Name: Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a técnica de ablação a laser do pronephros em embriões de zebrafish para estudar a regeneração epitelial renal após lesão renal aguda. Este método permite análise em alta resolução dos processos celulares e moleculares.

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Agradecemos a membros do laboratório Wingert para discussões úteis do AKI biologia e técnicas de peixe-zebra, e Diep C. para compartilhar a sua receita de metilcelulose. Os autores também gostaria de expressar nossa gratidão aos membros do pessoal da Notre Dame Centro de Pesquisa Zebrafish para prestação de cuidados de manejo em curso excelente para a nossa colônia zebrafish. Financiamento da concessão da subvenção NIH-NIDDK DK083512, generosa e laboratoriais start-up de financiamento da Universidade de Notre Dame, apoiou este trabalho.

1. Procedimento de microinjeção para rotular o zebrafish pronephros epitélio do túbulo proximal Para este procedimento, usamos um sistema microinjeção (Harvard aparatos, PLI90), com ar pressurizado fornecido por um compressor de ar (Jun-Air, modelo 04/06), e aparelhos micromanipulador (Narishege partes MN151, IP3 e GJI) que são montada em um posto de estereomicroscópio (Nikon, SMZ-Zoom 645) como as instruções do fabricante por. Conjugados dextrano são prontamente endocytosed pelo túbulo proximal do néfron, permitindo rotulagem preferencial desta população de células epiteliais 9. <ol><li> Exposição ao azul de metileno pode acentuar a autofluorescência do saco vitelino e torna a visualização do néfron túbulos mais difícil. </li><li> Levantar os embriões fertilizados em 28,5 ° C para um ponto no tempo de desenvolvimento entre 48-55 horas após a fertilização (hpf). Esta é a fase ideal para realizar microinjeções larvas por causa da facilidade com que microinjeção intramuscular pode ser executada, e porque a função renal começa neste momento. </li><li> Remover o córion de qualquer zebrafish unhatched usando um par de fórceps bem. Enxágüe os restos do córion placa de Petri e encha o prato com 30 mL de solução modificada E3. </li><li> Prepare uma bandeja de injeção para os embriões. Nosso molde de injeção preferido é feito de 1,5% agarose/E3, em que depressões triangulares são formados de tal modo que o embrião pode ser posicionado dentro injectável. Para fazer o molde de injeção, nós flutuamos um molde de plástico com saliências em forma de cunha (descrito em detalhes anteriormente 11) em uma placa de Petri cheia com uma base de agarose 1,5%. </li><li> Prepare agulhas microinjeção de vidro puxando tubos capilares com um extrator de agulhas, como descrito no Livro Zebrafish 10. Em breve, puxe a tubos capilares de vidro, em seguida, utilize uma pinça de metal fina para cortar a ponta da agulha microinjeção de fazer uma ponta com uma ponta afiada durante a visualização da ponta da agulha sob um estereomicroscópio. Armazenar as agulhas corte coberto por uma placa de Petri e posicionados em massa de modelar para proteger a borda de corte e evitar o acúmulo de poeira. </li><li> Prepare a solução de injeção para rotular o túbulo proximal. Dissolver 40 kD dextran-fluoresceína conjugada (Invitrogen, D1845), na concentração de 1 mg / mL em água destilada. </li><li> Para anestesiar o peixe, adicionar 5 mL de 0,2% tricaina pH 7.0 para a placa de petri contendo as larvas do peixe em 30 mL de E3. Os peixes são anestesiados quando eles já não apresentam a resposta ao toque. É vital que os peixes são completamente anestesiados ou eles vão se contorcer em cima tentando injetá-las. </li><li> Transferir os peixes anestesiados com uma bandeja de molde de injeção usando uma pipeta de transferência de plástico. A posição do animal com a cabeça na parte mais profunda da depressão triangular bem, e em seu lado de tal forma que o tronco está apoiado ao longo do lado do bem angulado. </li><li> Executar microinjeção intramuscular. Carregar uma agulha de corte com 2-3 mL de dextran fluoresceína, e injetar o animal em um somito tronco com aproximadamente 1 nL de solução. Apontar para a parte superior do somito, e evitar a gema de extensão sac. Isso garante que os túbulos de néfrons não são mecanicamente interrompidos pelo processo de microinjeção. </li><li> Transferência de zebrafish injetado para uma placa de Petri limpa e adicione modificada solução E3. Enxágüe os animais 3 vezes com E3 fresca para remover todos os vestígios de tricaina. Cobrir a tampa da placa de Petri com papel de alumínio para fornecer a luz de proteção para o dextran, e devolver os animais aos 28 ° C incubadora durante a noite. </li></ol> 2. Ablação a laser alvo de células do túbulo proximal Para este procedimento, usamos um estereomicroscópio com epifluorescência para marcar animais com dextran marcado com fluoresceína brilhantemente túbulos proximal e selecionar esses para ablação laser. Então, nós usamos um sistema laser pulsado Micropoint (Instrumentos Fotônicos, Inc), que foi acoplada a um microscópio composto (Nikon Eclipse 80i com anexo de epifluorescência), e calibrado para uso como instruções do fabricante, para realizar a ablação néfron celular. Tivemos o maior sucesso na ablação de células usando um filtro que permite FITC o pesquisador para ver as regiões dos túbulos fluorescente sob iluminação de campo claro. Antes de este procedimento, prepare media imobilização para a ablação por dissolução de metilcelulose 1,5% em 0,02% tricaine/E3. Alíquotas loja de metilcelulose para uso imediato em temperatura ambiente, ou a 4 ° C para armazenamento de longo prazo. <ol><li> Anestesiar o peixe-zebra hpf 72 pela adição de 5 mL de 7,0 a 0,2% pH tricaina para a placa de petri contendo as larvas do peixe em 30 mL de E3. Os peixes são anestesiados quando eles já não apresentam a resposta ao toque. É vital que os peixes são completamente anestesiados ou eles vão se contorcer em cima tentar executar a ablação laser. </li> Examine os animais injetado sob a configuração apropriada fluorescentes e selecionar animais em que você pode facilmente visualizar os túbulos proximal. <li> Transferência de embriões selecionados para um prato separado contendo tricaina. Os animais podem ser anestesiados por até 30 minutos antes de realizar a ablação de células. Se você pontuação&gt; 15 animais, o retorno destes para um prato separado contendo E3 modificada fresco, enquanto se aguarda a ablação como cada célula ablação leva alguns minutos. </li><li> Para realizar a ablação, a transferência de um peixe-zebra anestesiados para uma pequena placa de Petri contendo 1,5% tricaina methylcellulose/0.02% por 2 minutos para lavar o embrião na mídia imobilização. </li><li> Em seguida, transferir o embrião para uma lâmina de vidro contendo depressão uma queda de 1,5% methylcellulose/0.02% tricaina. Suavemente a posição do animal com uma sonda fina de tal forma que seu lado ventral enfrenta o slide e no lado dorsal é voltada para cima. </li><li> Coloque o slide no palco microscópio compund, e foco no lado dorsal do animal. Realização da ablação das células do néfron em foco, pressionando o pedal. Você vai ver a dispersão da fluorescência como as células epiteliais são ablated renal (Figura 1A). </li><li> Suavemente transferência do animal ablated a um poço em um 12 bem-prato para cultura subseqüente. Lavar a E3 2-3 vezes para lavar a metilcelulose. </li><li> Após a injeção, elevar o animal ao ponto no tempo desejado e realizar a análise desejada conforme estabelecido técnicas histológicas e molecular de embriões zebrafish jovens (Figura 2). </li></ol> 3. Resultados representativos: Os dados que são mostrados na Figura 1 indicam a timecourse ablação. Após a injeção intramuscular com dextran-conjugados, o túbulo proximal é preferencialmente rotulados. Injeção de Dextran-FITC foi usado para rotular o rim para ablação a laser, e os animais foram ablated reinjetado com dextran-rodamina menos uma ablação timepoint adicionais a seguir para recriar a população túbulo proximal. Técnicas de análise de expressão como a hibridização in situ pode ser usado para analisar as mudanças em amostras fixadas em intervalo de tempo após a ablação única célula, como mostrado na Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: procedimento de ablação a laser é seguido de rápida regeneração do epitélio tubular (AC) Timecourse de alterações celulares durante e após a ablação a laser de túbulos larva zebrafish proximal no momento da ablação (dia 3, o painel A), ou um ou três. dia pós-ablação (dia 4, painel B, dia 7, painel C). (Top) esquemas mostrar a posição do néfron, com dextran-FITC (verde) e dextran-rodamina (vermelho), e (em baixo) imagens ao vivo de controle e laser-ablated (LA) néfrons. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2:. Análise da expressão gênica após a ablação a laser Após ablação a laser no dia 3, os embriões foram fixados e processados ​​por montar toda a hibridização in situ para detectar transcrições para slc20a1a, que marcam o segmento de túbulo convoluto proximal do néfron. (A) Um embrião de controle que não foi submetido a ablação a laser, (B) um embrião em que uma grande extensão do epitélio dos túbulos foi ablated, e (C) um embrião em que um intervalo curto de epitélio dos túbulos foi ablated. Linha preta indica a extensão do túbulo proximal em A para fornecer referência, linhas azuis indicam a extensão da ablação a laser em painéis BC, e * indica que o controle (não-ablated) néfron contralateral em painéis BC.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O peixe-zebra é um organismo modelo amplamente utilizado ao longo de muitos aspectos da ciência, cujas aplicações estão crescendo 6. O emprego do sistema de modelo peixe-zebra no estudo de doenças renais como AKI tem levado a importantes observações e continuará a ser um bom modelo para estudar lesão renal 7,8. Com um genoma que foi seqüenciado e muitos protocolos molecular no lugar, tornou-se cada vez mais fácil realizar pesquisas zebrafish sofisticado que utiliza modelos transgênicos, knockdown do gene e estudos misexpression. O peixe-zebra tem um ciclo de vida curto, com tamanhos geração grande e bem definida estágios de desenvolvimento. Além disso, os estágios embrionário e larval do peixe-zebra são praticamente transparente, fazendo estudos de imagem possível sem dissecção do organismo. Ao longo da fase embrionária e larval, o peixe-zebra tem um rim pronephric composto de duas néfrons, que permanecem visíveis durante estes timepoints desenvolvimento. Néfrons zebrafish pronephric são análogas em estrutura e função com os seus homólogos de mamíferos, tornando-se um bom modelo para estudos de insuficiência renal aguda 4,5. O rim é crucial para a sobrevivência dos seres humanos e outros vertebrados, servindo como o órgão que limpa o corpo de resíduos metabólicos líquido. Esta função cleansing repousa sobre a capacidade dos néfrons dos rins de filtrar o sangue, e em seguida, modificar o filtrado para coletar resíduos nitrogenados para a secreção e, simultaneamente, manter o equilíbrio de líquidos e eletrólitos. Néfrons são compostos de um filtro de sangue, túbulos epiteliais, e drenam para um duto. A integridade estrutural e funcional de todas as três partes é essencial para a função néfron. Vários insultos ao rim, incluindo a exposição à nefrotoxinas, isquemia, ou obstrução das vias do fluxo urinário podem resultar em AKI 1. A patologia da AKI é freqüentemente associada com 1,2 necrose aguda tubular. Estudos clínicos têm demonstrado que se seguiu insuficiência renal tem uma taxa de mortalidade que pode variar 7-80%, dependendo da causa e do contexto da falha renal. Entretanto, o diagnóstico rápido e reversão da causa subjacente da AKI é cada vez mais associados com a recuperação através da regeneração dos túbulos do néfron necrótico. Estudos de mapeamento recente destino têm mostrado que a população de células grandes que preenche os túbulos de néfrons danificadas são células epiteliais que se originam de adjacentes, áreas uninjured 12. Essas descobertas não eliminaram a possibilidade de que renal tronco / progenitoras células podem participar do processo, e relatórios independentes têm sugerido que células da medula óssea derivados podem contribuir para a regeneração renal 13. É claro que as investigações continuaram são necessários para melhor resolver as fontes celulares de regeneração do epitélio renal. Tanto a regeneração néfron e desenvolvimento compartilhar o fenômeno da muda em estado de celular entre os fenótipos mesenquimal e epitelial. Durante o desenvolvimento do néfron, as células progenitoras mesenquimais se diferenciam em um fenótipo estacionário, inerentes a uma membrana basal para formar o epitélio tubular 3. O fenômeno migratório especularam de células epiteliais após insuficiência renal aguda necessita de uma desdiferenciação em um fenótipo mesenquimal. Curiosamente, estudos recentes sugerem que as células mesenquimais nos rins danificados apresentam um perfil de expressão semelhante a uma célula mesenquimal durante o desenvolvimento 14. Vários relatórios têm detectado mudanças nas moléculas de adesão celular, proteínas, citocinas e quimiocinas. Após a mesenquimais proposta para a transição do epitélio, as células remontar sobre uma membrana basal tubular e reiniciar atividades epiteliais. Determinar os genes importantes neste processo continua a ser um tópico de pesquisa para o nosso laboratório e outros. Grande parte do trabalho para elucidar os fatores-chave neste processo a ser feito, mas um progresso significativo no campo tem sido anunciado pelo estudo dos efeitos da gentamicina. AKI e insuficiência renal causada pela gentamicina é relevante considerando a prevalência de compostos nefrotóxicos usados ​​na medicina 15. Usado como um tratamento para bactérias gram-negativas infecções bacterianas, a administração de aminoglicosídeos leva a lesão aguda em 10-25% dos casos. A droga causa uma infinidade de efeitos negativos no celular, em conjunto, resultando em apoptose ou necrose em muitas células tubulares. Estudos descobriram que a droga se ligam preferencialmente a um complexo formado por megalina cubulin e que está envolvido na endocitose. Estas moléculas são encontradas em abundância nas células epiteliais do túbulo proximal, embora eles não se limitam a expressão nestas células. Através de sinalização celular, resultando na indução do estresse oxidativo, liberação de vasoconstritores, a depleção de ATP celular, hipóxia, a inibição de fosfolipases, antibióticos gentamicina e similares causaapoptose e necrose em células epiteliais. Além disso, os antibióticos desencadear contração mesangial no sangue néfron filtro (glomérulo), resultando em uma queda na taxa de filtração glomerular e negativamente alterando a capacidade dos rins de filtrar o sangue. A produção de espécies reativas de oxigênio, moléculas imunoestimulador, e ativação de fosfolipases têm efeitos difusos no néfron, criando uma patologia catastrófico que leva à insuficiência renal aguda. Enquanto gentamicina e estudos similares aos antibióticos têm sido e continuarão a ser ferramentas importantes para a pesquisa de regeneração renal, falta-lhes uma precisão que pode ser útil no tratamento de questões certas. Nosso sistema de usar o peixe-zebra em conjunto com um método de ablação por laser descrito neste protocolo responde à necessidade de tal ferramenta de pesquisa tão precisa. Ablação a laser permite que os pesquisadores para induzir a destruição das células em áreas focais do túbulo renal, que vão desde um pequeno (2-3) e grandes (&gt; 50-100) populações, com uma precisão inigualável. Neste protocolo, utilizamos um método previamente desenvolvido de exposição ao dextran-conjugados preferencialmente rótulo populações túbulo proximal epiteliais. Alternativamente, linhagens transgênicas zebrafish que expressam a proteína verde fluorescente em uma ou mais regiões do túbulo poderia ser usado. Por exemplo, cadherin17: eGFP zebrafish transgênicos apresentam fluorescência forte em regiões do túbulo distal (embora fraco em populações proximal), e pode ser valiosa para estudos de regeneração em segmentos túbulo outros 16. A visibilidade do néfron permitirá lapso de tempo de gravação de vídeo de alterações celulares ao longo do tempo. Quando combinada com estudos de expressão gênica, como montar toda a hibridização in situ ou imuno-histoquímica, os pesquisadores podem detectar alterações moleculares no néfron ao longo do tempo. Tomados em conjunto, essas estratégias podem começar a formular uma compreensão mais dinâmica dos eventos que transpire quando as células epiteliais renais são destruídas. A ressalva importante de nosso modelo de ablação a laser é que ele pode recapitular aspectos parciais das condições fisiológicas que acontecem no AKI humana. A morte celular induzida por dano físico instantânea é diferente da cascata de eventos que leva à necrose das células, e como tal os fatores humoral nestes microambientes diferentes não podem ser idênticas. Além disso, existe evidência de apoptose induzida durante a lesão renal, e não se sabe se tais conseqüências transpire insulto a seguir com um laser. No entanto, assim como a cultura de células é uma ferramenta que as melhores respostas a algumas perguntas que necessitam de um ambiente altamente controlado, ablação a laser servirá como altamente controlada in vivo modelo de LRA. Como tal, os insights obtida a partir renal estudos ablação epitelial em zebrafish provavelmente vai promover a descoberta de conhecimentos fundamentais que podem ser aplicadas a investigações de outras lesões renais e potencialmente usada para criar um melhor diagnóstico em seres humanos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Pratos embrião </td><td> Falcão </td><td> 35-1005 </td></tr><tr><td> Pinça de dissecção </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Agulhas de injeção </td><td> Sutter Intruments </td><td> BF100-50-10 </td></tr><tr><td> Ultrapura agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 40 kilodalton (kD) Dextran-fluoresceína </td><td> Invitrogen </td><td> D1845 </td></tr><tr><td> Pipeta de transferência de plástico </td><td> Samco Científica, Fisher </td><td> 204, 13-711-23 </td></tr><tr><td> Tricaina </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Metilcelulose </td><td> Sigma </td><td> M0262 </td></tr><tr><td> Slides depressão </td><td> Pescador </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> 12 bem-prato </td><td> Corning </td><td> 3512 </td></tr></tbody></table>

ablação a laser da pronephros zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Lesão renal aguda (IRA) é caracterizada por altas taxas de mortalidade da deterioração da função renal por um período de horas ou dias que culmina com insuficiência renal 1. AKI pode ser causada por uma série de fatores incluindo a toxicidade isquemia, drogas de base, ou lesão obstrutiva 1. Isso resulta em uma incapacidade de manter a homeostase de fluidos e eletrólitos. Enquanto AKI tem sido observada há décadas, eficazes terapias clínicas ainda precisam ser desenvolvidos. Curiosamente, alguns pacientes com LRA recuperar funções renal ao longo do tempo, um fenômeno misterioso que tem sido caracterizada apenas rudimentally 1,2. Pesquisa utilizando modelos de mamíferos de AKI tem mostrado que os rins isquêmicos ou feridos nefrotoxina-experiência da morte de células epiteliais no néfron túbulos 1,2, as unidades funcionais do rim, que são compostos de uma série de regiões especializadas (segmentos) de tipos de células epiteliais 3 . Dentro de néfrons, a morte das células epiteliais é maior nas células do túbulo proximal. Há evidências que sugerem que a destruição das células é seguido por desdiferenciação, proliferação e migração de células epiteliais vizinhas, o que pode regenerar o néfron inteiramente 1,2. No entanto, há muitas perguntas não respondidas sobre os mecanismos de regeneração epitelial renal, que vão desde os sinais que modulam a esses eventos para razões para a grande variação das habilidades entre os seres humanos para regenerar rins feridos. O peixe-zebra larval fornece um excelente modelo para estudo da regeneração do rim epiteliais como seu rim pronephric é composto de néfrons, que são conservados com vertebrados superiores, incluindo mamíferos 4,5. Os néfrons de larvas de peixe-zebra pode ser visualizado com as técnicas de fluorescência por causa da relativa transparência do zebrafish jovens 6. Isso proporciona uma oportunidade única de célula de imagem molecular e mudanças em tempo real, em contraste com os modelos de mamíferos, onde néfrons são inacessíveis porque os rins são sistemas estruturalmente complexos internalizados no animal. Estudos recentes têm empregado a gentamicina aminoglicosídeo como um agente tóxico causador de estudo do AKI e insuficiência renal subseqüente: gentamicina e outros antibióticos foram mostrados para causar lesão renal aguda em seres humanos, e os pesquisadores formularam métodos para usar este agente para provocar danos nos rins em zebrafish 7 , 8. No entanto, os efeitos de toxicidade aminoglicosídeo em larvas do peixe são catastróficas e letais, que apresenta uma dificuldade quando se estuda a regeneração epitelial e função ao longo do tempo. Nosso método apresenta a utilização da ablação de células alvo como uma nova ferramenta para o estudo de lesões epiteliais em zebrafish. Ablação a laser dá aos pesquisadores a capacidade de induzir a morte celular em uma população limitada de células. Áreas que variam de células podem ser direcionados com base na localização morfológica, função ou até mesmo a expressão de um fenótipo celular particular. Assim, a ablação a laser vai aumentar a especificidade do que os pesquisadores podem estudar, e pode ser uma abordagem nova e poderosa para lançar luz sobre os mecanismos de regeneração do epitélio renal. Este protocolo pode ser amplamente aplicada a populações de células-alvo em outros órgãos no embrião do zebrafish para estudar lesão e regeneração em qualquer número de contextos de interesse.

Lesão renal aguda (IRA) em seres humanos é um problema clínico comum causado por danos às células epiteliais que compõem néfrons nos rins, e AKI está associada com altas taxas de mortalidade de 50-70% 1. Após a destruição das células epiteliais, néfrons têm uma capacidade limitada de regeneração, embora os mecanismos e as limitações que orientam este fenômeno ainda são pouco compreendidas. Neste artigo de vídeo, descrevemos nossa técnica de ablação a laser alvo de células renais dos néfrons nos rins embrião zebrafish, ou pronephros. Nosso novo método pode ser utilizado para complementar a nefrotoxicidade induzida por modelos de LRA e obter uma compreensão de alta resolução da célula e alterações moleculares que estão associados com a regeneração epitelial no néfron rim.

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

A lesão renal aguda (LRA) é caracterizada por altas taxas de mortalidade decorrentes da deterioração da função renal ao longo de um período de horas ou dias, que culmina em...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a marcação direcionada de células renais no rim embrionário de peixe-zebra, o pronefros, com a finalidade de estudar a regeneração epitelial renal após lesão renal aguda. Isso é realizado inicialmente por meio da microinjeção de embriões de peixe-zebra com um conjugado fluorescente de dextrana. Durante uma incubação noturna, os conjugados são absorvidos seletivamente pelas células do túbulo proximal do néfron.No dia seguinte, as células são examinadas em microscopia de fluorescência epiluminiscente e células selecionadas são ablatadas utilizando um sistema a laser pulsado. Posteriormente, alterações morfológicas e moleculares são avaliadas por meio de histologia, hibridização *in situ* em preparações inteiras e imunohistoquímica. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a lesão renal aguda induzida pelo antibiótico nefrotóxico gentamicina, é que tais tratamentos provocam danos catastróficos e são letais, impedindo a análise dos eventos de regeneração renal ao longo do tempo.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área renal, como a identificação de eventos de sinalização molecular que ocorrem durante a regeneração epitelial. Tivemos pela primeira vez a ideia desta técnica ao querer desenvolver uma análise detalhada da regeneração epitelial renal em placas de Petri. Colete embriões de peixe-zebra fertilizados em solução E três modificada sem azul de metileno.Crie embriões fertilizados e mantenha-os a 28,5 graus Celsius até que tenham entre 48 e 55 horas pós-fertilização, quando o sistema renal do embrião já tiver começado a funcionar. Antes de iniciar as injeções, prepare uma placa de injeção para embriões utilizando um molde com reentrâncias triangulares para acomodar os embriões. Em seguida, prepare agulhas padrão para microinjeção e uma solução de injeção para marcar o túbulo proximal. Inicie o experimento preparando os embriões.Primeiro, remova a corion de ovos não eclodidos usando pinça fina. Em seguida, enxágue os resíduos de corion, remova os resíduos da placa de Petri e reabasteça a placa com 30 mililitros de solução E três modificada. Segundo, anestesie as larvas com cinco mililitros de trica.Certifique-se de que as larvas estão completamente anestesiadas verificando a resposta ao toque. Se elas não estiverem totalmente anestesiadas, irão se contrair durante a injeção. Em terceiro lugar, usando uma pipeta de transferência de plástico, coloque as larvas no molde.Posicione os animais com as cabeças na parte mais profunda da depressão e os troncos ao longo do lado do poço. Prossiga então com microinjeções intramusculares, carregando uma agulha preparada com dois a três microlitros de dextrana fluorescente, posicionando a agulha e injetando aproximadamente um nanolitro de solução em um tronco de cada animal. Os conjugados de dextrana são prontamente endocitados pelo túbulo proximal do néfron, permitindo a marcação preferencial dessa população de células epiteliais.Visar a porção superior do somito e evitar a extensão do saco vitelino, caso contrário os túbulos nefrónicos acabarão danificados, como neste animal injetado incorretamente. Após a injeção das larvas, transfira-as para uma placa de Petri limpa e lave-as três vezes com meio E3 fresco para remover todos os vestígios de trica. Agora, cubra a tampa com papel alumínio e incube os animais durante a noite a 28 graus Celsius.Antes de iniciar este procedimento, prepare o meio de imobilização e mantenha algumas alíquotas dele para uso imediato em temperatura ambiente e guarde as alíquotas restantes a quatro graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Comece anestesiando as larvas de peixe-zebra com cinco mililitros de trica em 30 mililitros de E3. Assim como antes, certifique-se de que os peixes não respondam à sensação tátil.Agora, examine os animais injetados em fluorescência para selecionar larvas com túbulos proximais facilmente visualizáveis. Transfira até 12 larvas para um novo recipiente contendo a mesma concentração de trica em um microscópio fluorescente equipado com filtro fitzy, iluminação de campo claro e um laser perform. A ablação começa transferindo e anestesiando a larva para um recipiente contendo meio de imobilização.E espere dois minutos, depois transfira a larva para uma lâmina de microscopia com cavidade contendo uma gota de meio de imobilização. Posicione suavemente o animal com o lado dorsal voltado para cima usando uma sonda fina e foque no lado dorsal. Agora, utilizando um sistema a laser pulsado micro pontual calibrado, ablate um dos néfrons, deixando o outro intacto como controle.Você verá a dispersão da fluorescência à medida que as células epiteliais renais forem ablacionadas. Em seguida, transfira cuidadosamente o animal para um poço de uma placa de 12 poços e lave-o três vezes em meio E3 para remover a metilcelulose. Continue ablacionando néfrons até que a primeira placa de 12 poços esteja cheia.Em seguida, anestesie outros 12 animais e repita o processo. Dextra Fitzy foi injetado para rotular preferencialmente o túbulo proximal. Três dias após a fertilização, o néfron de cada animal foi ablatado com laser.Um dia após a ablatação. A regeneração não é aparente quatro dias após a ablatação, contudo a regeneração ocorreu após a ablatação celular in situ dois. A hibridização foi utilizada para analisar alterações em amostras fixadas em pontos de tempo únicos.Este embrião não foi submetido à ablação. Em contraste, este embrião teve um grande trecho do epitélio tubular ablatado, e este embrião teve um curto segmento do epitélio tubular ablatado. Após este procedimento, outros métodos, como hibridização in situ em preparação total, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a identidade das alterações na expressão gênica durante o processo de regeneração do néfron.Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos pode ser extremamente perigoso. Precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, por exemplo, jaleco e luvas, são recomendadas durante este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos uma técnica de microinjecting a aminoglicosídeos, gentamicina, em dois dias pós-fetilization (dpf) larvas de peixe-zebra para induzir lesão renal aguda (IRA). Nós também descrevem um método para montar toda a imunohistoquímica, plástico incorporação e secção de larvas de peixe-zebra para visualizar os danos mediados AKI.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

Transplante de células é uma técnica essencial para o estudo da regeneração de tecidos e para o desenvolvimento de terapias baseadas em células da doença. Demonstramos aqui uma técnica de microcirurgia, que permite o transplante de células geneticamente marcado diretamente no rim de peixes paulistinhas adultos.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

O rim adulto do peixe-zebra é um excelente sistema para os estudos de regeneração e de doenças renais. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve várias metodologias que podem ser implementadas para avaliar a composição de néfrons túbulo e avaliar a reabsorção renal.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

Aqui apresentamos um método confiável para estudar a regeneração renal adulta induzindo lesão renal aguda por injeção de gentamicina. Mostramos que a lesão depende da dosagem de gentamicina e da temperatura ambiente usando hibridização in situ para rotular lhx1a+ em desenvolvimento de novos néfrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento de órgãos em embriões de peixe-zebra, usando um microscópio de dissecação de fluorescência capazes de realizar seccionamento óptico e estratégias simples de reajuste para corrigir desvio focal e planar.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

Este trabalho apresenta um novo modelo in vivo de lesão renal segmentar usando peixe zebra transgênico GFP renal. O modelo permite a indução da ablação direcionada de células epiteliais renais para mostrar os mecanismos celulares de lesão e reparação de néphron.

Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

O zebrafish é um modelo importante para entender o desenvolvimento renal. Aqui, um protocolo de hibridização in situ é otimizado para detectar expressão genética em larvas de zebrafish e juvenis durante o desenvolvimento de mesonepros.

In situ Hibridização em Larvas de Zebrafish e Juvenis durante o Desenvolvimento de Mesonephros

Este protocolo descreve a metodologia para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) usando um modelo transgênico de zebrafish. A adaptação do protocolo para incorporar a modulação da via de sinalização usando compostos farmacológicos é extensivamente detalhada. Uma plataforma MATLAB para quantificar a regeneração de RPE com base na pigmentação foi desenvolvida e é apresentada e discutida.

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

Este protocolo descreve uma abordagem de ablação a laser de dois fótons realizada em larvas de peixe-zebra, que serve como modelo para estudar a regeneração óssea e os efeitos da resposta imune à ablação.

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

Aprenda a técnica de ablação a laser do pronephros em embriões de zebrafish para estudar a regeneração epitelial renal após lesão renal aguda. Este método permite análise em alta resolução dos processos celulares e moleculares.

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

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