Time-lapse de microscopie du début de l'embryogenèse dans les Caenorhabditis elegans

L’objectif général de l’expérience suivante est d’enregistrer les événements subcellulaires au cours de l’embryogenèse précoce. Ceci est réalisé en utilisant des souches transgéniques avec plusieurs protéines marquées par fluorescence qui permettent la visualisation de l’ADN ainsi que des sous-ensembles de vésicules Dans l’embryon précoce, des organites spécifiques sont marqués par une micro-injection de colorants fluorescents, tels que Lyo tracker ou MIT tracker dans la gonade du ver adulte. Ensuite, les embryons sont découpés dans des vers adultes et observés avec un microscope confocal pour obtenir des enregistrements en accéléré des mouvements des protéines marquées dans les organites.

En fin de compte, le protocole révèle un mouvement intéressant des lysosomes et des vésicules marquées à la GFP au cours du développement précoce chez les allergans CL. Je m’appelle Connie Hedger, et aujourd’hui, je vais vous montrer comment nous effectuons la microscopie time-lapse dans notre laboratoire, le laboratoire Boyd de l’Université de l’Alabama à Huntsville. Pour cette expérience, des nématodes gro sur des plaques NGM agri, assis avec une pelouse bactérienne OP 50 à 25 degrés Celsius la veille de l’expérience, cueillent au moins 40 L de quatre larves sur des plaques assises et les incubent toute la nuit à 25 degrés Celsius.

Ces vers seront de jeunes adultes. Pour l’expérience. Fabriquez un tampon d’injection en prenant en sandwich deux gouttes de 2 % d’aros dans l’eau d’une pipette passée entre deux lames de verre de couverture, et en appliquant une pression pour façonner les agros en un cercle de 1,5 centimètre de diamètre.

Retirez la glissade du couvercle supérieur et déshydratez le tampon en le plaçant dans un four à 80 degrés Celsius pendant une heure, ou laissez-le reposer sur la paillasse pendant la nuit. Le jour de l’injection, préparez une solution diluée de colorant MIT tracker ou lyo tracker et tirez les aiguilles d’injection d’un capillaire en verre de 1,2 od. Remplissez les aiguilles avec une solution de colorant dilué et rangez-les dans une chambre humidifiée sombre, montez l’aiguille d’injection sur le micromanipulateur et connectez l’aiguille à un régulateur de pression avec un tube de 1,2 millimètre de diamètre interne.

Placez maintenant deux gouttes d’huile minérale lourde sur le tampon d’injection. Placez le tampon d’injection sur le microscope et abaissez l’aiguille dans l’huile. Appliquez une pression d’injection et observez si le liquide s’écoule de l’aiguille.

Si ce n’est pas le cas, vous devrez casser doucement l’extrémité de l’aiguille en enfonçant doucement la pointe dans un petit morceau de verre de couverture cassé placé sur le tampon d’injection. Une fois que l’aiguille s’écoule, procédez à l’injection une heure avant de voir les embryons. Utilisez une photo pour transférer les jeunes vers adultes dans la goutte d’huile sur le tampon d’injection.

Disposez trois à 10 vers en parallèle et à un peu moins d’une longueur de ver de côté. Il est maintenant important d’injecter les vers rapidement avant qu’ils ne se dessèchent. Déplacez le tampon avec les vers sur la platine du microscope.

Concentrez-vous sur la partie centrale de la gonade distale. Ensuite, utilisez le micromanipulateur pour déplacer la pointe de l’aiguille dans le même plan focal. Percez le ver en déplaçant la platine horizontalement.

Lorsque la pointe de l’aiguille est à l’intérieur du cu, appliquez une pression pour remplir la gonade avec le mélange de colorant. La gonade va se dilater avec le volume de l’injection. Procédez à l’injection.

Les deux vont en filet bras de chaque ver après l’injection. Couvrez les vers avec 0,5 millilitre de tampon à œufs appliqué. À l’aide d’une pipette de pâturage tirée, laissez ensuite les vers récupérer pendant une à deux heures à température ambiante dans une chambre humidifiée sans lumière.

Commencez par préparer un nouveau tampon agros pour observer les embryons injectés avec une pipette passée. Mettez trois gouttes d’agros fondus sur une lame de microscope propre et placez cette lame entre deux autres lames enveloppées dans une couche d’étiquetage. Ruban adhésif : le ruban contrôle l’épaisseur du tampon.

Ensuite, appuyez sur la lame de microscope propre sur les gouttes agros afin qu’elle repose sur les lames de bande. Ne retirez pas la lame supérieure tant que les embryons ne sont pas prêts à être montés. Déposez maintenant 20 microlitres de tampon d’œuf au centre d’un verre de couverture et transférez les vers injectés dans le tampon Sous un microscope à dissection, ouvrez les vers près de la vulve.

À l’aide d’une aiguille hypodermique de calibre 26, les embryons se répandront hors du ver. Retirez maintenant la lame supérieure de la lame d’imagerie et abaissez le tampon aros à l’envers sur la vitre de couverture avec les embryons. Si les embryons doivent être imagés sur une longue période de temps, scellez les bords du verre de couverture avec de la vaseline pour éviter la dessiccation.

Maintenant, commencez l’imagerie en localisant les embryons sous l’objectif de 10 x pour trouver des embryons à un stade précoce, recherchez des embryons qui sont en train de terminer la méiose maternelle. Les embryons myotiques peuvent être distingués des embryons ultérieurs parce qu’ils n’ont pas subi de raccourcissement. Après avoir terminé la méiose, il y a un espace important entre la membrane cellulaire et la coquille de l’œuf à l’extrémité antérieure de l’embryon.

Une fois qu’un embryon correctement stadifié est identifié, passez à une lentille à grossissement plus élevé pour l’enregistrement de l’embryogenèse. Cet embryon exprime à la fois les protéines M cherry histone deux B et GFP marquées à l’ubiquitine. L’ADN maternel et paternel est visible via le cerisier M H deux B, et montre ainsi les étapes du développement précoce.

Cet embryon a été injecté avec OC Tracker blue et exprime l’ubiquitine GFP. Les images ont été collectées à l’aide d’un objectif 63 x 1,4 NA avec 4 lasers 88 et 5 lasers 55 réglés à une puissance minimale et un gain maximal. En règle générale, les Zacks sont collectés toutes les 10 à 15 secondes pendant un maximum de 60 points de temps avant que le photoblanchiment ne se produise.

Pour cette vidéo TimeLapse, les piles Z ont été réduites en images de projection maximales lors de l’exécution du time-lapse. Les embryons de microscopie doivent commencer la migration pronucléaire quelques minutes après la fin de la deuxième myose, et dans les 20 minutes. La première cytokinèse doit commencer.

Si vous observez un arrêt du développement de vos embryons, essayez de diminuer l’intensité du laser ou utilisez un coussinet augure plus épais.