Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux

L'objectif général de cette procédure est d'établir une nouvelle méthode de test de l'efficacité des médicaments utilisant des prélèvements chirurgicaux de tumeurs cérébrales appelée la méthode tumor X explant. Cela est réalisé en premier lieu en récupérant des prélèvements chirurgicaux frais de gliomes malins pendant l'intervention chirurgicale, destinés à des expériences précliniques. Ensuite, les échantillons sont transportés vers le centre de prélèvement tissulaire afin d'être séparés pour des diagnostics cliniques et des fins de recherche.

Ensuite, dans le laboratoire de recherche, les explants tumoraux sont disséqués en plusieurs fragments plus petits et transférés dans un milieu optimisé. Enfin, des injections intratumorales avec des candidats-médicaments sont réalisées et les explants sont incubés pendant 16 heures. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, révélant l'efficacité du traitement par coloration à l'hématine et à l'ein, ainsi que par immunohistochimie à l'aide de marqueurs spécifiques des types cellulaires.

Nous pouvons également évaluer l'efficacité des médicaments in vitro à l'aide de la cytométrie en flux et de tests de formation de neurosphères. La majorité des tests actuels d'efficacité médicamenteuse laissent un écart entre l'efficacité du médicament dans les modèles expérimentaux précliniques actuels et son efficacité chez les patients hospitalisés. En particulier, lorsque nous testons des candidats médicaments sur des cancers solides tels que les gliomes malins, nous ne pouvons pas sous-estimer les échanges de signalisation intercellulaires ainsi qu'intracellulaires.

Afin d'éviter de perturber le microenvironnement des tumeurs solides, nous avons mis au point une méthode de culture anti avec notre explant tumoral. Après le retrait des tumeurs chez les patients, les échantillons sont transférés vers ou depuis le service d'anatomie pathologique. Nous divisons les fragments tumoraux en deux morceaux. Un échantillon tumoral provenant de l'un des morceaux est utilisé pour la coupe congelée et l'incorporation en paraffine à des fins de diagnostic clinique, tandis que le reste du tissu tumoral est envoyé aux laboratoires de recherche pour être utilisé par les chercheurs.

Grâce à cette méthode, nous pouvons préserver le microenvironnement de la tumeur avec les cellules endothéliales tumorales adjacentes et les cellules immunitaires, ainsi que les cellules cérébrales normales qui entourent la tumeur ou migrent vers les cavités tumorales. Avant de traiter le tissu de glioblastome, préparez la solution liquide, le milieu et la solution d'agar. Mélangez-les selon un rapport un pour un.

Ensuite, ajoutez un millilitre dans chaque puits de plaques à six puits. Après avoir reçu du tissu frais de glioblastome multiforme, transférez-le dans une boîte de Pétri à l’aide de pinces et rincez-le soigneusement trois fois avec cinq millilitres de PBS glacé à une fois, à l’aide d’une lame chirurgicale et de pinces. Découpez des sections sériées d’environ 10 millimètres de diamètre à partir des échantillons disséqués afin de créer des blocs tumoraux, puis transférez chaque bloc dans un puits d’une plaque à six puits contenant du milieu agar, en veillant à ce qu’il soit suffisamment exposé à l’air pour rester viable.

Ensuite, à l’aide d’une seringue d’insuline d’un millilitre et d’une aiguille de 28 gauge et demi-pouce, injecter trois fois les fragments de tumeur avec du DMSO à 5 %, avec du témozolomide à 2,5 nanomolaire ou avec un nouveau candidat médicament anticancéreux, puis incuber pendant 16 heures à 37 degrés Celsius dans de l’air humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, laver les fragments trois fois avec cinq millilitres de PBS à une fois. Puis, dans des tubes de 50 millilitres, fixer les fragments avec 10 millilitres de formol à 10 % volume/volume pendant 24 heures.

Incorporez le tissu dans la paraffine et coupez des sections de quatre micromètres pour les déparaffiniser, puis les réhydrater. Placez les lames dans un porte-lame et incubez-les dans les solutions suivantes. Rincez trois fois pendant cinq minutes chacune.

De l'éthanol à 100 % trois fois pendant cinq minutes chacun. De l'éthanol à 95 % une fois pendant cinq minutes et de l'éthanol à 70 % une fois pendant cinq minutes. Enfin, rincer à l'eau courante pendant trois minutes.

Voir le protocole écrit accompagnant pour les détails concernant la récupération de l'antigène et l'inhibition de la peroxydase interne. Pour bloquer les coupes, recouvrir les tissus de 10 % de sérum de chèvre normal, transférer les lames dans une boîte humide et incuber pendant une heure à température ambiante. Laver les lames trois fois dans du PBS une fois pendant cinq minutes chacun.

Ensuite, ajoutez des anticorps primaires, tels que la caspase trois spécifique de l'humain ou le KI 67, dilués dans du PBS 1×, puis incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Rincez les lames dans du PBS 1× trois fois pendant 10 minutes chacune. Ensuite, recouvrez les tissus de deux à trois gouttes d'anticorps secondaire marqué à la HRP.

Placer les lames dans une boîte humide et incuber pendant une heure à température ambiante. Rincer avec du PBS 1× trois fois pendant cinq minutes chacun. Révéler les échantillons à l'aide d'un kit de chromogène DAB en suivant les instructions du fabricant pour la contre-coloration.

Immerger les lames dans l'hématine pendant 10 à 15 secondes. Rincer ensuite à l'eau courante pendant trois minutes. Déshydrater les échantillons en immergeant les lames dans les solutions suivantes à un réactif de montage et une lame couvre-objet.

Ensuite, utiliser un microscope à fluorescence pour imager les lames. L'image IRM pondérée en T1 avec rehaussement au gadolinium dans cette figure montre un glioblastome multiforme, ou tumeur GBM, rehaussé dans le lobe frontal droit d'un patient avant la chirurgie. L'image postopératoire a confirmé la résection partielle de la lésion après l'intervention chirurgicale.

La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine met en évidence la présence de nécrose, de cellules en pseudo palissade et de prolifération microvasculaire. Ainsi, ces tumeurs ont été diagnostiquées histopathologiquement comme des GBM afin d'investiguer si ces échantillons de tumeurs en explant pouvaient être utilisés de façon fiable. Dans le but d'un test d'efficacité médicamenteuse, nous avons évalué l'effet du témozolomide ou TMZ ; l'immunohistochimie des tissus de GBM traités au TMZ démontre une réduction importante des cellules tumorales positives pour KI 67 par rapport aux échantillons témoins.

À leur tour, les immunohistochimies réalisées avec un marqueur d'apoptose, la caspase trois, n'ont révélé aucune différence significative entre les échantillons de gliome traités au TMZ et les échantillons témoins. L'effet du traitement par la témozolomide peut être davantage caractérisé en combinant cet essai ex explant avec une culture in vitro ou avec la cytométrie en flux. Nous pouvons comparer cette méthode ex explant avec la transplantation de xénogreffe et l'essai de formation de sphéroïdes in vitro pour le criblage de nouveaux agents anticancéreux.

Une fois les tissus tumoraux obtenus en laboratoire, la procédure de cette expérience peut être réalisée en moins d'une heure. Ce nouvel essai est relativement simple à effectuer et reproductible après la dissociation des implants tumoraux traités. Nous pouvons le combiner avec des expériences in vitro.

Un avantage majeur de ce test est qu'il préserve le microenvironnement tumoral. Nous obtenons des données positives avec des explants tumoraux traités par Temodar, qui étaient cohérentes avec l'évolution des mêmes patients ayant reçu un traitement par Temodar après chirurgie. Enfin, cette méthode est applicable à d'autres cancers solides et pourrait donc avoir le potentiel d'accélérer l'identification de nouveaux agents chimiothérapeutiques pour le traitement des cancers solides.