Méthode d'agglutination de particules pour l'identification des poliovirus

L'objectif général de la procédure suivante est d'identifier rapidement des isolats de virus de la poliomyélite en utilisant un protocole simple. Pour ce test, nous utilisons des particules de gélatine sensibilisées recouvertes de molécules chimériques contenant le domaine extracellulaire du récepteur humain du virus de la poliomyélite relié au fragment fc de l'IgG2. Étant donné que ces particules présentent une affinité uniforme pour tous les sérotypes d'isolats du virus de la poliomyélite, une agglutination des particules se produit lors de l'incubation avec des échantillons contenant un virus de la poliomyélite humain quelconque.

Cependant, si des anticorps capables de reconnaître l'isolat viral spécifique présent dans l'échantillon sont présents, une neutralisation se produit et empêche l'agglutination ; grâce à ce système expérimental, l'identification rapide des isolats de poliovirus peut être réalisée en une seule étape réactionnelle. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de neutralisation classique, réside dans la simplicité du procédé et de l'interprétation (SIM), visant à réduire la main-d'œuvre requise et à accélérer l'obtention des résultats. Pour reconstituer les anticorps anti-PV1, PV2 et PV3, ajouter 0,5 millilitre d'eau dans chaque flacon.

Ensuite, transférez chaque solution d'anticorps dans des tubes séparés contenant 4,5 millilitres de milieu de maintenance. Certains lots d'anticorps anti-PV sont fournis sous forme reconstituée ; pour ces lots d'anticorps anti-PV, l'ajout d'eau pour la reconstitution n'est pas nécessaire.

Ensuite, préparez des mélanges un-à-un de la solution d'anticorps combinée avec un volume final de 3,6 millilitres dans des tubes frais étiquetés. Par exemple, mélangez 1,8 millilitre d'anti-PV un avec 1,8 millilitre d'anti-PV deux. Pour préparer une combinaison anti-PV un plus PV deux, répétez cette opération pour chaque combinaison par paire possible et préparez également une solution contenant les trois types d'anticorps en mélangeant 1,2 millilitre de chaque antisérum.

Une fois les quatre mélanges préparés, ajouter 720 microlitres de SFC à chaque solution d'anticorps. Cela aidera à réduire l'agglutination non spécifique des particules de gélatine par les anticorps pendant le dosage. Les pools d'anticorps peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation dans le test d'agglutination.

Dans ce test, nous utilisons des particules de gélatine lyophilisées qui ont été recouvertes des domaines extracellulaires du récepteur humain du poliovirus et d'IgG avec deux domaines FC de souris. Veillez à utiliser un seul lot de particules et non plusieurs lots dans une même expérience afin d'assurer la cohérence de l'image d'agglutination ; reconstituez les particules avec 1,5 millilitre de tampon de reconstitution par flacon. Tapez doucement pour bien mélanger.

Les particules reconstituées peuvent être conservées à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à deux semaines. Commencez par concevoir votre expérience dans une plaque microtitration de 96 puits. Pour chaque échantillon, le puits numéro un contiendra uniquement le virus.

Les puits numéros deux à cinq contiendront le virus ainsi que l'une des quatre solutions d'anticorps mélangés. Veillez à réserver un puits pour un témoin négatif contenant uniquement le milieu, sans virus ni anticorps. Une fois la plaque préparée, ajoutez 12 microlitres de la solution d'anticorps appropriée dans chaque puits des lignes deux à cinq et 12 microlitres de milieu de croissance.

Milieu au virus seul, puits de la rangée un et au puits de contrôle négatif de la rangée six. Ensuite, ajouter 12 microlitres d'échantillon de virus dans les cinq premières rangées et 12 microlitres de milieu de croissance au puits de contrôle négatif de la rangée six. Une fois les anticorps et le virus ensemencés, resus, suspendre les particules de gélatine reconstituées en les tapotant doucement et ajouter immédiatement 25 microlitres de particules par puits à tous les puits.

Il est important de ne pas laisser les particules se déposer avant de les transférer dans la plaque afin d'obtenir des quantités équivalentes de particules dans chaque puits. Placer la plaque d'essai sur un agitateur de plaque et mélanger pendant 30 secondes. Ensuite, poser la plaque sur une feuille de papier blanc et incuber la plaque à température ambiante pendant deux heures afin de permettre l'agglutination.

Il est important de ne pas déplacer la plaque à aucun moment pendant ou après l'incubation, car l'agglutination formée est instable. Une fois la réaction terminée, prendre plusieurs photos de la plaque afin que la qualité de l'agglutination dans chaque puits puisse être appréciée. Dans les puits où l'agglutination n'a pas eu lieu, comme illustré ici à gauche, les particules de gélatine colorées précipitent au fond du puits, tandis que dans les puits où l'agglutination s'est produite, elles restent en suspension.

En raison de l'interaction entre le virus et les particules de gélatine revêtues d'IgG deux A, un motif coloré diffus est visible, comme indiqué au centre. Dans cette expérience, nous avons testé la capacité des solutions de virus, PV un, deux et trois, à induire une agglutination en présence de l'anticorps. Comme indiqué ici, en l'absence de virus ou d'anticorps, aucune agglutination ne se produit et les particules de gélatine précipitent ; en revanche, dans le puits contenant le virus mais aucun anticorps.

L'agglutination s'est produite en raison de l'interaction du virus. Avec les particules de gélatine recouvertes de PVR IgG dans les puits expérimentaux, l'agglutination des virus est empêchée dans tout puits contenant des anticorps qui neutralisent spécifiquement ce virus. Par exemple, l'agglutination du poliovirus de type un est empêchée dans les puits contenant des anticorps anti-PV un, mais pas dans les puits contenant uniquement des anticorps anti-PV deux et anti-PV trois.

Il en va de même pour les types deux et trois du poliovirus. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en aussi peu que trois heures si elle est effectuée correctement.