Name: Nanoparticules fluorescentes pour la mesure de la concentration dions dans les systèmes biologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Découvrez la fabrication de nanocapteurs de sodium fluorescents pour l'imagerie ionique in vitro et in vivo. Cette méthode permet des mesures quantitatives précises dans les myocytes cardiaques et les modèles murins.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JMD et MKB sont financés par la science nanomédecine IGERT et technologie à la Northeastern University (financement du NCI et NSF Grant DGE-0504331). Ce travail a également été financée par les Instituts nationaux de la santé de l&#39;Institut national des sciences médicales générales R01 Grant GM084366. Nous remercions également Saumya Das et Anthony Rosenzweig du BIDMC à Boston pour fournir des myocytes cardiaques et Kevin Cash pour sa contribution à l&#39;élaboration du protocole d&#39;origine animale.

1. Préparation de optode Avant de faire l'optode, des aliquotes des composants sont nécessaire afin qu'ils puissent être facilement mesurés et enregistrés. <ol><li> A 50 mg de sodium ionophores X (Naix) et une fiole de 50 mg de sodium tétrakis [3,5-bis (trifluorométhyl) phényl] borate (NaTFPB) seront chacun grandi dans tetrahyrdofuran (THF) et répartie dans des tubes de 1,5 ml en polystyrène centrifugeuse. Dans une hotte, dissoudre 50 mg de Naix dans 1 ml de THF dans le flacon d'expédition et mélanger afin de s'assurer que le solide soit complètement dissoute. Transférer 100 ul de cette solution dans 10 tubes à centrifuger séparé. Répétez l'opération pour NaTFPB. Laisser le THF à s'évaporer dans une hotte nuit, l'étiquette des tubes de centrifugation et de les placer dans un réfrigérateur de 4 degrés pour le stockage. Cela crée des aliquotes de 5 mg de sécheresse et de Naix NaTFPB. </li><li> Dissoudre le III Chromoionophore (CHIII) dans 1 ml de THF et le transfert d'un flacon de 3 ml en verre. Ajouter un autre 1 ml de THF dans le flacon d'expédition CHIII de dissoudre toute CHIII résiduelle et l'ajouter à la fiole de verre 3 ml. Il y aura un total de 2 ml maintenant. Transférer 1 ml de la solution de THF CHIII dans deux fioles de verre séparées 1,5 ml avec une bouchons revêtus de Téflon. Conserver la solution dans un réfrigérateur CHIII 4 degrés à la concentration finale de 5 mg / ml. </li></ol> Ces aliquotes et solutions seront utilisées pour rendre le matériel optode. <ol start="3"><li> Pipeter 66 ul de bis (2-éthylhexyle) sébaçate (DOS) dans un flacon de 1,5 ml en verre avec un bouchon à vis en Teflon revêtement - c'est le flacon optode. DOS est une solution visqueuse ainsi le soin doit être pris pour assurer la bonne quantité de solution est transféré dans le flacon. Le volume correspond à ~ 60 mg de MS-DOS. </li><li> Peser 30 mg de poly haute masse moléculaire (vinyle) de chlorure (PVC) et transférer les résultats vers le flacon optode. </li><li> Maintenant, ajoutez les composants fonctionnels aliquotés dans le flacon de optode pour créer l'optode désiré. Les concentrations relatives des CHIII, Naix, et NaTFPB va déterminer la réponse du détecteur à sodium. Ces concentrations peuvent être ajustés pour avoir un capteur qui répond idéalement aux concentrations intracellulaires, avec un Kd de 10 mM, ou les concentrations extracellulaires, avec un Kd de 150 mm. En outre, il sera probablement à la variabilité de lot par lot des produits chimiques par le vendeur et l'étalonnage des capteurs est nécessaire pour déterminer si la réponse correcte se produit pour chaque nouveau lot de composants chimiques. Nous décrivons ici la méthode pour créer un capteur avec des concentrations qui sont habituellement utilisés pour les mesures de sodium intracellulaire. </li><li> Dans une hotte, transférer 100 pl de la 5 mg / ml en solution CHIII THF pour le flacon optode. </li><li> Dissolvez 5 mg de Naix dans 300 ul de THF et de transfert 300 pl de la fiole optode, cette corrélation à 5 mg de Naix. </li><li> Dissoudre une aliquote de 5 mg de l'NaTFPB dans 500 ul de THF et de transfert de 20 ul de la solution dans le flacon de optode, cette corrélation à 0,1 mg de NaTFPB. </li><li> Ajouter 80 ul de THF dans le flacon de optode. </li><li> La solution dans le flacon optode contient 30 mg de PVC, 60 mg de DOS, 5 mg de Naix, 0,2 mg de NaTFPB, 0,5 mg de CHIII dans 500 ul de THF. Vortexer doucement ce flacon jusqu'à ce que tous le PVC a dissous. L'optode doit être d'une couleur rouge. Le montant total de THF ajouté au flacon doit être de 500 uL quel que soit le rapport des composants utilisés. </li><li> Laisser le THF restant dans le Naix et des aliquots NaTFPB de s'évaporer durant la nuit et ré-étiqueter le tube avec la quantité correcte de produit chimique. </li></ol> 2. Créer nanocapteurs <ol><li> Pipeter 100 ul de 10 mg / ml de 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N - [méthoxy (polyéthylèneglycol) -550] dans le chloroforme (PEG-lipides) dans un flacon de 4 drams verre. Autoriser le chloroforme à s'évaporer dans une hotte. Ce processus peut être accéléré par le séchage de la solution avec de l'azote ou air de la maison. </li><li> Ajouter 4 ml de la solution aqueuse désirée dans le flacon avec PEG-lipides. Placez le flacon sur une prise de laboratoire au-dessous de la pointe sonication et augmenter le flacon jusqu'à la pointe est d'environ 7 mm de profondeur dans la solution et soniquer à une puissance faible sonication pendant 30 secondes. Ici, nous utilisons une Branson numériques sonificateur mis à l'amplitude de 15% avec une pointe de ½ pouce de diamètre étape de corne. La solution aqueuse peut être une solution. Par exemple, pour déterminer la réponse des capteurs que nous utilisons l'HEPES 10 mM pH 7,2 avec une base Trizma. </li><li> Alors que la solution est soniqué, mélanger 50 ul du matériel optode avec 50 ul de dichlorométhane dans un tube à centrifuger de 0,6 ml. Mélanger avec la pipette pour assurer un mélange uniforme. </li><li> Réglez la commande sonificateur à une sonication pendant 3 minutes. Démarrez le sonication et tout sonication ajouter la solution de mélange optode dans le flacon en plongeant la pointe de la pipette dans la solution et de distribuer les 100 ul de solution dans un rapide, même l'injection. La solution doit virer au bleu, depending sur la solution aqueuse utilisée. </li><li> Autoriser la sonication se poursuivre pendant environ 30 secondes, puis baisser le cric pour que la pointe sonication est d'environ 2 mm de profondeur dans la solution. Cela devrait commencer à aérer la solution et la solution devient opaque. Cette étape permet d'enlever le THF résiduel et de la solution de dichlorométhane. </li><li> Une fois la sonication est terminée, tirez sur la solution de nanocapteurs dans une seringue de 5 ml. Fixer un filtre de 0,2 um seringue et passer la solution nanocapteur dans un flacon en verre avec bouchon à vis. La solution doit être limpide et bleu si une solution aqueuse qui contient moins de 10 mM de sodium et a un pH inférieur à environ 9 est utilisé. Sinon, il ne devrait pas avoir de couleur ou d'être rose. </li></ol> 3. Déterminer la réponse nanonsensor Cette méthode est utilisée pour déterminer la réponse de nanocapteurs conçu pour mesurer sodium intracellulaire. Différentes concentrations sont recommandés pour être utilisés pour extracellulaire nanocapteurs concentration en sodium. <ol><li> Faire des solutions stock de 10 mM HEPES (0 Na) et de chlorure de sodium 1M (NaCl) dans 10 mM HEPES (1 M Na) et le pH de chacune de ces solutions à 7,2 en utilisant la base Trizma. Mélanger les solutions stock de 0 et 1 M Na Na dans 50 ml tubes à centrifuger coniques pour créer des solutions avec: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mm concentrations de NaCl. </li><li> Utilisez un fond optique plaque de 96 puits pour déterminer la réponse. Ajouter 100 ul de chaque concentration de sodium dans 3 puits d'une colonne. Ceci va produire un tableau de 3 x 10 puits. </li><li> Pour chaque puits ajouter 100 ul de nanocapteurs fraîchement préparés et la charger dans un fluorimètre microplaque. Nous utilisons une Molecular Devices Spectramax M3. </li><li> Lisez chaque bien avec les longueurs d'onde suivantes: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Excitation (nm) </td><td> Emission (nm) </td><td> Cut-Off (nm) </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table> L'intensité de nanocapteurs à chaque longueur d'onde dépend de la concentration en sodium. L'utilisation de la longueur d'onde dépend des applications. Pour intracellulaire des mesures dynamiques lentes, nous utilisons 488 nm/570 nm (excitation / émission) et 488 nm/670 nm qui nous permettent de ratio de deux longueurs d'onde et de réduire le bruit. <ol start="5"><li> Traditionnellement, optode données sont converties en une des valeurs qui sont: α = (I - I min) / (I max - I min), où I est l'intensité à une concentration de sodium donné, je min est la plus faible intensité dans les mesures de réponse , et I max est la plus grande intensité dans les mesures de réponse. Convertir soit le ratio d'intensité à 570 nm divisée par l'intensité à 670 nm ou de l'intensité à 680 nm à α. </li><li> Utilisez un logiciel de traçage, Excel ou Origin sont généralement utilisés dans notre laboratoire, pour tracer α en fonction du log de la concentration de sodium, la mise dans le journal de la concentration de sodium de zéro à -1. Ajuster une courbe sigmoïde à la réponse. D'après la courbe, calculer la concentration de sodium à α = 0,5, qui représente la concentration à laquelle le capteur répond de façon optimale. </li><li> Ajustez le taux d'CHIII, Naix, et NaTFPB dans le optode de créer nanocapteurs avec une réponse optimale autour de la concentration en sodium de l'intérêt. </li></ol> 4. Imagerie intracellulaire <ol><li> Pour des mesures intracellulaire, les nanocapteurs sont faites en 5 mg / ml de glucose dans l'eau et micro-injectées dans les cellules. </li><li> Croître ou le transfert de cellules dans un plat à fond de verre ou dans une chambre d'imagerie avec un fond lamelle de verre. </li><li> Incuber les cellules dans les médias claire ou une solution de Tyrode. Montez la chambre de l'imagerie ou un plat sur un microscope à épifluorescence. Nous utilisons un Zeiss LSM 7 microscope confocal. </li><li> Tirez capillaire en verre avec un extracteur de pipette. Nous utilisons une Sutter flamboyante brune p-97 avec 1 mm de diamètre extérieur, 0,78 mm ID de verre, d'un diamètre de l'extrémité finale autour 300-500 nm. </li><li> Remblai de la pipette avec la solution de nanocapteurs utilisant une seringue et une aiguille Hamilton, ou un chargeur de micropointes et une pipette. </li><li> Montez la pipette dans un support qui est attaché à un micromanipulateur et relié à un système d'injection à pression contrôlée. Ici, nous utilisons un micromanipulateur Burleigh EXFO 6000 PCS et une société médicale des systèmes d'injection. </li><li> Basse de la pipette sur le dessus de la cellule et dans le cytoplasme, il est parfois nécessaire de "taper" le titulaire manipulateur pour percer la membrane. Injecter la solution nanocapteurs et retirer rapidement la pipette. </li></ol> 5. Imagerie in vivo Toutes les procédures ont été examinés et approuvés par Animal Care Northeastern University et le Comité d'utilisation. <ol><li> Nanocapteurspour les in vivo, imagerie extracellulaire sont faites dans du tampon phosphate salin et ajusté pour avoir une réponse optimale à sodium à une concentration de sodium de 135 mm. </li><li> Pour l'injection d'installation et d'imagerie de l'nanocapteurs fluorescents chez la souris, nous utilisons le IVIS Lumina II et son unité d'anesthésie sont associés. Désinfecter l'induction et chambres d'imagerie. Placez la souris nude CD1 (environ 20g) dans la chambre de l'induction et les exposent à l'isoflurane. Le pour cent du débit d'oxygène administré isoflurane et varient selon l'espèce et le poids des souris. Attendez la souris pour devenir pleinement anesthésiés. </li><li> Après les souris sont anesthésiées, retirer les souris de la chambre de l'induction et le placer dans la chambre de l'imagerie. Gardez la souris sous anesthésie. Pour chaque souris, désinfecter les zones d'injection désiré. </li><li> Remplir une seringue d'insuline stériles 31G avec 10 uL de nanocapteurs en veillant à éliminer toutes les bulles d'air. </li><li> En utilisant une pince, saisir un petit pli de la peau le long du dos de la souris sur le site d'injection désiré. Tout en saisissant la peau, insérer la seringue dans la peau avec le biseau vers le haut et le parallèle l'aiguille à la peau. </li><li> Avant d'injecter les capteurs, tirez sur le piston de la seringue pour s'assurer que l'aiguille n'est pas insérée dans un vaisseau sanguin. Puis, déplacez doucement le droit d'aiguilles et de gauche pour créer une poche dans la peau. Cela permettrait de minimiser la contre-pression qui provoque les capteurs de s'échapper du site d'injection. Injecter des capteurs et retirez délicatement la seringue. </li><li> Appuyez doucement sur le site d'injection et essuyez toute solution qui peut avoir fui hors du site d'injection. Cela permettrait de minimiser la fluorescence de capteurs qui ne sont pas injectés dans la peau. </li><li> Répétez les étapes 5.4 à 5.7 jusqu'à ce que le nombre de zones d'injection souhaitée est atteinte. Six sites d'injection espacés sur le côté gauche et à droite de l'arrière sont recommandés. Pour chaque souris individuelle, le changement d'aiguilles, si l'aiguille devient difficile d'insérer dans la peau. Aiguilles ne doivent pas être partagés entre les souris. Cela permettrait de minimiser la transmission de maladies ou de contamination croisée entre les souris. </li><li> Pour les capteurs d'imagerie fluorescente de sodium, on acquiert à la fois clair et des images fluorescentes de la souris en utilisant des jeux de filtres que la plupart correspondait étroitement à la nm/680 640 nm (excitation / émission) spectre de la nanocapteurs et que aussi minimiser l'autofluorescence de la peau. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Courbes de réponse de cinq différents ensembles nanocapteur au sodium. Chaque ensemble représente nanocapteurs à partir des formulations différentes optode qui avait la même quantité de CHIII, NaTFPB, PVC et DOS, mais des quantités variables de Naix. Les données ont été converties en valeurs α en utilisant les intensités 639/680 nm. Les données sont une moyenne de 3 barres d'erreur, omis pour la clarté, avec une courbe sigmoïde équipé utilisant origine. Dans cette courbe de réponse, la concentration maximale de sodium utilisé était de 500 mM. Le Kd de l'nanocapteurs de sodium de sodium varie de 10 mM (diamants orange) à environ 150 mm (carrés noirs). <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Injecté myocytes cardiaques néonatales. Les cellules ont été cultivées sur lamelle, monté sur un microscope et injectée avec nanocapteurs de sodium. Illustré sont fluorescents (excitation 639 nm), clair, et la superposition. Notez que certains de clustering sonde se produit, mais les cellules ont une morphologie normale, les capteurs ont diffusé dans le cytosol et il n'ya pas de chargement nucléaire. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Injection sous-cutanée de souris avec nanocapteurs de sodium. Neuf injections différentes de nanocapteurs de sodium ont été faites dans l'espace sous-cutanée de souris nude. Les deux champs lumineux et images fluorescentes (640/680) sont superposées.

<ol><li>Adrogue, H. J., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyponatremia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Hyponatremia.</a> N Engl J Med. 342, 1581-1589 (2000).</li>
<li>Kim, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BACE1+regulates+voltage-gated+sodium+channels+and+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity.</a> Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).</li>
<li>Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+sodium+concentration+continuously+monitored+with+fluorescent+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors.</a> Integr Biol (Camb). , (2010).</li>
<li>Minta, A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li>
<li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+nano-optodes+incorporating+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).</li>
<li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+ion-selective+nanosensors+for+intracellular+analysis+with+improved+lifetime+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size.</a> Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).</li>
<li>Schaffar, B., Wolfbeis, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sodium-selective+optrode%5BTitle%5D)+AND+%22Mikrochim+Acta+III%22%5BJournal%5D)">A sodium-selective optrode.</a> Mikrochim Acta III. III, 109-109 (1989).</li>
<li>Seiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+sodium-selective+optode+membranes+based+on+neutral+ionophores+and+assay+of+sodium+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma.</a> Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).</li>
<li>Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensor+for+sodium+based+on+ion-pair+extraction+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence.</a> Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).</li>
<li>Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carrier-Based+Ion-Selective+Electrodes+and+Bulk+Optodes.+1.+General+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics.</a> Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).</li>
<li>Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+sodium+dynamics+in+isolated+cardiomyocytes+using+fluorescent+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).</li>
<li>Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-Selective+Optodes+Measure+Extracellular+Potassium+Flux+in+Excitable+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).</li>
<li>Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied, , Forthcoming.</li>
<li>Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+optical+PEBBLE+nanosensors+for+real-time+magnesium+ion+concentrations+inside+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells.</a> Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).</li>
<li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging.</a> Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).</li>
</ol>

La formation de nanocapteurs devraient pas prendre plus de 10 minutes une fois la solution optode a été faite et le lipide PEG séché. Optode ne peut pas seulement être prises rapidement en cas de besoin, mais lorsqu&#39;il est conservé à 4 degrés Celsius, ils peuvent être stables pendant des mois. Nous avons montré que l&#39;nansensors, une fois formés, sont stables en solution pendant au moins une semaine;. Cependant, des précautions doivent être prises pour empêcher photoblanchiment cours de cette période en bloquant les nanocapteurs de la lumière 6 Bien nanocapteurs de sodium ont été démontré ici, optodes ont été créés pour la plupart des ions biologiquement pertinents tels que le potassium et le chlorure. 10,12 Nous avons également étendu cette technologie à de petites molécules comme le glucose. 13 En plus de générer nanocapteurs pour surveiller différents analytes, ces nanocapteurs se prêtent à d&#39;autres changements qui les rendent utiles dans la plupart des expériences biologiques. Par exemple, le revêtement de surface, dans ce cas, le poly (éthylène glycol), peut facilement être changé en utilisant toute molécule amphiphile qui est soluble dans l&#39;eau. Cela permet la possibilité de fonctionnalisation de ces nanoparticules pour des applications différentes ou des cibles. La taille des nanoparticules peut également être ajustée en changeant le revêtement de surface, l&#39;intensité sonication ou le solvant utilisé. Indicateurs de calcium fluorescents ont été précieux dans la détermination de la signalisation intracellulaire de calcium, mais pas de colorants de sodium disponibles sensibles ont les mêmes caractéristiques idéales. Optode nanoparticules pour but de fournir une méthode alternative pour les ions d&#39;imagerie intracellulaire ont été en développement pendant des années 14. Nous avons construit sur ​​cette recherche précédentes pour créer nanocapteurs spécifiques pour l&#39;imagerie de sodium intracellulaire qui devrait permettre de fournir un moyen de comprendre comment la signalisation de sodium affecte la fonction cellulaire et altérations de la signalisation qui conduisent à certaines maladies. L&#39;utilisation de nanocapteurs fluorescents in vivo en temps réel offre une-alternative minimalement invasive pour les analytes de surveillance sur les autres méthodes telles que le sang attire 3. Sodium et de glucose nanocapteurs basé sur la technologie ci-dessus a été démontré que de suivre l&#39;évolution de sodium et de glucose, respectivement en vivo. 3,13 Toutefois, il existe actuellement des limites à cette méthode comme un outil de surveillance. Par exemple, les capteurs doivent contenir un fluorophore avec un éventail suffisamment décalée vers le rouge proche infrarouge afin de minimiser l&#39;autofluorescence de fond de la peau. 15 Deuxièmement, la technique d&#39;injection de courant ne produit pas d&#39;injection uniforme des nanocapteurs qui pourraient être causés par de telles erreurs que les variations de la profondeur d&#39;injection. Malgré ces limites, le développement de ces nanocapteurs fluorescents et leur démonstration réussie pourrait rendre ces capteurs un outil de recherche inestimable et méthode de surveillance de la santé des patients.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du produit </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> IVIS Lumina Package II est un instrument </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD-1 chez la souris nude </td><td> Charles River </td><td> Code de souche: 086 </td><td> Immunodéficientes </td></tr><tr><td> Seringues à insuline </td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 3 / 10 cc ml, 8mm, 31G </td></tr><tr><td> Très haut poids moléculaire en PVC </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Naix </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mince paroi de verre capillaires </td><td> Sutter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lipides PEG </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Fournit une liste de produits chimiques et les équipements utilisés dans cette procédure. Tous les produits chimiques courants ne figurent pas été achetés chez Sigma.

nanoparticules fluorescentes pour la mesure de la concentration d&#39;ions dans les systèmes biologiques

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Homéostasie ionique strictement réglementé dans tout le corps est nécessaire pour la prévention de ces états débilitants comme la déshydratation. 1 En revanche, les flux ioniques rapides au niveau cellulaire sont nécessaires pour initier des potentiels d&#39;action dans les cellules excitables. 2 du règlement de sodium joue un rôle important dans les deux ces cas, cependant, il n&#39;existe aucune méthode actuellement de surveiller en permanence les niveaux de sodium in vivo 3 et 4 sondes de sodium intracellulaire ne fournissent pas de semblables résultats détaillés comme sondes calciques. Dans un effort pour combler ces deux lacunes, des nanocapteurs fluorescents ont été développés qui peuvent surveiller les concentrations de sodium in vitro et in vivo. 5,6 Ces capteurs sont basés sur la technologie optode sélective d&#39;ions et se composent de particules de polymère plastifié reconnaissance de sodium dans lequel spécifiques éléments, sensibles au pH fluorophores, et des additifs sont intégrés. 7-9 mécaniste, l&#39;élément de reconnaissance de sodium extraits de sodium dans le capteur 10. Cette extraction entraîne le fluorophore sensible au pH de libérer un ion hydrogène pour maintenir la neutralité de charge dans le capteur qui provoque un changement de fluorescence. Les capteurs de sodium sont réversibles et sélectifs pour le sodium plus de potassium, même à fortes concentrations intracellulaires. 6 Ils sont environ 120 nm de diamètre et sont revêtues de polyéthylène glycol à transmettre biocompatibilité. En utilisant des techniques de micro-injection, les capteurs peuvent être livrés dans le cytoplasme des cellules où elles ont été montrées pour surveiller la dynamique spatiale et temporelle de sodium de battre les myocytes cardiaques. 11 En outre, ils ont également suivi en temps réel l&#39;évolution des concentrations de sodium in vivo lorsqu&#39;elle est injectée sous-cutanée dans des souris 3 de la présente, nous expliquons en détail et de démontrer la méthodologie utilisée pour la fabrication de nanocapteurs fluorescents de sodium et brièvement démontrer les applications biologiques de notre laboratoire utilise les nanocapteurs pour:. la micro-injection des capteurs dans les cellules, et l&#39;injection sous-cutanée des capteurs dans des souris .

Nanoparticules fluorescentes fabriqués dans notre laboratoire sont utilisés pour des concentrations d&#39;ions d&#39;imagerie et de flux d&#39;ions dans les systèmes biologiques tels que les cellules au cours du liquide interstitiel lors de signalisation et de l&#39;homéostasie physiologique.

Nanoparticules fluorescentes pour la mesure de la concentration d&#39;ions dans les systèmes biologiques

Une homéostasie ionique étroitement régulée dans tout l'organisme est nécessaire pour prévenir des états débilitants tels que la déshydratation.1 À l'inverse, un ion rapide...

L'objectif général de l'expérience suivante est de fabriquer des nanosenseurs de sodium destinés à des applications in vitro et in vivo. Cela est réalisé en préparant un mélange opto contenant les composants du capteur pour les nanosenseurs. Dans une deuxième étape, un tensioactif est soumis à une sonication dans une solution aqueuse afin d'obtenir une distribution homogène, ce qui permettra la formation de nanosenseurs lorsque le mélange opto sera ajouté.Ensuite, le mélange opto est ajouté au mélange aqueux de tensioactif sous sonication afin de former les nanocapteurs en solution. Cette vidéo montre que la réponse du capteur est ajustable. Les capteurs peuvent être micro-injectés dans des myocytes cardiaques et peuvent également être injectés par voie sous-cutanée chez des souris.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les colorants indicateurs fluorescents, est que nous pouvons ajuster les capteurs à une plage dynamique correspondant à l'environnement physiologique, mesurer une gamme plus étendue d'analytes et effectuer des mesures ratiométriques pour une analyse quantitative. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car une fois les capteurs fabriqués, il peut sembler intimidant de les introduire dans un environnement biologique. Des stocks de sel sec de sodium ion four x, de sel sec de TFPB de sodium et de chromo four trois doivent être préparés à l'avance avant la fabrication de l'opto, conformément au protocole écrit.Dans une hotte, mélanger tous les matériaux dans un flacon en verre de 1,5 millilitre. À l’aide d’un bouchon vissable revêtu de téflon, agiter doucement le flacon au vortex jusqu’à ce que tout le PVC soit dissous. La solution doit apparaître rouge.Commencez la fabrication des nanosenseurs en ajoutant 100 microlitres de solution de lipide PEG à 10 milligrammes par millilitre dans un flacon en verre de quatre grammes. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de la solution aqueuse souhaitée, comme du HEPES 10 millimolaire.Synchronisez une pointe de fornication de sept millimètres dans le flacon à l’aide d’un palan de laboratoire et appliquez une faible puissance de sonication pendant 30 secondes. Dans un tube de 0,6 millilitre, mélangez 50 microlitres du matériau opto et 50 microlitres de dichlorométhane à l’aide de la pipette afin d’assurer un mélange homogène. Ensuite, commencez une sonication de trois minutes.Au début de la sonication, ajoutez 100 microlitres du mélange opto en immergeant la pointe de pipette et en délivrant le volume total en une injection rapide et uniforme. La solution deviendra bleue si le pH augmente au-dessus de sept, et s’il n’y a pas de sodium pour éliminer le THF résiduel et le dichlorométhane de la solution. Placez la pointe du sonicateur à une profondeur de deux millimètres.Pendant les trois minutes restantes, la solution deviendra opaque. Une fois la sonication terminée, aspirez la solution de nanosenseur dans une seringue de cinq millilitres. Fixez un filtre et distribuez la solution de nanosenseur dans un flacon en verre muni d'un bouchon à vis. Commencez par préparer 10 solutions à concentration croissante de sodium, par rapport auxquelles la sensibilité du nanodétecteur pourra être mesurée. Mélangez des solutions mères de sodium à zéro molaire et à un molaire dans des tubes coniques de 50 millilitres. Ensuite, dans une plaque optique 96 puits, ajoutez 100 microlitres de chaque concentration de sodium à trois puits d'une même colonne.Ensuite, ajouter 100 microlitres de nanosenseurs fraîchement préparés dans chaque puits, charger la plaque dans un fluorimètre pour microplaque et saisir les longueurs d'onde d'excitation, d'émission et de coupure qui sont idéales pour le chromophore utilisé. Le choix des longueurs d'onde mesurées dépend de l'application. Ces longueurs d'onde permettent des mesures intracellulaires de la dynamique rapide ou une réduction du bruit.Pour obtenir les valeurs d'alpha, divisez le rapport d'intensité à 570 nanomètres par l'intensité à 670 nanomètres ou à 680 nanomètres. Tracez les valeurs d'alpha en fonction du logarithme de la concentration en sodium. Fixez le logarithme de la concentration nulle en sodium à moins un.À présent, ajustez une courbe sigmoïde à la réponse et, à partir de cette courbe, calculez la concentration en sodium pour laquelle la valeur alpha est de 0,5. Celle-ci représente la concentration en sodium à laquelle le capteur répond de manière optimale. À l’aide de ces informations, ajustez le rapport entre l’ionophore de sodium X, le TFPB de sodium et le chromoionophore 4 trois dans l’opto afin de créer des nanocapteurs ayant la concentration optimale en sodium.Par exemple, les courbes de réponse du capteur de type hero de cinq jeux de nanocapteurs différents représentant diverses formulations optiques, ne différant que par la quantité de sodium de quatre 10. Pour l'imagerie intracellulaire, remplacez le milieu cellulaire par un milieu clair tel que la solution de Tyrode et transférez les cellules dans une chambre d'imagerie. Remplissez ensuite par capillarité une micropipette en verre étirée avec une solution de nanocapteur préparée à cinq milligrammes par millilitre de glucose dans l'eau.Ensuite, fixez la pipette à un micromanipulateur et connectez-la à un système d'injection contrôlé par pression. Abaissez la pipette au-dessus de la cellule et dans le cytoplasme. Parfois, il est nécessaire de tapoter le support du manipulateur pour percer la membrane.Injectez quelques centaines de picolitres de solution de nanosenseur puis retirez rapidement la pipette. Anesthésiez une souris nude CD1 à l'isoflurane à l'aide d'une chambre d'anesthésie. Une fois anesthésiée, placez la souris dans une chambre d'imagerie désinfectée.Ensuite, remplir une seringue stérile pour insuline de calibre 31 avec 10 microlitres de nanosenseurs ayant la constante de dissociation (KD) appropriée dans du PBS à 10 millimolaire. Veiller à éliminer toutes les bulles d'air à l'aide de pinces. Saisir un petit pli de peau le long du dos de la souris au site d'injection souhaité tout en maintenant la peau.Insérez la seringue dans la peau avec le biseau vers le haut et l'aiguille parallèle à la peau. Tirez ensuite doucement sur le piston de la seringue pour vous assurer que l'aiguille ne se trouve pas dans un vaisseau sanguin. Pour minimiser la pression arrière, déplacez délicatement l'aiguille vers la droite et la gauche afin de créer une poche sous la peau.Ensuite, injectez les capteurs et retirez doucement la seringue. Appliquez délicatement une pression sur le site d'injection et essuyez toute solution qui aurait pu s'échapper par le site d'injection. Généralement, six injections régulièrement espacées sont réalisées le long du dos.Si l'expérience est réalisée sur différentes souris, changer l'aiguille afin de minimiser la transmission de maladies et les contaminations croisées. Après les injections, acquérir des images en champ clair et en fluorescence à l’aide de jeux de filtres correspondant étroitement au spectre d’excitation-émission des nanosenseurs. Cela permet également de réduire l’autofluorescence de la peau.Ces cardiomyocytes néonatals ont été cultivées sur un lamelle et injectées avec des nanosenseurs de sodium. Cette image fluorescente est réalisée à une longueur d'onde d'excitation de 639 nanomètres. Il s'agit d'une image en champ clair des mêmes cellules, et ceci est une superposition des deux images.Il existe un certain regroupement des capteurs, mais les cellules présentent une morphologie normale. Les capteurs se sont diffusés dans tout le cytosol et il n'y a pas de marquage nucléaire. Cette superposition d'une image en champ clair et d'une image fluorescente montre neuf injections sous-cutanées différentes de nanocapteurs sodiques dans l'espace sous-cutané d'une souris nue.Une fois que la fabrication de nanosenseurs par la méthode Masten peut être réalisée en quelques minutes si elle est correctement effectuée, elle peut s'appliquer à toute recherche visant à mesurer en temps réel le flux réversible d'un analyte. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment charger des nanosenseurs dans l'espace intracellulaire ou sous-cutané afin d'effectuer des mesures quantitatives dans un environnement biologique.

fluorescent-nanoparticles-for-measurement-ion-concentration

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Dans cet article, nous décrivons comment nous obtenons FRET traces de molécules individuelles d'ADN immobilisés sur une surface en utilisant un microscope confocal à balayage automatisé.

Système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée Biomolécules

Droplet plates-formes basées microfluidiques sont des candidats prometteurs pour l'expérimentation à haut débit car ils sont capables de générer picolitres, auto-compartimentées vaisseaux moindre coût aux cadences kHz. Grâce à l'intégration rapide, sensible et haute résolution de fluorescence des méthodes spectroscopiques, les grandes quantités de données générées au sein de ces systèmes peut être efficacement extraite, exploité et utilisé.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

Les détails qui suivent l'approche de configuration de piégeage faible puissance optique diélectrique des nanoparticules à l'aide d'un double-nanotrou dans le film métallique.

Le piégeage optique de nanoparticules

Cette vidéo présente une technique permettant de détecter les contaminants bactériens dans des échantillons d’aliments et d’eau à l’aide de nanocapteurs. Les bactéries pathogènes cibles sont détectées par une combinaison de relaxation magnétique et de modalités d’émission de fluorescence.

Détection de la contamination bactérienne à l’aide de nanocapteurs magnétofluorescents

L'analyse de l'interaction des nanoparticules avec des sous-populations de cellules immunitaires définies par cytométrie de flux.

Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

Fluorophores simples peuvent être localisés avec une précision nanométrique en utilisant FIONA. Voici un résumé de la technique FIONA est rapporté, et comment réaliser des expériences Fiona est décrit.

L&#39;imagerie de fluorescence avec un nanomètre Précision (FIONA)

L’utilisation des fluorophores pour l’imagerie in vivo peut être considérablement limitée par l’opsonisation, la clairance rapide, la faible sensibilité de détection et les effets cytotoxiques sur l’hôte. L’encapsulation des fluorophores dans les liposomes par hydratation et extrusion du film conduit à l’extinction et à la protection de la fluorescence, ce qui permet une imagerie in vivo avec une sensibilité de détection élevée.

Fluorescence-trempe d'un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de In Vivo Imagerie optique

Ce manuscrit décrit une nouvelle technique qui permet la détection de l’expression génique intracellulaire après endocytose de nanoparticules marquées par fluorescence directement dans des cellules vivantes. La méthode ne nécessite pas de manipulation des cellules et n’est pas limitée par rapport au gène ou à l’espèce cible.

Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

Le présent protocole décrit une opération détaillée d’imagerie par fluorescence NIR-II en temps réel d’une souris à l’aide d’un dispositif d’imagerie optique NIR-II.

Une sonde de fluorescence NIR-II brillante pour l’imagerie vasculaire et tumorale

Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation de nanobilles de points quantiques (QDNB) et la détection de biomarqueurs de maladies à l’aide de bandelettes d’immunodosage à flux latéral basées sur QDNB. Les résultats des tests peuvent être évalués qualitativement sous un éclairage à la lumière UV et mesurés quantitativement à l’aide d’un lecteur de bande fluorescente dans les 15 minutes.

Immunodosage fluorescent à flux latéral basé sur des nanobilles de points quantiques

Découvrez la fabrication de nanocapteurs de sodium fluorescents pour l'imagerie ionique in vitro et in vivo. Cette méthode permet des mesures quantitatives précises dans les myocytes cardiaques et les modèles murins.

Nanoparticules fluorescentes pour la mesure de la concentration d'ions dans les systèmes biologiques

Explorer plus de vidéos