Méthode d'agglutination de particules pour l'identification des poliovirus

L’objectif général de la procédure suivante est d’identifier rapidement les isolats du virus de la poliomyélite à l’aide d’un protocole simple. Pour ce test, nous utilisons des particules de gélatine sensibilisées enrobées de molécules chimériques contenant le domaine extracellulaire du récepteur du poliovirus humain connecté aux IgG two fc. Étant donné que ces particules ont une affinité uniforme pour tous les sérotypes d’isolats de poliovirus, l’agglutination des particules se produit lors de l’incubation avec des échantillons contenant n’importe quel poliovirus humain.

Cependant, si des anticorps capables de reconnaître le virus spécifique isolant l’échantillon sont présents, que la neutralisation se produit et empêche l’agglutination en utilisant ce système expérimental, l’identification rapide des isolats de poliovirus peut être effectuée en une seule étape. Le principal avantage de cette technique de navire existant, comme le test de neutralisation conventionnel, est la simplicité SIM de la procédure et de l’interprétation, visant à réduire la main-d’œuvre et à accélérer les délais d’obtention des résultats. Pour reconstituer les anticorps anti-PV, PV 2 et PV 3, ajoutez 0,5 millilitre d’eau dans chaque flacon.

Transférez ensuite chaque solution d’anticorps dans des tubes séparés contenant 4,5 millilitres de milieu d’entretien. Certains lots d’anticorps anti-PV sont fournis sous forme reconstituée pour ces lots d’anticorps anti-PV. L’ajout d’eau pour la reconstitution n’est pas nécessaire.

Ensuite, préparez des mélanges individuels de solution d’anticorps combinée d’un volume final de 3,6 millilitres dans des tubes fraîchement étiquetés. Par exemple, mélangez 1,8 millilitre d’anti-PV un avec 1,8 millilitres d’anti PV deux. Pour préparer une combinaison anti-PV un plus PV deux, répétez cette opération pour chaque combinaison possible par paires et préparez également une solution contenant les trois types d’anticorps en mélangeant 1,2 millilitre de chaque antisérum.

Une fois que les quatre mélanges ont été effectués à 720 microlitres de FCS pour chaque solution d’anticorps. Cela aidera à réduire l’agglutination non spécifique des particules de gélatine par les anticorps pendant le test. Les pools d’anticorps peuvent être stockés à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés dans le test d’agglutination.

Dans cet essai, nous utilisons des particules de gélatine lyophilisées qui ont été recouvertes des domaines extracellulaires du récepteur du poliovirus humain et des IgG deux domaines FC de souris. Assurez-vous d’utiliser un seul lot de particules et non des lots différents dans une seule expérience pour assurer la cohérence de l’image d’agglutination pour reconstituer les particules à 1,5 millilitre de tampon de reconstitution dans chaque flacon. Tapotez doucement pour bien mélanger.

Les particules reconstituées peuvent être stockées à quatre degrés Celsius pendant une période pouvant aller jusqu’à deux semaines. Tout d’abord, concevez votre expérience dans une plaque de microtitration de 96 puits. Pour chaque échantillon, le numéro un contiendra uniquement le virus.

Les puits numéro deux à cinq contiendront le virus ainsi que l’une des quatre solutions d’anticorps mélangées. Assurez-vous d’en conserver un pour un témoin négatif contenant uniquement des milieux sans virus ni anticorps. Une fois la plaque installée, ajoutez 12 microlitres de la bonne solution d’anticorps dans chaque puits des rangées deux à cinq et 12 microlitres de croissance.

Moyen au virus seul, puits dans la première rangée, et au contrôle négatif puits dans la sixième rangée. Ensuite, ajoutez 12 microlitres d’échantillon de virus dans les cinq premières rangées et 12 microlitres de milieu de croissance dans le puits de contrôle négatif de la sixième rangée. Une fois que les anticorps et le virus ont été mis en plaques, réanimez, suspendez les particules de gélatine reconstituées en les tapotant doucement et ajoutez immédiatement 25 microlitres de particules par puits à tous les puits.

Il est important de ne pas laisser les particules se déposer avant de les transférer sur la plaque afin d’obtenir des quantités égales de particules dans chacune. Placez bien la plaque de test sur un mélangeur à plaques et mélangez pendant 30 secondes. Placez ensuite l’assiette sur une feuille de papier blanc et incubez l’assiette à température ambiante pendant deux heures pour permettre une agglutination.

Il est important de ne pas déplacer la plaque à aucun moment pendant ou après l’incubation car l’agglutination formée est instable. Une fois la réaction produite, prenez plusieurs photos de la plaque dans lesquelles la qualité de l’agglutination dans chaque puits peut être appréciée. Dans les puits où l’agglutination n’a pas eu lieu, comme indiqué ici à gauche, les particules de gélatine colorées précipiteront au fond du puits dans les puits où l’agglutination s’est produite.

En raison de l’interaction entre le virus et les particules de gélatine enrobées d’IgG, un motif coloré diffus est visible comme indiqué au centre. Dans cette expérience, nous avons testé la capacité des solutions virales, PV un, deux et trois, à induire de la glu en présence de l’anticorps. Les combinaisons indiquées comme indiqué ici sont l’absence de virus ou d’anticorps, l’absence d’agglutination et la précipitation des particules de gélatine dans un virus bien contenant, mais pas d’anticorps.

L’agglutination s’est produite en raison de l’interaction du virus. Avec les particules de gélatine recouvertes de deux A par les IgG PVR dans les puits expérimentaux, une surabondance de virus est évitée dans tout puits contenant des anticorps qui neutralisent spécifiquement ce virus. Par exemple, une surabondance de poliovirus de type 1 est évitée dans des puits contenant des anticorps anti-PV un, mais pas dans des puits contenant uniquement des anticorps anti-PV deux et des anticorps anti-PV trois.

Il en va de même pour les types deux et trois du poliovirus. Bien que maîtrisée, cette technique peut être réalisée en aussi peu que trois heures si elle est exécutée correctement.