En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

Une méthode pour l'incorporation de l'ADN plasmidique dans des cellules murines rétine dans le but d'effectuer soit du gain ou de perte d'études de la fonction

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une expérience d’électroporation in vivo sur des souris néonatales afin d’introduire de manière stable du matériel génétique dans les cellules de la rétine. Ceci est accompli par une première anesthésie, une souris nouveau-née sautée sur de la glace pendant environ cinq à 10 minutes. La deuxième étape de la procédure consiste à identifier la jonction des paupières fusionnées et à ouvrir l’œil en coupant le long de cette jonction.

Une incision est ensuite pratiquée dans l’œil pour faciliter l’insertion de la seringue de micro-injection. La seringue de micro-injection est ensuite insérée à travers l’incision et la solution d’ADN est injectée dans l’espace sous-rétinien. Enfin, une électrode de pince à épiler est placée sur la tête du popeur et une série d’impulsions électriques sont délivrées.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transduction rétrovirale est que l’électroporation in vivo ne nécessite pas la génération et la manipulation d’agents biologiques comme outils de livraison de gènes. Par conséquent, la technique nécessite moins de main-d’œuvre, moins de réactifs et peut être utilisée dans n’importe quel poste de travail approuvé pour les procédures animales. En général, les personnes qui ne connaissent pas la technique auront du mal à se faire une idée de la position de la seringue de micro-injection dans l’espace sous-rétinien.

Jimmy DeMilo, un boursier postdoctoral de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Parce que la concentration d’ADN requise pour l’électroporation est relativement élevée, l’ADN plasmidique souhaité est d’abord amplifié par des cellules incompétentes extraites à l’aide d’une préparation maxi, puis purifié et concentré à environ cinq microgrammes par microlitre. Un colorant FCF vert rapide est ajouté comme traceur d’injection.

Une fois l’ADN plasmidique préparé, anesthésié les bébés souris nouveau-nés sur de la glace pendant environ cinq minutes, en les surveillant jusqu’à ce que l’inconscience soit confirmée par la compression des coussinets plantaires. Échangez la zone de l’œil à injecter avec de l’alcool à profil isop à 70 % et utilisez un microscope à dissection pour identifier l’épithélium jonctionnel FUS où les paupières se rejoignent. À l’aide d’une aiguille pointue de calibre 30, ouvrez soigneusement l’œil en coupant le long de l’épithélium jonctionnel fusionné sans appliquer de pression excessive vers le bas ou couper au-delà de la portée de la paupière.

Une fois la paupière ouverte et l’œil exposé, utilisez la pointe de l’aiguille pour faire une petite incision dans la sclère près de la jonction avec la cornée en faisant attention de ne pas pénétrer trop profondément et de perforer le cristallin. Insérez l’aiguille d’injection à l’extrémité émoussée dans l’incision. Jusqu’à ce que la résistance de la paroi sclérale opposée se fasse sentir, injectez lentement 0,3 microlitre de la solution d’ADN visqueuse dans l’espace sous-rétinien.

En prenant soin de ne pas appuyer trop fort contre la paroi sclérale, faites pivoter l’animal pour vérifier une répartition uniforme de la solution d’ADN dans la rétine. Tout d’abord, trempez l’électrode de la pince à épiler dans du PBS pour maximiser la conductivité électrique. Placez ensuite la tête du chiot injecté entre les électrodes avec l’œil injecté adjacent à l’électrode du pôle positif et l’œil non injecté adjacent à l’électrode du pôle négatif.

Appliquez cinq impulsions carrées à l’aide d’un générateur d’impulsions, chaque impulsion étant de 80 volts et d’une durée de 50 millisecondes, avec un intervalle de 950 millisecondes entre les impulsions. Enfin, réchauffez les chiots sous une lampe chauffante jusqu’à ce qu’ils se remettent de l’anesthésie glacée. Une fois rétablis, retournez les petits électroporés à leur mère au troisième jour postnatal.

La majorité des cellules électroporées de l’EGFP se trouvent dans la couche neuroplastique rétinienne et ne présentent pas de caractéristiques morphologiques distinctes de l’une des cellules gliales neurales différenciées de la rétine. Au 14e jour postnatal, des cellules électroporées se trouvent dans la couche nucléaire externe et la couche nucléaire interne de la rétine et les différentes cellules marquées. Présentent maintenant des caractéristiques morphologiques caractéristiques des neurones différenciés.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’effectuer toutes les étapes de manière fluide et uniforme. Il est très facile d’endommager les rétines lors de la micro-injection, et des pratiques nécessaires pour développer la dextérité manuelle nécessaire pour éviter les lésions tissulaires. En suivant cette procédure.

D’autres méthodes telles que l’immunohistochimie ou l’hybridation in situ peuvent être réalisées afin de déterminer si l’expression des gènes d’intérêt est régulée à la hausse ou à la baisse dans les électrorétines.