ReAsH / Flash d'étiquetage et d'analyse d'images de protéines dans les cellules du capteur Tetracysteine

L’objectif global de cette procédure est de marquer des cellules exprimant une protéine tétracystéine et marquée par fluorescence avec les colorants flash ou cendres, et d’analyser quantitativement les résultats. Ceci est accompli en transectant d’abord un plasmide portant une protéine fluorescente et la protéine cible contenant une étiquette tétracystéine dans la lignée cellulaire d’intérêt. Ensuite, la protéine exprimée est marquée avec R ou flash, et le régime non spécifiquement lié est éliminé par lavage avec BAL pour se préparer à l’imagerie microscopique.

Ensuite, un microscope confocal est utilisé pour collecter des images fluorescentes des cellules avec les cendres ou le flash et les canaux protéiques fluorescents. Enfin, les images sont analysées à l’aide de l’image J pour quantifier la liaison des cendres ou des éclairs à la protéine cible. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent l’étendue de la liaison des cendres ou des éclairs à la protéine cible dans les cellules grâce à la corrélation de la fluorescence des cendres avec la fluorescence des protéines fluorescentes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la simple prise de la protéine cible avec la GFP, est qu’elle peut suivre une deuxième propriété de la protéine, telle que le changement de conformation en plus de sa localisation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la sous-structure et de la fonction des protéines, telles que les événements d’isation, les changements conformationnels et les événements de liaison LI qui modifient la capacité du TAC à interdire les cendres ou les flashs. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons voulu évaluer comment de petits polygames submicroscopiques de Huntington se sont formés dans les cellules.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’analyse des données sont difficiles à apprendre car elles sont techniquement complexes. La première à la troisième étape sera Yasmin Ranson, une assistante de recherche de notre laboratoire, qui fera la démonstration de l’analyse des données. La quatrième étape sera Sevki GaN, un étudiant diplômé de notre laboratoire, utilisant des méthodes de culture cellulaire standard pour votre lignée cellulaire d’intérêt et une lame d’imagerie de cellules vivantes prête pour la transfection.

Préparez une culture de cellules d’adhérence transfectez votre plasmide contenant le gène de marquage TC d’intérêt. Selon une méthode de transfection choisie, il est important d’avoir des témoins positifs et négatifs afin d’évaluer l’étendue de la liaison spécifique aux étiquettes TC, ainsi que d’évaluer l’écoulement de la fluence d’eau de Javel entre les canaux lors de la collecte de micrographies confocales. Par conséquent, pour deux couleurs, assurez-vous que les échantillons sont préparés pour des couleurs uniques, soit la protéine fluorescente seule et, si possible, une protéine T ctech liée à la chair ou sans

protéine fluorescente. Un à deux jours après la transfection, rincez doucement les cellules avec 300 microlitres de solution saline équilibrée de Hank d’avant-guerre ou HBSS, préparez une HBSS préchauffée fraîche avec 10 micromolaires, un, deux, et Ethan dia thiol ou EDT et un flash micromolaire ou cendre. Et après avoir retiré le HBSS des cellules, remplacez-le doucement par 300 microlitres de cendres à incuber pendant exactement 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire.

D’après notre expérience, des temps d’incubation plus longs augmentent considérablement la fluorescence de fond. Aspirez doucement la solution de marquage des cellules et remplacez-la par 300 microlitres de HBSS préchauffé avec 250 micromolaires, deux trois dimères, un propanol à capuchon ou un BAL pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez la solution de lavage par aspiration douce et remplacez-la par 300 microlitres de HBSS préchauffé.

Après ce lavage, les cellules peuvent être fixées avec la hauteur du paraforme, bien que nous ayons constaté que cela augmente la fluorescence cynique non spécifique. Par conséquent, nous imaginons généralement que les cellules vivent à température ambiante. De plus, la fixation des cellules avant le marquage empêche la liaison biale.

Pour commencer à imager les cellules sur le microscope confocal, configurez les paramètres d’imagerie des fluorophores individuels et assurez-vous qu’il y a un saignement négligeable entre les canaux. Ensuite, ajustez les paramètres du multiplicateur de photo afin que la fluorescence maximale de l’échantillon ne sature pas le détecteur. Une fois les meilleurs paramètres d’imagerie déterminés, ne modifiez aucun d’entre eux entre les échantillons.

Utilisez une fréquence de balayage de 200 hertz, collectez quatre moyennes de lignes et réglez le diamètre du sténopé sur une unité de surface. Le diamètre du sténopé peut être augmenté si le rapport signal/bruit est un problème. Cependant, cela peut entraîner une certaine perte de résolution d’imagerie.

Collectez les images confocales dans un format 12 bits ou supérieur si possible. Maximiser la qualité de l’analyse des données quantitatives. Collectez des images pour le canal de la protéine fluorescente ainsi que pour le canal de la matrice de l’arsenal BI pour tous les échantillons.

Pour analyser les données, utilisez le logiciel Image J avec les plugins suivants. Si vous utilisez une version de l’Image J antérieure à la version 1.32 C, cliquez sur les options suivantes. Pour permettre l’ouverture simultanée de plusieurs images, modifiez les options d’entrée de sortie de barre oblique, cliquez sur la case pour utiliser le sélecteur de fichier j pour ouvrir le partage de barre oblique.

Cliquez sur OK. Ouvrez les images qui vous intéressent. L’image J définira automatiquement les intensités de pixels maximale et minimale qui s’affichent à l’écran pour chaque image séparément, car différentes images auront des intensités de pixels différentes.

Cela signifie que les images affichées ne sont pas comparables à celles affichées. Pour vous assurer que les images ouvertes sont toutes à la même échelle, définissez physiquement les intensités de pixels supérieure et inférieure à visualiser. Pour définir ces valeurs, choisissez image, ajustez la luminosité et le contraste.

Cliquez sur set, définissez les valeurs minimales et maximales affichées. Choisissez ensuite Se propager à toutes les images ouvertes et cliquez sur OK. Vous pouvez également regrouper toutes les images d’une chaîne particulière dans un seul fichier ou une seule pile.

L’image J ajustera alors automatiquement toutes les images à la même échelle. Pour ce faire, choisissez Piles d’images, Empilements d’images, entrez un nom commun à chaque fichier et choisissez les titres utilisés comme libellés. Cliquez sur OK.

Convertissez toutes les images ouvertes en huit bits pour l’analyse. En choisissant le type d’image huit bits, cela redimensionnera la plage affichée dans un intervalle de zéro à 255. Il est important de ne pas enregistrer sur le format d’origine 12 bits ou supérieur, car cela perdrait du contenu d’information.

Enregistrez une copie dans un nouveau dossier appelé huit bits converti à l’aide de l’option d’enregistrement sous. Une méthode pour examiner l’étendue de la liaison de la puce bi arsale dans une image entière consiste à effectuer un tracé de corrélation de l’intensité des pixels. Ce tracé représente chaque valeur de pixel d’un canal par rapport à la valeur de pixel correspondante d’un deuxième canal.

Par conséquent, une position de pixel élevée en fluorescence GFP sera également élevée en fluorescence des cendres s’il y a une liaison élevée. Pour analyser la corrélation de pixels co, assurez-vous que les images REA et GFP de huit bits sont ouvertes dans l’image J.Ensuite, ouvrez le plugin de corrélation d’image en choisissant le plugin de corrélation d’image. Attribuez les fichiers image à l’image un et à l’image deux.

Cliquez ensuite sur OK. La pile résultante peut ne pas afficher d’informations détaillées. C’est normal.

Enregistrez la pile dans un nouveau dossier appelé nuages de points et donnez-lui le même nom de fichier que l’échantillon auquel elle fait référence. Par exemple, graphique de corrélation Ash GFP. Pour afficher les données, choisissez l’une des deux options.

Tout d’abord, transformez les données pour qu’elles soient au format de journal en choisissant traiter math log auto. Ensuite, pour redimensionner visuellement les données, cliquez sur l’image, ajustez la luminosité, la barre oblique et contrastez, puis sélectionnez auto. Deuxièmement, redimensionnez visuellement les données pour n’afficher que les valeurs faibles et affichez les données à l’aide d’une table de correspondance ou d’une LUT spéciale pour créer une LUT personnalisée.

Cliquez sur l’édition de la couleur de l’image LUT pour une LUT très simple. Cliquez sur le pixel en haut à gauche et choisissez la couleur noire. Sélectionnez ensuite le pixel suivant à droite et choisissez la couleur rouge.

Ensuite, cliquez sur le troisième pixel, et tout en maintenant le bouton de la souris enfoncé, faites glisser la sélection vers le pixel inférieur droit. Sélectionnez la couleur rouge, cliquez sur OK, puis sélectionnez la couleur blanche et cliquez sur OK. Sélectionnez la plage de contraste de la barre oblique de zéro à 255 comme décrit précédemment pour verrouiller l’image à celle affichée à l’écran.

Convertissez-le au format RVB pour copier et coller des images dans d’autres programmes. Tout d’abord, ouvrez les images huit bits ou 16 bits comme décrit précédemment. Attribuez un jeu de couleurs LUT aux images pour GFP.

Attribuez la LUT verte en cliquant sur l’image. Recherchez les tables vertes. Enfin, sélectionnez l’image à copier et copiez-la dans le presse-papiers En choisissant modifier la copie dans le système, cette figure montre un résultat typique pour la chaussette kinase fusionnée, la GFP et une balise TC qui a été colorée pendant 30 minutes.

Avec des cendres dans les cellules HEC 2 9 3, il semble que l’ASH se lie efficacement à la protéine cible portant une étiquette TC de haute affinité. En revanche, cette figure montre l’échantillon de contrôle correspondant de SARK fusionné à la GFP, mais sans l’étiquette TC, qui est essentielle pour vérifier à la fois la spécificité de l’étiquette TC et le niveau de coloration de fond. Ce résultat montre que RH n’a pas de réactivité avec la protéine cible, faute de l’étiquette TC, ce qui indique la spécificité de l’étiquette TC pour la liaison SSH.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas laisser les cellules être confluentes et calmes, car cela affecterait la liaison V dans les cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser simplement vos données quantitativement, et vous pouvez affiner ces méthodes pour développer votre propre IUTS unique pour la visualisation des données.