Name: GABA-courants activés monocanal et Tonic en tranches de cerveau de rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-17T14:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Découvrez la technique du patch-clamp pour enregistrer les courants GABA activés par canal unique et tonique dans des tranches de cerveau de rat. Cette méthode permet de différencier les canaux synaptiques et extrasynaptiques.

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Ce travail a été financé par le Conseil suédois de la recherche, l&#39;université d&#39;Uppsala et le Fredrik et Ingrid Thurings Fondation. ZJ a tenu une bourse postdoctorale du EXODIAB et Svenska för Sällskapet Medicinsk Forskning. Nous tenons à remercier Frank Lee pour l&#39;assistance technique.

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</ol>

Le courant cellule entière représente l&#39;ensemble des courants générés par les canaux actifs dans la cellule. La pharmacologie spécifique et la perméabilité du chlorure de canaux GABAA permet d&#39;identifier les courants associés à ces canaux. La nature transitoire de l&#39;activation des canaux synaptiques et l&#39;activation tonique des canaux permet une différenciation facile extrasynaptiques entre ces deux populations de canaux GABAA exprimé dans un neurone. Cependant, seulement avec un seul canal enregistrements peut-on étudier les propriétés cinétiques des molécules canaux qui génèrent les courants tonique. Contrairement aux canaux synaptiques qui activent dans les 100 ms, les canaux sont activés GABAA toniques avec une latence de l&#39;ordre de quelques minutes de l&#39;heure GABA est appliquée 4,7,15,16,17,18. Cette activation retardée des résultats des canaux dans les propriétés du canal que beaucoup ne peuvent pas être étudiés en utilisant la cellule entière enregistrements. Au niveau mono-canal les différentes sous-populations de canaux GABAA peuvent être identifiés sur la base variant propriétés fonctionnelles et pharmacologiques. Ainsi, en prenant un avantage de ce que les différentes configurations de patch-clamp ont à offrir, il est possible d&#39;étudier en détail la fonction moléculaire et la pharmacologie des canaux GABA-activé qui génèrent des courants tonique et synaptique dans les neurones.

Plusieurs de patch-clamp systèmes matériels et logiciels sont disponibles et ils fonctionnent tous selon les mêmes principes de base. Dans notre laboratoire, nous utilisons les amplificateurs Axoclamp et le logiciel pClamp (Molecular Devices, USA) pour enregistrer et analyser nos expériences. Une autre marque populaire est HEKA amplificateurs et des logiciels (HEKA Elektronik, Allemagne) Microforge: Narishige MF-830 (Japon); Vibrotome: par exemple, Leica VT1200S (Allemagne) ou Campden Instruments vibrotome (UK); Microscope: Nikon Eclipse E600FN; bain d&#39;eau; Micromanipulateurs: fait sur mesure et micromanipulateurs Narishige (Japon); Puller: DMZ universelle (Allemagne) ou Narishige PC-10 (Japon). Électrode de verre: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).

gaba-courants activés monocanal et tonic en tranches de cerveau de rat

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

Les canaux GABA A sont présentes dans tous les neurones et sont situés à la fois au niveau des synapses et à l&#39;extérieur des synapses, où ils génèrent des courants phasique et tonique, respectivement 4,5,6,7 Le GABA Un canal est un canal chlorure pentamérique GABA-dépendants. Les sous-unités de canaux sont regroupés en 8 familles (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π et ρ). Deux alphas, deux betas et une sous-unité 3 ème former le canal fonctionnel 8. En combinant des études de sous-type spécifique de GABA-activé à canal unique de molécules avec des études, y compris toutes les populations de canaux GABA A dans le neurone, il devient possible de comprendre le mécanisme de base de l&#39;inhibition neuronale et comment elle est modulée par des agents pharmacologiques. Nous utilisons la technique de patch-clamp 9,10 pour étudier les propriétés fonctionnelles des canaux GABA A dans les neurones vivants dans des tranches de cerveau de l&#39;hippocampe et enregistrer le canal unique et la cellule entière courants. Nous avons en outre examiner comment les canaux sont affectés par différentes concentrations de GABA, d&#39;autres drogues et les facteurs intra et extracellulaire. Pour une description théorique et pratique détaillée de la méthode patch-clamp s&#39;il vous plaît voir Le monocanal Recordings édité par B et E Sakman Neher 10.

Nous utilisons la technique de patch-clamp pour mesurer le GABA-activé un seul canal courants (GABAA canaux, récepteurs GABA) et les courants synaptiques et tonique qu&#39;ils génèrent dans les neurones. L&#39;activation des canaux diminue l&#39;excitabilité neuronale dans la santé et la maladie<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;.

GABA-courants activés monocanal et Tonic en tranches de cerveau de rat

Les canaux GABA\textsubscript{A} sont présents dans tous les neurones et sont situés à la fois au niveau des synapses et en dehors des synapses, où ils génèrent des courants phasiques et toniques, ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'enregistrer les courants activés par le GABA générés par des molécules uniques, le courant unitaire, ainsi que par des populations spécifiques de canaux situés au niveau des synapses ou en dehors des synapses. Ceci est réalisé en préparant tout d'abord des tranches de cerveau de rat hippocampique et en fabriquant des pipettes destinées à la technique de patch-clamp. Dans un deuxième temps, une pipette est fixée à la membrane neuronale.Après la formation d'un scellement gégaohmique, on obtient la configuration de scellement en mode « cellule attachée ». Ensuite, appliquez une aspiration à la pipette. Dès qu'elle pénètre dans la cellule, la configuration de scellement en mode « cellule entière » est établie.Des résultats sont obtenus permettant de distinguer les canaux GABAa synaptiques des canaux extrasynaptiques. Le principal avantage de la technique de patch clamp par rapport aux méthodes existantes comme l'EMIT est qu'elle permet d'étudier les propriétés fonctionnelles des canaux. La méthode de patch clamp peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine des neurosciences, telles que ce qui détermine l'excitabilité des neurones et comment celle-ci est modulée et finement réglée.Les implications de cette technologie s'étendent à la thérapie et au diagnostic de nombreuses maladies, car chaque cellule vivante dépend d'un canal ionique fonctionnant correctement pour sa survie et pour assurer sa fonction cellulaire spécialisée. La démonstration de cette procédure sera assurée par le grand chercheur postdoctoral du laboratoire et Young Yin, une étudiante diplômée du laboratoire. Pour commencer cette procédure, sacrifier un rat Wistar âgé de 16 à 22 jours après la naissance par décapitation, puis retirer rapidement le cerveau à l’aide d’une spatule. Couper le cerveau en suivant la ligne médiane à l’aide d’un scalpel chirurgical.Ensuite, placez chaque hémisphère sur du papier filtre Watman, la surface de coupe tournée vers le papier. Déposez une goutte de colle super glu sur le disque d'échantillon et placez l'hémisphère dessus, la surface de coupe orientée vers le bas. Puis, placez le disque d'échantillon dans la chambre de coupe du vibrotome remplie de glace froide.Un LCR. Réglez l'épaisseur de coupe à 400 micromètres et commencez à découper le cerveau. Coupez environ deux millimètres de tissu cérébral jusqu'à atteindre l'hippocampe.Ensuite, placez les tranches d'hippocampe dans une plaque de Pétri en verre remplie de LCR. La plaque est placée sur un fond noir afin de permettre une visualisation facile de l'hippocampe. L'étape suivante consiste à isoler l'hippocampe du tissu environnant à l'aide d'un scalpel chirurgical aiguisé.Veillez à ne pas pousser ni tirer le tissu après cela. Incubez les tranches et la solution A CSF à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis conservez-les à température ambiante jusqu'à la fin des expériences. Des capillaires en verre borosilicaté sont utilisés pour les pipettes de patch. Tirez les pipettes de patch à l’aide d’un tireur de pipettes automatique ou manuel, de manière à obtenir une résistance de deux à quatre mégohms pour les enregistrements en configuration whole cell, ou de huit à vingt mégohms pour les enregistrements de canaux unitaires. Polissez la pipette avec le même verre borosilicaté pour les enregistrements de canaux unitaires. À l’aide d’un micro-four, faites fondre le verre borosilicaté sur le fil de platine afin d’obtenir une extrémité plus lisse.Polir les pipettes de cette manière permet d'obtenir des pipettes formant des scellements plus stables et plus résistants, par rapport aux pipettes polies à l’aide de la chaleur dégagée par un fil nu ou par une étape de polissage dans un tireur automatique. L’équipement de patch-clamp comprend un microscope installé sur une table flottante et placé dans une cage de Faraday, un amplificateur, un convertisseur analogique-numérique et un ordinateur. Ensemble, ces équipements sont souvent désignés sous le nom de dispositif de patch-clamp.Insérez maintenant une pipette dans le support de pipette et serrez le bouchon afin de fixer la pipette. Le logiciel P clamp est utilisé pour le piégeage en mode patch. Réglez l'amplificateur OC clamp 200 B sur V clamp, avec un gain de deux, un filtre de deux kilohertz et un potentiel de maintien à zéro millivolt. Pour créer une pression positive dans la pipette, soufflez de l'air dans l'embout buccal fixé au tube qui est relié au support de pipette.Ensuite, fermez la vanne située entre l'embout buccal et le tube. Assurez-vous qu'il n'y a pas de fuite d'air. Puis, abaissez la pipette dans la solution bain.Sur l'écran d'ordinateur où est mesurée la résistance de la pipette, vous verrez une impulsion générée par un train d'impulsions de cinq millivolts et un nombre indiquant la résistance de la pipette. Les valeurs plus faibles correspondent à des orifices plus larges à l'extrémité de la pipette et à des pipettes plus grandes. Réglez le décalage de la pipette sur l'amplificateur à zéro.Utilisez un grossissement de 10 x sur le microscope pour identifier la région, ou un grossissement de 60 x. Pour identifier un neurone paramétal que vous allez enregistrer dans les tranches d'hippocampe, les cellules granulaires du gyrus denté, la région des corps cellulaires des cellules paramétales du CA1 et la région des corps cellulaires des cellules paramétales du CA3 apparaissent chacune comme une bande brillante. Mettez la pipette au point afin de pouvoir voir à la fois la région ou la cellule et la pipette.En regardant à travers les oculaires du microscope, placez la pipette au-dessus du milieu de la région à l’aide du réglage du manipulateur de déplacement grossier, puis abaissez la pipette jusqu’à ce qu’elle soit juste au-dessus, mais en contact avec le tissu. À ce stade, abaissez très délicatement la pipette sur le centre de la cellule ou de la région à l’aide des réglages de déplacement fin du manipulateur. Simultanément, surveillez l’écran de l’ordinateur pour suivre la résistance de la pipette.Continuez à abaisser la pipette jusqu'à ce que la résistance de la pipette devienne plus élevée. Relâchez la pression positive de la pipette en ouvrant la vanne. Cela crée une aspiration douce et forme automatiquement le scellé gigaseal.Si le scellement giga ne se forme pas, appliquez une aspiration à l'embout sur lequel vous avez précédemment appliqué une pression positive. Vous avez maintenant obtenu la configuration d'enregistrement en mode « cell attached patch clamp ». Ajustez la compensation rapide et lente de la capacité pour annuler le transitoire provenant de la pipette et du porte-pipette.Sur l'écran de l'ordinateur, vous verrez un tracé de courant plat. Plus la valeur GigE est élevée, meilleur sera le rapport signal sur bruit que vous obtiendrez lors des enregistrements de canaux unitaires pour enregistrer les courants unitaires à l'aide d'une configuration de patch-clamp en mode attaché à la cellule. Réglez le gain à 500 et la fréquence d'échantillonnage des données à une valeur ne dépassant pas 100 microsecondes.Ensuite, enregistrez les courants. Maintenez le volume de la solution de bain faible, de sorte qu'elle recouvre à peine la tranche, afin de minimiser le bruit dans les enregistrements pour réaliser un enregistrement en mode cellule entière. Modifiez le potentiel de la pipette à moins 60 millivolts ou à une valeur proche du potentiel de membrane au repos.Dans la configuration en attaché à la cellule, appliquez une aspiration à la pipette via le tube relié au porte-pipette. En même temps, observez les changements de résistance et du transitoire de capacité à l'écran de l'ordinateur. Une fois que vous avez pénétré dans la cellule.Lorsque cela se produit, vous êtes en configuration dite de « mode tout cellulaire ». Laissez la solution de la pipette s'équilibrer avec l'intérieur de la cellule pendant cinq à dix minutes. Entre-temps, surveillez attentivement la valeur de la résistance en série.Le courant est porté par les populations de canaux ouverts dans la membrane cellulaire. Pour démontrer l'activation de canaux unitaires par le GABA, celui-ci est ajouté dans la solution du pipet, car il ne peut pas traverser la membrane cellulaire. On observe ici les courants unitaires activés par une concentration de 20 nanomolaire de GABA dans un patch en configuration cellule attachée sur un neurone granulaire du gyrus denté.Le patch a été dépolarisé de 40 millivolts. La conductance maximale du canal était de 44 picosiemens et sa latence d'activation était de 2,63 minutes. Voici un exemple de la façon de distinguer les courants GABA, activés synaptiquement et extrasynaptiquement, selon la nature phasique et tonique des courants.Le courant traversant les populations de canaux a été enregistré à partir de neurones hippocampiques de rat en utilisant la méthode de blocage voltage en configuration tout-cellulaire afin d'identifier les courants toniques et phasiques. Cent micromoles de l'antagoniste GABAA SR 95531 ont été appliquées sur un neurone du gyrus denté comme indiqué dans le panneau BA et sur un neurone para-médian traité à l'insuline comme indiqué dans le panneau BB. Le SR 95531 a bloqué les canaux extrasynaptiques et induit un décalage du courant de base, mettant ainsi en évidence le courant tonique.Une fois maîtrisée, l'obtention d'un patch en configuration attachée à la cellule, puis la rupture dans la cellule afin d'établir un patch en configuration whole-cell, peut être réalisée en moins de deux minutes. Après cette procédure, on peut réaliser des enregistrements sur d'autres tissus, comme des îlots pancréatiques intacts, ou sur des cellules isolées telles que des lymphocytes ou des cellules en culture.

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