magna (8 également) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> Chloroforme </td><td> MERCK </td><td> De l&#39;ONU 1888 </td></tr><tr><td> Formaldéhyde 37% </td><td> ROTH </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10x solution de glycine </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> Le glycogène </td><td> Sigma </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> HBSS 10x </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Histone H3 d&#39;anticorps (lapin) </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> Normale IgG de lapin </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> Phénol / chloroforme / alcool isoamylique </td><td> ROTH </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> Comprimés protéase cocktail Inhibiteurs </td><td> Roche </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Protéinase K (20 mg / ml) </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> SDS Lysis Buffer </td><td> Upstate </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Équipement nécessaire </th></tr><tr><td> Sonicator </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux suivants lésions axonales

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axones dans le système nerveux central (SNC) ne se régénèrent pas, tandis que ceux du système nerveux périphérique (SNP) ne régénère dans une certaine mesure après une blessure (Teng et al., 2006). Il est reconnu que les programmes de transcription essentiels à la croissance des neurites et axonales sont réactivés lors d&#39;une lésion au niveau du SNP (Makwana et al., 2005). Toutefois, les outils disponibles pour analyser la régulation des gènes in vivo des neurones sont limitées et souvent difficiles. Les ganglions de la racine dorsale (DRG) offrent un système de blessures, car les deux excellents modèle de SNC et du SNP sont innervés par un axone bifurqué provenant du soma mêmes. Les ganglions représentent une collection discrète de corps cellulaires où tous les événements transcriptionnels se produire, et fournir ainsi une région clairement définie de l&#39;activité transcriptionnelle qui peuvent être facilement et de façon reproductible retiré de l&#39;animal. Blessure de fibres nerveuses au niveau du SNP (nerf sciatique par exemple), où la régénération axonale ne se produisent, devraient révéler un ensemble de programmes transcriptionnels qui sont distincts de ceux répondant à une blessure similaire dans le SNC, où la régénération n&#39;a pas lieu (par exemple, la moelle épinière ). Sites pour le facteur de transcription liant, histones et modification de l&#39;ADN résultant d&#39;une blessure à l&#39;autre SNP ou SNC peuvent être caractérisés en utilisant immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Ici, nous décrivons un protocole puce en utilisant les tissus fixés DRG la souris après une lésion axonale. Cette puissante combinaison fournit un moyen pour caractériser l&#39;environnement chromatine pro-régénération nécessaire pour favoriser la régénération axonale.

Nous présentons une méthode pour immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux après une lésion axonale. L&#39;approche peut être utilisée pour identifier des sites spécifiques facteur de transcription liant et la modification épigénétique de l&#39;importance des histones et l&#39;ADN pour la régénération des axones lésés à la fois dans le système nerveux central et périphérique.

Immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux suivants lésions axonales

Les axones du système nerveux central (SNC) ne se régénèrent pas, tandis que ceux du système nerveux périphérique (SNP) se régénèrent dans une certaine mesure après...

L'objectif général de cette procédure est d'immunoprécipiter des complexes ADN-protéine réticulés à partir de tissu de ganglions de la racine dorsale après une lésion nerveuse. Cela est réalisé en induisant d'abord une lésion du nerf sciatique ou de la colonne dorsale. La deuxième étape consiste à réticuler l'échantillon et à solubiliser le complexe ADN-protéine.La troisième étape de la procédure consiste à immunoprécipiter un complexe spécifique protéine-ADN. Enfin, l'ADN est purifié et récupéré. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'enrichissement de fragments d'ADN associés à une protéine ou à une modification d'histone de l'ADN.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération axonale, telles que quels sites de fixation de l'ADN, facteurs de transcription et modifications des histones sont nécessaires pour la régulation des gènes importants dans la promotion de la régénération axonale. Pour commencer, placez un animal anesthésié sur la table chirurgicale. Maintenez l'anesthésie tout au long de l'intervention grâce à une administration continue d'isoflurane et d'oxygène par un embout nasal avant de poursuivre.Confirmez la profondeur adéquate de l'anesthésie à l'aide du réflexe de pincement des orteils pour la lésion du nerf sciatique. Rasez soigneusement la région postérieure et éliminez les poils résiduels à l'aide d'un agent dépilatoire. Une fois les poils retirés, nettoyez la peau en appliquant plusieurs fois de l'alcool, puis du Bétadine.Réalisez une incision de quatre millimètres à travers la peau, postérieure et parallèle au fémur. Au milieu de la cuisse, utilisez une pince fine pour écarter les muscles et exposer le nerf sciatique blanc situé en dessous. Une fois isolé, le nerf peut soit être laissé intact pour servir de contrôle chirurgical factice, soit sectionné afin d'induire une lésion.Pour terminer, rapprocher la peau et fermer à l’aide de deux agrafes chirurgicales pour une lésion de la colonne dorsale. Retirer les poils du dos et nettoyer le site de l’incision comme indiqué précédemment. Réaliser une incision de 2,5 centimètres au-dessus de la moelle épinière, de T7 à T13 environ.Utilisez une pince fine pour tenir la peau tout en séparant la graisse. Ensuite, fixez la graisse superficielle à l’aide de deux crochets. Une fois la graisse rétractée, repérez le vaisseau sanguin dans l’espace situé entre la sixième et la septième vertèbre afin de l’utiliser comme point de repère.Couper le muscle bilatéralement au niveau des huitième et dixième vertèbres et insérer deux crochets pour le maintenir ouvert. Utiliser de petites ciseaux pour dégager les muscles recouvrant la lame de T8 à T10 en tenant le processus épineux. Réaliser une laminectomie à T10 en sectionnant l'os de connexion des deux côtés.Soulevez délicatement la moitié supérieure des vertèbres pour découvrir la moelle épinière située en dessous. Appliquez quelques gouttes de Xylocaïne à 2 % pour anesthésier la moelle épinière, puis retirez la dure-mère, en prenant soin de ne pas toucher la moelle épinière.S'arrêter à ce stade permettrait de réaliser un contrôle chirurgical factice afin de lésionner la colonne dorsale. Effectuer une incision profonde de 0,3 à 0,4 millimètre traversant la moelle épinière. Enfin, suturer le muscle et relâcher la graisse superficielle.Rapprocher la peau et fermer avec des agrafes chirurgicales. Remettre l'animal dans sa cage d'origine et surveiller jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli. 48 heures après la lésion, euthanasier l'animal et prélever les ganglions de la racine dorsale L4 et L5, ou DRG.La première étape consiste à exposer la colonne vertébrale ventrale. Ensuite, retirez la moitié ventrale des vertèbres de T12 à L6. Pour exposer la moelle épinière, identifiez les ganglions rachidiens situés dans l'espace entre les vertèbres, sur le côté de la moelle épinière.Utilisez une pince fine pour saisir les ganglions rachidiens L4 et L5 en les soulevant légèrement. Coupez le plus près possible du corps du ganglion rachidien. Réunissez un total de 16 ganglions rachidiens provenant de quatre animaux et placez-les dans du HBSS glacé.Centrifuger brièvement le GSR, ajouter 500 microlitres de formaldéhyde à 1 % et incuber l'échantillon pendant 30 minutes. À 37 degrés Celsius, ajouter 125 millimolaire de glycine pour arrêter la fixation et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après une courte centrifugation, aspirer le tampon et laver le tissu deux fois avec 500 microlitres de PBS glacé contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases.Ensuite, aspirez la PBS et ajoutez 400 microlitres de tampon de lyse SDS, puis homogénéisez le tissu avec environ 30 allers-retours à l’aide d’un petit pilon. Ensuite, soniquez la chromatine avec huit impulsions de dix secondes à 70 % de puissance. Il est recommandé d’analyser un échantillon afin de confirmer la fragmentation de l’ADN en fragments d’environ 200 à 1000 paires de bases.Divisez de manière égale l'échantillon de chromatine fragmentée dans un nouveau tube. Pour chaque réaction d'immunoprécipitation à réaliser, ajustez le volume de chaque tube à 500 microlitres avec du tampon chip additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases. Ensuite, prélève cinq microlitres de votre échantillon dilué et transférez-les dans un nouveau tube.Ceci est votre échantillon d'entrée à 1 %, qui sera conservé à moins 20 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Ensuite, ajoutez l'anticorps ou le contrôle d'IgG normale à chaque tube et incubez à quatre degrés Celsius avec rotation pendant la nuit. Le jour suivant.Immunoprécipitez le complexe en ajoutant 30 microlitres de billes magnétiques de protéine G et en incubant deux heures à quatre degrés Celsius sous agitation. Ensuite, placez le tube sur un support magnétique pour faire précipiter le complexe de chromatine lié aux billes. Lorsque la solution est claire, retirez soigneusement le surnageant et lavez les billes trois fois avec un millilitre de tampon à faible concentration saline, en effectuant une incubation de trois à cinq minutes à quatre degrés Celsius sous agitation pour chaque lavage.Ensuite, laver une fois avec un millilitre de tampon à haute force ionique. À ce stade, récupérer l'échantillon d'input à 1 % depuis -20 degrés Celsius et ajouter 150 microlitres de tampon d'élution chip. Mettre le tube de côté à température ambiante pour une utilisation ultérieure.En revenant aux échantillons d'IP, ajouter 150 microlitres de tampon d'élution à une fois aux puces dans chaque tube. Incuber les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes avec un vortexage doux afin d'éluer la chromatine des billes. Déposer les billes sur le support magnétique et transférer soigneusement la chromatine éluite dans de nouveaux tubes, y compris les échantillons d'entrée.Ajouter 200 millimolaire de chlorure de sodium et 40 microgrammes par réaction de protéase K, puis incuber à 65 degrés Celsius pendant deux heures. Après l'incubation, récupérer l'ADN en utilisant des procédures standard pour une analyse ultérieure ici. Les résultats de PCR semi-quantitative à partir de tissu DRG après une lésion du nerf sciatique sont présentés. Les pistes une et deux montrent le signal de PCR des échantillons d'entrée.Le signal PCR dans la bande quatre montre que la P 53 acétylée se lie à la région promoteur proximale de gap 43 uniquement après une lésion du nerf sciatique. Aucun signal PCR n'est présent lorsque l'animal subit une intervention factice, comme observé dans la bande trois, ni lorsqu'on utilise un sérum IgG normal, illustré dans les bandes cinq et six. La PCR contrôle effectuée à partir du même tissu de ganglions raciniens dorsaux montre que la P 53 acétylée ne se lie pas à une région contrôle de l'ADN située dans la région non traduite en trois primes du gène gap 43.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de trois étapes cruciales pour réussir. Commencez avec une quantité suffisante de tissu, assurez une fragmentation et une solubilisation efficaces du complexe ADN-protéine, et choisissez un bon anticorps pour l'immunoprécipitation de votre protéine d'intérêt.

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Nous démontrons un protocole pour l'isolement du nerf axoplasme sciatique de rat adulte repose sur la dissection des fascicules nerveux et l'incubation dans le milieu hypotonique pour libérer de la myéline et Lyse non axonale structures, suivie de l'extraction de l'axone reste-matériau enrichi.

Isolement axoplasme du nerf sciatique du rat

Imagerie en temps réel des axones de la racine dorsale après Rhizotomie

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

Source : Li, Q., et al. Étude de la régénération axonale des mammifères : électroporation in vivo du ganglion radiculaire dorsal de souris adulte. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre le processus de régénération axonale d’un nerf sciatique de souris à la suite d’une blessure par écrasement. Le nerf isolé est fixé et préparé pour l’imagerie, avec des protéines fluorescentes exprimées dans les neurones pour visualiser la croissance axonale. À l’aide d’un microscope à épifluorescence, la...

Régénération axonale du nerf sciatique d’une souris suite à une blessure par écrasement

Source : Li, Q. et al. Étude de la régénération axonale des mammifères : électroporation in vivo du ganglion radiculaire dorsal de souris adulte. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre la transfection médiée par électroporation des neurones DRG de souris pour étudier la régénération axonale. Il décrit les étapes de l’administration des constructions d’acides nucléiques aux neurones DRG, de l’induction de lésions du nerf sciatique et de l’évaluation de la régénération axonale.

Transfection médiée par électroporation des ganglions de la racine dorsale de souris pour favoriser la régénération sensorielle des axones

Un paradigme blessures en utilisant le cordon Drosophile larvaire nerveuse ventrale pour enquêter régénération du système nerveux central et de la réparation est décrite. Stabbing suivi par microscopie confocale à balayage laser dans des échantillons de time-lapse et fixe, combinée à une analyse quantitative d'un logiciel développé à dessein et de la génétique, sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du SNC et de réparation.

Un paradigme d&#39;enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de<em&gt; Drosophila</em

Ce protocole présente l’utilisation d’une injection de ganglion de la racine dorsale (DRG) avec un vecteur viral et d’une lésion concomitante par écrasement de la racine dorsale chez un rat adulte comme modèle pour étudier la régénération sensorielle des axones. Ce modèle convient à l’étude de l’utilisation de la thérapie génique pour favoriser la régénération sensorielle des axones.

Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

Électroporation est une approche efficace pour livrer des gènes d’intérêts dans les cellules. En appliquant cette approche in vivo sur les neurones du ganglion de la racine dorsale de souris adulte (DRG), les auteurs décrivent un modèle pour l’étude de la régénération axonale in vivo.

Chargée de l’enquête la régénération axonale mammifères : In Vivo électroporation du Ganglion de la racine dorsale de souris adulte

Nous présentons ici le développement permettant d’acquérir systématiquement des coupes de cryostat ganglionnaire de racine dorsale de haute qualité.

Une procédure pour la cryosection du ganglion de la racine dorsale de la souris

Ce protocole décrit un système microfluidique modélisant la dynamique métabolique neuronale post-lésion axonale, permettant l’imagerie, l’analyse multi-omique et les études mécanistes du remodelage métabolique intrinsèque.

Construction de modèles de puce microfluidique pour la construction et l’analyse multi-omique

Les ganglions de la racine dorsale (DRG) contiennent des corps cellulaires neuronaux sensoriels primaires et transmettent des signaux sensoriels périphériques à la moelle épinière. Ce protocole décrit une méthode de dissection de la DRG chez la souris qui soutient l’isolation standardisée des ganglions structurellement intacts, l’identification segmentaire anatomique, un accompagnement intuitif pour les utilisateurs débutants et une réduction des lésions tissulaires procédurales.

Dissection et isolement des ganglions dorsals de la souris

Découvrez l'immunoprécipitation de la chromatine dans les ganglions de la racine dorsale après lésion axonale. Cette méthode permet d'identifier les sites de liaison des facteurs de transcription et les modifications épigénétiques impliqués dans la régénération nerveuse.

Immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux suivants lésions axonales

Explorer plus de vidéos