Laser Ablation de l'pronéphros Zebrafish d'étude rénale régénération épithéliale

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une célébration ciblée des cellules rénales dans le rein embryonnaire du poisson zèbre, le pro nephros, dans le but d’étudier la régénération épithéliale rénale après une lésion rénale aiguë. Ceci est accompli en injectant d’abord des embryons de poisson-zèbre avec un conjugué fluorescent dextran. Au cours d’une incubation d’une nuit, les conjugués sont absorbés de manière sélective par les cellules tubulaires proximales néphrons.

Le lendemain, les cellules sont examinées sous épifluorescence et les cellules sélectionnées sont ablatées à l’aide d’un système laser pulsé. Plus tard, les changements morphologiques et moléculaires sont évalués à l’aide de l’histologie, de l’hybridation de l’ensemble du C deux et de l’immunohistochimie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’insuffisance rénale aiguë utilisant l’antibiotique néphrotoxique gentamicine, est que ces traitements déclenchent des dommages catastrophiques et sont mortels, empêchant l’analyse des événements de régénération rénale au fil du temps.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine rénal, telles que l’identification des événements de signalisation moléculaire qui se produisent lors de la régénération épithéliale. Nous avons d’abord eu l’idée de cette technique lorsque nous avons voulu développer une analyse détaillée de la régénération épithéliale rénale dans les boîtes de Pétri. Recueillir des embryons de poisson-zèbre fécondés dans une solution modifiée de E three sans bleu de méthylène.

Élevez les embryons fécondés à 28,5 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient entre 48 et 55 heures Après la fécondation, lorsque le système rénal de l’embryon a commencé à fonctionner avant de commencer les injections, préparez un arbre d’injection aros à l’aide d’un moule avec des dépressions triangulaires pour maintenir les embryons. Ensuite, préparez des aiguilles de micro-injection standard et une solution d’injection pour marquer le tubule proximal. Commencez l’expérience en préparant les embryons.

Tout d’abord, retirez le Corian de tous les œufs non éclos à l’aide d’une pince fine. Rincez ensuite les débris de Corian, les débris de la boîte de Pétri et remplissez le plat avec 30 millilitres de solution E 3 modifiée. Deuxièmement, anesthésez les larves avec cinq millilitres de trica.

Assurez-vous que les larves sont complètement anesthésiées en vérifiant la réponse du toucher. S’ils ne sont pas complètement anesthésiés, ils se contracteraient pendant l’injection. Troisièmement, à l’aide d’une pipette de transfert en plastique, mettez les larves dans le moule.

Positionnez les animaux avec la tête dans la partie la plus profonde de la dépression et leurs troncs le long du côté du puits. Procédez maintenant aux micro-injections intramusculaires en chargeant une aiguille préparée avec deux à trois microlitres de fluorescence de dextran, placez l’aiguille et injectez environ un nanolitre de solution dans un tronc afin d’éliminer les acariens de chaque animal. Les conjugués de dextran sont facilement endocytosés par le tubule proximal du néphron, ce qui permet un marquage préférentiel de cette population de cellules épithéliales.

Visez la partie supérieure de l’acarien et évitez l’extension du sac vitellin, sinon les tubules du néphron finiront par être perturbés, comme chez cet animal mal injecté. Une fois les larves injectées, transférez-les dans une boîte de Pétri propre et rincez-les trois fois avec un milieu frais E trois pour éliminer toute trace de trica. Maintenant, couvrez le couvercle avec du papier d’aluminium et incubez les animaux toute la nuit à 28 degrés Celsius.

Avant de commencer cette procédure, préparez le milieu de mobilisation et conservez quelques aliquotes de celui-ci pour une utilisation immédiate à température ambiante et maintenez les aliquotes restantes à quatre degrés Celsius pour un stockage à long terme. Commencez par anesthésier les larves de poisson-zèbre avec cinq millilitres de trica dans 30 millilitres de E trois. Comme précédemment, assurez-vous que les poissons ne réagissent pas à la sensation tactile.

Examinez maintenant les animaux injectés sous fluorescence pour sélectionner des larves avec des tubules proximaux facilement visualisables. Transférez jusqu’à 12 larves dans une nouvelle boîte contenant la même concentration de trica à un microscope fluorescent composé équipé d’un filtre ajusté, d’un éclairage en fond clair et d’un laser. L’ablation commence par le transfert et l’anesthésie de la lave dans une boîte contenant un milieu d’immobilisation.

Et attendez deux minutes, puis transférez la lave sur une lame de dépression en verre contenant une goutte de milieu d’immobilisation. Positionnez doucement la face dorsale de l’animal vers le haut à l’aide d’une sonde fine et concentrez-vous sur la face dorsale. Maintenant, à l’aide d’un système laser à micro-points pulsé calibré, l’un des néphrons laisse l’autre intact comme contrôle.

Vous verrez la dispersion de la fluorescence lorsque les cellules épithéliales rénales sont ablatées. Ensuite, transférez doucement l’animal dans un puits d’un plat du monde et rincez-le trois fois dans un milieu E trois pour éliminer la méthylcellulose. Continuez à ablater les néphrons jusqu’à ce que le premier plat des 12 mondes soit rempli.

Ensuite, anesthésez 12 autres animaux et répétez le processus. Dextra Fitzy a été injecté pour marquer préférentiellement le tubule proximal. Trois jours après la fécondation, le néphron de chaque animal a été ablaté au laser.

Un jour après l’ablation. La régénération n’est pas apparente quatre jours après l’ablation, mais une régénération s’est produite après l’ablation cellulaire in situ deux. L’hybridation a été utilisée pour analyser les changements dans les échantillons fixes à des points temporels uniques.

Cet embryon n’a pas été soumis à l’ablation. En revanche, cet embryon avait une grande partie de l’épithélium tubulaire ablaté, et cet embryon avait un court intervalle d’épithélium tubulaire ablationné. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’hybridation in situ peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identité des changements d’expression génique au cours de la régénération du néphron.

N’oubliez pas que travailler avec des produits chimiques peut être extrêmement dangereux. Des précautions, telles que le port d’un équipement de protection individuelle comme une blouse de laboratoire et des gants, sont recommandées pendant cette procédure.