Polymères à mémoire de forme pour la Culture cellule active

L'objectif général de cette procédure est de cultiver des cellules sur un substrat dont la topographie évolue dans le temps. Cela est réalisé en programmant d'abord un polymère à mémoire de forme selon une forme permanente pouvant être « mémorisée ». Le polymère à mémoire de forme est ensuite programmé en une forme temporaire sur laquelle les cellules sont par la suite ensemencées.

La dernière étape de la procédure consiste à déclencher le retour du polymère à mémoire de forme vers sa forme permanente en augmentant la température ; des résultats finaux peuvent alors être obtenus, montrant un changement du comportement cellulaire par microscopie de fluorescence. Bonjour, je m'appelle Pat Mather. Je suis professeur en génie biomédical et chimique, ainsi que directeur de l'Institut des biomatériaux de Syracuse à l'Université de Syracuse.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux appareils commerciaux ou sur mesure permettant d'étirer les cellules réside dans le fait que, grâce à un seul système polymère, nous sommes capables d'appliquer aux cellules une grande variété de contraintes complexes. Je m'appelle Jay Henderson. Je suis professeur adjoint en génie biomédical et chimique, et membre de l'Institut des biomatériaux de Syracuse.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanobiologie, comme la manière dont les cellules réagissent aux changements dynamiques de leur environnement physique. Je m'appelle Kevin Davis et je suis étudiant au doctorat à l'Université de Syracuse, au sein du département de génie biomédical et de génie chimique. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la biologie mécanique en 2D, elle peut également être utilisée pour d'autres systèmes, tels que des échafaudages changeant de forme en 3D pour l'ingénierie tissulaire.

Avant de commencer cette procédure, préparez une chambre de polymérisation sur mesure à l’aide d’une lame de verre, d’un espaceur en téflon d’un millimètre d’épaisseur et d’une plaque en aluminium. Fixez la chambre à l’aide de petits pinces à rabats au départ, puis injectez la NOA 63 dans la chambre par un trou dans l’espaceur en téflon à l’aide d’une aiguille de calibre 18. Ensuite, placez la chambre sur un bloc chauffant réglé à 125 degrés Celsius.

Laisser la chambre chauffer à une température uniforme pendant cinq minutes après le chauffage de la chambre. Polymériser le NOA 63 pendant 20 minutes en plaçant une lampe UV à 6,5 centimètres de la surface du verre. Retirer le NOA 63 de la chambre tout en étant encore chaud à l’aide d’un scalpel.

Ensuite, effectuez la post-cure du polymère à mémoire de forme sous lumière UV pendant trois heures et quarante minutes directement sur la plaque chauffante à 125 degrés Celsius. Pour caractériser la mémoire de forme du NOA 63, préparez un éprouvette en forme de 8 en comprimant à chaud le film durci à l’aide d’un poinçon personnalisé. Enfin, placez l’éprouvette dans un analyseur mécanique dynamique équipé d’un dispositif de traction.

Configurer l'appareil en mode contrôlé par force et programmer la procédure d'essai conformément au protocole écrit accompagnant cette vidéo. Le résultat de la procédure est un polymère à mémoire de forme réticulé de manière isotherme, ou film SMP. Placer le CSMP sur une plaque chauffante et régler la température à une valeur supérieure à la température de transition vitreuse afin de réduire le module et faciliter la découpe. Pour préparer des échantillons individuels à partir du film SMP réticulé de manière isotherme.

Couper le film s et p avec un rasoir à la taille d'échantillon souhaitée. La forme temporaire peut être fixée de plusieurs manières différentes. Ici, une presse hydraulique de banc équipée de plaques pouvant être chauffées et refroidies est utilisée pour gaufrer une topographie temporaire.

Commencez par régler la température des PLA à une température supérieure à la température de transition vitreuse (tg). Pour cette démonstration, un emboutisseur a été fabriqué en durcissant de l'époxy sur un disque vinyle afin de produire une forme temporaire de sillons parallèles. L'emboutisseur peut être fabriqué à partir d'autres matériaux et avec différentes topographies, mais il doit être plus rigide que le NOA 63.

À la température de gaufrage, placer les échantillons s et p face vers le bas sur le gaufreur. Ensuite, placer les échantillons et le gaufreur dans la presse. Appliquer une précharge d'environ 100 kilopascals pour établir le contact entre les PLA chauffants et les échantillons, puis maintenir pendant environ cinq minutes afin que les échantillons atteignent une température uniforme.

Une fois la température uniforme atteinte, appliquez de un à six mégapascals aux échantillons et maintenez pendant une minute. Le SMP se fracturera. Si une contrainte plus élevée est appliquée.

Appliquer des contraintes plus faibles pour induire des topographies d'amplitudes plus petites. Après l'application de la pression, réduire la température en dessous de la température de transition vitreuse (Tg) à l'aide de la fonction de refroidissement par eau de la presse. Lorsque la température est inférieure à la Tg, supprimer la force appliquée avant de commencer l'expérience de culture cellulaire active.

La lumière UV de la cabine de sécurité biologique est utilisée pour stériliser les échantillons. Disposez les échantillons face vers le bas dans des boîtes stériles sans couvercle, puis allumez la lumière UV pendant six heures. Ensuite, retournez les échantillons dans de nouvelles boîtes stériles en position face vers le haut.

Activer la lumière UV pendant six heures supplémentaires. Les échantillons doivent être équilibrés à un état relativement stable avant la mise en culture avec les cellules. Placer les échantillons dans une plaque de 96 puits et ajouter 150 microlitres de milieu de croissance complet.

Milieu par puits. Placer la plaque dans une étuve à 30 degrés Celsius avec 5 % de CO2 jusqu'à l'obtention d'une récupération partielle souhaitée. Pour cette démonstration, les échantillons sont incubés pendant 30 heures afin de produire une amplitude suffisamment importante pour aligner les cellules.

Une fois la récupération partielle obtenue, les échantillons peuvent être ensemencés avec des cellules. Placer les échantillons dans une nouvelle plaque de 96 puits. Ensuite, ajouter 150 microlitres de solution cellulaire à chacun des échantillons ici, C3 H 10 t et demi.

La plupart des fibroblastes embryonnaires sont utilisés à une concentration de 20 000 cellules par millilitre. Pour obtenir des cellules isolées, laissez les cellules s'attacher et s'étaler sur la topographie temporaire en les incubant à 30 degrés Celsius pendant 9,5 heures. Ensuite, analysez la morphologie cellulaire avant la transition en prélevant des échantillons et en effectuant une coloration ainsi qu'une imagerie de fluorescence des échantillons.

Ce matériau présente une autofluorescence dans la plupart des plages UV et visible ; des fluorochromes situés à l'extrémité rouge éloignée du spectre, tels qu'Alexa Fluor 6 47, sont donc recommandés afin de réduire le fond. Pour déclencher la récupération des échantillons, déplacez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et poursuivez la culture pendant 19 heures. Cela permet au matériau de se rétablir et aux cellules de s'adapter morphologiquement à la nouvelle topographie. Après incubation, appliquez les colorations appropriées, comme la phalloïdine, pour l'imagerie de l'actine filamenteuse.

Comme étape finale, les cellules peuvent être imagées sur la nouvelle topographie illustrée ici, qui correspond à la mémoire de forme globale d'une seule polymérisation de NOA 63. Répété trois fois, où l'astérisque indique le début expérimental de la polymérisation. Le NOA 63 est un solide transparent et vitreux possédant d'excellentes propriétés de mémoire de forme.

Dans ce cas, le matériau a été durci et présente une température de transition vitreuse uniforme de 51,1 degrés Celsius, déterminée à partir du début de la chute du module d'entreposage. La chute de déformation observée ici se produit à la tg mesurée. Un grand pourcentage des 4,7 % de déformation appliquée a été fixé après déchargement à 20 degrés Celsius, correspondant à un taux de fixation de 89,3 %. La déformation fixée a ensuite été récupérée à un taux de 84,4 % dans un intervalle de température relativement faible durant le chauffage.

Les performances de mémoire de forme n'ont montré aucune détérioration jusqu'à trois cycles, comme en témoignent toutes les courbes suivant presque exactement le même trajet. L'amplitude de la topographie temporaire diminue au fil du temps à 30 degrés Celsius en 30 heures. À 30 degrés Celsius.

L'amplitude a été réduite d'environ 50 %, indiqué ici au temps zéro. Elle diminue encore de 10 % au cours des 9,5 heures suivantes. Lorsque la récupération est déclenchée par une augmentation de la température à 37 degrés Celsius, l'amplitude se réduit à 0,5 % de l'amplitude initiale en 9,5 heures pour le repousseur utilisé et une contrainte de repoussage de 4,9 mégapascals.

Cela correspond à un changement fonctionnel allant de rainures de 13 micromètres à une surface presque plane. Ce polymère retrouve sa forme dans la plage de température de 30 à 37 degrés dans des conditions de culture cellulaire. Ceci est dû à l'absorption d'eau provenant du milieu de culture ; l'eau plastifie le polymère, ce qui abaisse la température de transition vitreuse (tg), permettant ainsi la récupération à des températures inférieures à la tg à sec de 51 degrés.

Un exemple de comportement cellulaire contrôlé par l'utilisation de substrats de culture cellulaire actifs est un changement de l'organisation du cytosquelette sur des substrats provisoirement rainurés. Avant le déclenchement de la récupération, les microfilaments d'actine s'alignent selon la direction des rainures. Après la récupération par augmentation de la température, les microfilaments se sont réorganisés et présentent une orientation aléatoire.

En revanche, les échantillons témoins présentant des motifs statiques, plats ou des sillons fixes ne se réorganisent pas après une augmentation de la température. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l’esprit que la géométrie de la chambre de polymérisation, la température de transition du polymère, la méthode de fixation de la déformation et la composition du polymère lui-même peuvent tous être ajustés afin d’obtenir la transition souhaitée dans votre propre expérience en suivant cette procédure. D'autres méthodes, telles que la PCR en temps réel, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, comme l’évolution de l’expression génique en réponse à la stimulation mécanique provenant du substrat après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la mécanobiologie cellulaire pour étudier le cytosquelette cellulaire, le réarrangement et la physique de la matière molle en deux dimensions. Merci pour votre intérêt porté à nos travaux et merci d'avoir regardé.