Laser Ablation de l'pronéphros Zebrafish d'étude rénale régénération épithéliale

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une célébration ciblée des cellules rénales dans le rein embryonnaire du poisson zèbre, le pronephros, afin d'étudier la régénération épithéliale rénale suite à une lésion rénale aiguë. Ceci est réalisé en injectant d'abord par microinjection des embryons de poisson zèbre avec un conjugué fluorescent de dextrane. Lors d'une incubation nocturne, les conjugués sont spécifiquement absorbés par les cellules des tubules proximaux du néphron.

Le lendemain, les cellules sont examinées en épifluorescence et des cellules sélectionnées sont ablatées à l’aide d’un système laser pulsé. Ultérieurement, les changements morphologiques et moléculaires sont évalués par histologie, hybridation in situ sur montages entiers et immunohistochimie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l’induction de lésions rénales aiguës à l’aide de l’antibiotique néphrotoxique gentamicine, est que ces traitements provoquent des dommages catastrophiques et sont létaux, empêchant ainsi l’analyse des événements de régénération rénale dans le temps.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine rénal, comme l'identification des événements de signalisation moléculaire qui se produisent pendant la régénération épithéliale. Nous avons eu l'idée de cette technique lorsque nous avons souhaité développer une analyse détaillée de la régénération épithéliale rénale dans des boîtes de Pétri. Collectez les embryons de zebrafish fécondés dans une solution E trois modifiée sans bleu de méthylène.

Élever les embryons fécondés à 28,5 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent un âge compris entre 48 et 55 heures post-fécondation, moment auquel le système rénal de l'embryon commence à fonctionner. Avant de commencer les injections, préparer un peigne d'injection pour embryons à l'aide d'un moule présentant des encoches triangulaires destinées à maintenir les embryons. Ensuite, préparer des microcannules standards pour injection et une solution d'injection permettant de marquer le tube contourné proximal. Commencer l'expérience en préparant les embryons.

Tout d'abord, retirez la chorioine des œufs non éclos à l’aide de fines pinces. Ensuite, rincez les débris de chorioine, rincez la boîte de Pétri et remplissez à nouveau la boîte avec 30 millilitres de solution E3 modifiée. Deuxièmement, anesthésiez les larves avec cinq millilitres de trica.

Vérifiez que les larves sont complètement anesthésiées en testant leur réaction au toucher. Si elles ne sont pas entièrement anesthésiées, elles tressailliront pendant l'injection. Troisièmement, à l’aide d’une pipette plastique de transfert, placez les larves dans le moule.

Placer les animaux de manière à ce que leurs têtes se trouvent dans la partie la plus profonde de la dépression et leurs trompes le long du côté du puits. Procéder ensuite à des micro-injections intramusculaires en chargeant une aiguille préparée avec deux à trois microlitres de dextran fluorescein, positionner l’aiguille et injecter environ un nanolitre de solution dans la trompe de chaque animal. Les conjugués de dextran sont facilement endocytés par le tubule contourné proximal du néphron, permettant ainsi un marquage préférentiel de cette population de cellules épithéliales.

Viser la partie supérieure du somite et éviter l'extension du sac vitellin, sinon les tubules du néphron seront endommagés, comme chez cet animal incorrectement injecté. Une fois les larves injectées, transférez-les dans une boîte de Pétri propre et rincez-les trois fois avec du milieu E3 frais pour éliminer toute trace de trica. Recouvrez ensuite le couvercle de papier aluminium et incubez les animaux toute la nuit à 28 degrés Celsius.

Avant de commencer cette procédure, préparez le milieu d'immobilisation et conservez quelques aliquotes à température ambiante pour une utilisation immédiate, tandis que les aliquotes restantes doivent être conservées à quatre degrés Celsius pour un stockage à long terme. Commencez par anesthésier les larves de poisson zèbre avec cinq millilitres de trica dans 30 millilitres de E3. Comme précédemment, assurez-vous que les poissons ne réagissent pas à une stimulation tactile.

Examinez maintenant les animaux injectés en fluorescence afin de sélectionner les larves dont les tubules proximaux sont facilement visibles. Transférez jusqu'à 12 larves dans une nouvelle boîte contenant la même concentration de trica, sous un microscope fluorescent équipé d'un filtre fitzy, d'un éclairage en champ clair et d'un laser perform. L'ablation commence par le transfert et l'anesthésie des larves dans une boîte contenant le milieu d'immobilisation.

Et attendez deux minutes, puis transférez la lave sur une lame creuse en verre contenant une goutte de milieu d'immobilisation. Positionnez délicatement l'animal en position dorsale supérieure à l'aide d'une sonde fine et focalisez-vous sur le côté dorsal. Utilisez maintenant un système laser microponctuel pulsé étalonné pour ablater l'un des néphrons, en laissant l'autre intact comme témoin.

Vous observerez une dispersion de la fluorescence lorsque les cellules épithéliales rénales seront ablatées. Ensuite, transférez délicatement l'animal dans une cavité d'une boîte de culture 12 cavités et rincez-le trois fois dans le milieu E3 pour éliminer la méthylcellulose. Poursuivez l'ablation des néphrons jusqu'à ce que la première boîte de culture 12 cavités soit remplie.

Ensuite, anesthésiez 12 autres animaux et répétez le processus. Dextra Fitzy a été injecté pour marquer préférentiellement le tubule proximal. Trois jours après la fécondation, le néphron de chaque animal a été ablaté au laser.

Un jour après l'ablation. La régénération n'est pas apparente quatre jours après l'ablation, mais la régénération s'est produite après l'ablation cellulaire *in situ* deux. L'hybridation a été utilisée pour analyser les changements dans des échantillons fixés à des points temporels uniques.

Cet embryon n'a pas été soumis à une ablation. En revanche, cet embryon présentait une grande portion de l'épithélium tubulaire ablatée, et cet embryon avait un court segment de l'épithélium tubulaire ablaté. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'hybridation in situ sur montage complet peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'identification des modifications de l'expression génique durant le processus de régénération du néphron.

N'oubliez pas que le travail avec des produits chimiques peut être extrêmement dangereux. Il est recommandé de prendre des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle comme une blouse de laboratoire et des gants, pendant cette procédure.