Nanoparticules fluorescentes pour la mesure de la concentration d'ions dans les systèmes biologiques

L'objectif général de l'expérience suivante est de fabriquer des nanosenseurs de sodium destinés à des applications in vitro et in vivo. Cette étape est réalisée en préparant un mélange opto contenant les composants du capteur pour les nanosenseurs. Dans un deuxième temps, un tensioactif est soniqué dans une solution aqueuse afin d'obtenir une distribution homogène, ce qui permettra la formation de nanosenseurs lorsque le mélange opto sera ajouté.

Ensuite, le mélange opto est ajouté au mélange aqueux de tensioactif sous sonication afin de former les nanocapteurs en solution. Cette vidéo montre que la réponse du capteur est ajustable. Les capteurs peuvent être micro-injectés dans des myocytes cardiaques et peuvent également être injectés par voie sous-cutanée chez des souris.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les colorants indicateurs fluorescents, est que nous pouvons ajuster les capteurs à une plage dynamique correspondant à l'environnement physiologique, mesurer une gamme plus étendue d'analytes et effectuer des mesures ratiométriques pour une analyse quantitative. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car une fois les capteurs fabriqués, il peut sembler intimidant de les introduire dans un environnement biologique. Des stocks de sel sec de sodium ion four x, de TFPB sec de sodium et de chromo four trois doivent être préparés à l'avance avant la fabrication de l'opto, conformément au protocole écrit.

Dans une hotte, mélanger tous les matériaux dans un flacon en verre de 1,5 millilitre. À l’aide d’un bouchon vissable revêtu de téflon, agiter doucement le flacon au vortex jusqu’à ce que tout le PVC soit dissous. La solution doit apparaître rouge.

Commencez la fabrication des nanosenseurs en ajoutant 100 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de lipide Peg dans un flacon en verre de quatre grammes. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de la solution aqueuse souhaitée, comme du hippies à 10 millimolaire.

Synchronisez une pointe de fornication de sept millimètres dans le flacon à l’aide d’un palan de laboratoire et appliquez une faible puissance de sonication pendant 30 secondes. Dans un tube de 0,6 millilitre, mélangez 50 microlitres du matériau opto et 50 microlitres de dichlorométhane à l’aide de la pipette afin d’assurer un mélange homogène. Ensuite, commencez une sonication de trois minutes.

Au début de la sonication, ajoutez 100 microlitres du mélange opto en immergeant la pointe de pipette et en délivrant le volume total en une seule injection rapide et uniforme. La solution deviendra bleue si le pH dépasse sept, et s’il n’y a pas de sodium pour éliminer le THF résiduel et le dichlorométhane de la solution. Placez la pointe du sonicateur à une profondeur de deux millimètres.

Pendant les trois minutes restantes, la solution deviendra opaque. Une fois la sonication terminée, aspirez la solution de nanosenseur dans une seringue de cinq millilitres. Fixez un filtre et distribuez la solution de nanosenseur dans un flacon en verre muni d'un bouchon à vis.

Commencez par préparer 10 solutions à concentration croissante de sodium, par rapport auxquelles la sensibilité du nanodétecteur pourra être mesurée. Mélangez des solutions mères de sodium à zéro molaire et à un molaire dans des tubes coniques de 50 millilitres. Ensuite, dans une plaque optique 96 puits, ajoutez 100 microlitres de chaque concentration de sodium à trois puits d'une même colonne.

Ensuite, ajouter 100 microlitres de nanosenseurs fraîchement préparés dans chaque puits, charger la plaque dans un fluorimètre pour microplaque et saisir les longueurs d'onde d'excitation, d'émission et de coupure qui sont idéales pour le chromophore utilisé. Le choix des longueurs d'onde mesurées dépend de l'application. Ces longueurs d'onde permettent des mesures intracellulaires de la dynamique rapide ou une réduction du bruit.

Pour obtenir les valeurs d'alpha, divisez le rapport d'intensité à 570 nanomètres par l'intensité à 670 nanomètres ou à 680 nanomètres. Tracez les valeurs d'alpha en fonction du logarithme de la concentration en sodium. Fixez le logarithme de la concentration nulle en sodium à moins un.

À présent, ajustez une courbe sigmoïde à la réponse et, à partir de cette courbe, calculez la concentration en sodium pour laquelle la valeur alpha est de 0,5. Cela représente la concentration en sodium à laquelle le capteur répond de manière optimale. À l’aide de ces informations, ajustez le rapport entre l’ionophore de sodium X, le TFPB de sodium et le chromoionophore 3 dans l’optode afin de créer des nanocapteurs avec la concentration optimale de sodium.

Par exemple, courbes de réponse du capteur de cinq jeux de nanocapteurs différents représentant différentes formulations optiques, ne différant que par la quantité de sodium de quatre 10. Pour l'imagerie intracellulaire, remplacer le milieu cellulaire par un milieu clair comme la solution de Tyrode et transférer les cellules dans une chambre d'imagerie. Remplir ensuite par capillarité une micropipette en verre tirée avec une solution de nanocapteur préparée à cinq milligrammes par millilitre de glucose dans l'eau.

Ensuite, fixez la pipette à un micromanipulateur et connectez-la à un système d'injection contrôlé par pression. Abaissez la pipette au-dessus de la cellule et dans le cytoplasme. Parfois, il est nécessaire de tapoter le support du manipulateur pour percer la membrane.

Injectez quelques centaines de picolitres de solution de nanosenseur puis retirez rapidement la pipette. Anesthésiez une souris nude CD1 à l'isoflurane à l'aide d'une chambre d'anesthésie. Une fois anesthésiée, placez la souris dans une chambre d'imagerie désinfectée.

Ensuite, remplir une seringue stérile pour insuline de calibre 31 avec 10 microlitres de nanosenseurs ayant la constante de dissociation (KD) appropriée dans du PBS à 10 millimolaire. Veiller à éliminer toutes les bulles d'air à l'aide de pinces. Saisir un petit pli de peau le long du dos de la souris au site d'injection souhaité tout en maintenant la peau fermement.

Insérez la seringue dans la peau avec le biais orienté vers le haut et l'aiguille parallèle à la peau. Tirez ensuite doucement sur le piston de la seringue pour vous assurer que l'aiguille n'est pas introduite dans un vaisseau sanguin. Pour minimiser la pression de reflux, déplacez délicatement l'aiguille vers la droite et la gauche afin de créer une poche sous la peau.

Ensuite, injectez les capteurs et retirez doucement la seringue. Appliquez délicatement une pression sur le site d'injection et essuyez toute solution qui aurait pu s'échapper du site d'injection. Généralement, six injections régulièrement espacées sont réalisées le long du dos.

Si l'expérience est réalisée sur des souris différentes, changer l'aiguille afin de minimiser la maladie, la transmission et la contamination croisée. Après les injections, acquérir des images en champ clair et en fluorescence à l'aide de jeux de filtres correspondant étroitement au spectre d'excitation-émission des nanocapteurs. Cela permet également de minimiser l'autofluorescence de la peau.

Ces cardiomyocytes néonatales ont été cultivées sur un lamelle et injectées avec des nanosenseurs de sodium. Cette image fluorescente est obtenue avec une longueur d'onde d'excitation de 639 nanomètres. Ceci est une image en champ clair des mêmes cellules, et ceci est une superposition des deux images.

Il existe un certain regroupement des capteurs, mais les cellules présentent une morphologie normale. Les capteurs se sont diffusés dans tout le cytosol et il n'y a pas de marquage nucléaire. Cette superposition d'une image en champ clair et d'une image fluorescente montre neuf injections sous-cutanées différentes de nanocapteurs sodiques dans l'espace sous-cutané d'une souris nue.

Une fois maîtrisée, la fabrication de nanosenseurs par la méthode Masten peut être réalisée en quelques minutes si elle est correctement effectuée, et s'applique à n'importe quelle recherche visant à mesurer en temps réel et de façon réversible le flux d'un analyte. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment charger des nanosenseurs dans l'espace intracellulaire ou sous-cutané afin d'effectuer des mesures quantitatives dans un environnement biologique.