Polymères à mémoire de forme pour la Culture cellule active

L’objectif global de cette procédure est de cultiver des cellules dans un substrat dont la topographie change au fil du temps. Pour ce faire, il suffit d’abord de programmer un polymère à mémoire de forme en une forme permanente qui peut être mémorisée. Le polymère à mémoire de forme est ensuite programmé dans une forme temporaire sur laquelle les cellules sont ensuite plaquées.

La dernière étape de la procédure consiste à déclencher le polymère à mémoire de forme pour qu’il reprenne sa forme permanente en augmentant la température, ce qui permet d’obtenir des résultats montrant un changement de comportement cellulaire grâce à la microscopie à fluorescence. Bonjour, je m’appelle Pat Mather. Je suis professeur de génie biomédical et chimique et directeur de l’Institut des biomatériaux de Syracuse, ici à l’Université de Syracuse.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux appareils commerciaux ou personnalisés pour l’étirement des cellules est que dans un seul système polymère, nous sommes en mesure d’appliquer une grande variété de souches complexes aux cellules. Je m’appelle Jay Henderson. Je suis professeur adjoint de génie biomédical et chimique et membre de l’Institut des biomatériaux de Syracuse.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanobiologie, telles que la façon dont les cellules réagissent aux changements dynamiques de leur environnement physique. Je m’appelle Kevin Davis et je suis doctorant à l’Université de Syracuse au Département de génie biomédical et de génie chimique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la biologie mécanique 2D, elle peut également être utilisée pour d’autres systèmes tels que les échafaudages 3D à changement de forme pour l’ingénierie tissulaire.

Avant de commencer cette procédure, préparez une chambre de durcissement personnalisée à l’aide d’une lame de verre, d’une entretoise en téflon d’un millimètre d’épaisseur et d’une plaque d’aluminium. Fixez la chambre à l’aide de petites pinces à reliure pour commencer, injectez du NOA 63 dans la chambre par un trou dans l’entretoise en téflon à l’aide d’une aiguille de calibre 18. Placez ensuite la chambre dans une plaque chauffante réglée à 125 degrés Celsius.

Laissez la chambre chauffer à une température uniforme pendant cinq minutes après le chauffage de la chambre. Procurez-vous le NOA 63 pendant 20 minutes en plaçant une lampe UV à 6,5 centimètres de la surface du verre. Retirez le NOA 63 de la chambre alors qu’il est encore chaud à l’aide d’une lame de rasoir.

Ensuite, post-polymérisez le polymère à mémoire de forme sous la lumière UV pendant trois heures et 40 minutes directement sur la plaque chauffante à 125 degrés Celsius. Pour caractériser la mémoire de forme du NOA 63, préparez un échantillon d’haltère en pressant à chaud le film durci avec un poinçon personnalisé. Enfin, transformez l’échantillon en un analyseur mécanique dynamique avec dispositif de traction.

Réglez l’instrument sur le mode contrôlé forcé et programmez la procédure de test comme indiqué dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Le résultat de la procédure est un polymère à mémoire de forme isothermique ou un film SMP : placez le CSMP dans une plaque chauffante et réglez la température à un niveau supérieur à la température de transition vitreuse afin de réduire le module et de faciliter la coupe. Préparer des échantillons individuels à partir des films s et p durcis isothermiblement.

Coupez les films s et p avec un rasoir à la taille d’échantillon souhaitée. La forme temporaire peut être fixée de différentes manières. Ici. Une presse hydraulique de paillasse avec des plateaux qui peuvent être chauffés et refroidis est utilisée pour gaufrer une topographie temporaire.

Tout d’abord, réglez la température des PLA à une température supérieure à la tg. Pour cette démonstration, un embosseur a été fabriqué en durcissant de l’époxy sur un disque vinyle pour produire une forme temporaire de rainures parallèles. L’embosseur peut être fabriqué à partir d’autres matériaux et avec des topographies différentes, mais doit être plus rigide que le NOA 63.

À la température de gaufrage, placez les échantillons s et p face vers le bas sur l’embosseuse. Placez ensuite les échantillons et l’embosseur dans la presse. Appliquez une précharge d’environ 100 kilogrammes de pascals pour établir le contact entre les PLA chauffants et la tenue des échantillons pendant environ cinq minutes pour permettre aux échantillons d’atteindre une température uniforme.

Une fois qu’une température uniforme est atteinte, appliquez un à six mégapascals sur les échantillons et maintenez-les pendant une minute. Le SMP va se fracturer. Si une contrainte plus importante est appliquée.

Appliquez des contraintes plus petites pour introduire des topographies avec des amplitudes plus petites. Une fois la pression appliquée, réduisez la température en dessous du TG en utilisant la capacité de refroidissement par eau des plaats de presse. Lorsque la température est inférieure à la tg, retirez la force appliquée avant de commencer l’expérience de culture cellulaire active.

La lumière UV de l’enceinte de sécurité biologique est utilisée pour stériliser les échantillons. Disposez les échantillons face vers le bas dans des boîtes stériles sans couvercles et allumez la lumière UV pendant six heures. Ensuite, retournez les échantillons dans de nouvelles boîtes stériles en position face vers le haut.

Allumez la lumière UV pendant six heures supplémentaires. Les échantillons doivent être équilibrés à un état relativement stable avant d’être plaqués avec des cellules. Placez les échantillons dans une plaque à 96 puits et ajoutez 150 microlitres de croissance complète.

Moyen par puits. Placez la plaque dans un incubateur à 30 degrés Celsius avec 5 % de CO2 jusqu’à ce que la récupération partielle souhaitée atteigne. Pour cette démonstration, les échantillons sont incubés pendant 30 heures afin de produire une amplitude suffisamment grande pour aligner les cellules.

Une fois la récupération partielle obtenue, les échantillons peuvent être plaqués avec des cellules. Placez les échantillons dans une nouvelle plaque à 96 puits. Ajoutez ensuite 150 microlitres de solution cellulaire à chacun des échantillons ici, C3 H 10 t et demi.

La plupart des fibroblastes embryonnaires sont utilisés à 20 000 cellules par millilitre. Pour obtenir des cellules isolées, laissez les cellules se fixer et se propager sur la topographie temporaire en incubant à 30 degrés Celsius pendant 9,5 heures. Ensuite, testez la morphologie cellulaire avant la transition en prélevant des échantillons et en effectuant une coloration et une imagerie de fluorescence des échantillons.

Ce matériau présente une autofluorescence dans la plupart des rayons UV et visibles. Il est recommandé de réduire l’arrière-plan pour déclencher la récupération des échantillons, de déplacer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et de poursuivre la culture pendant 19 heures. Cela permet à la matière de se rétablir et aux cellules d’adapter leur morphologie à la nouvelle topographie. Après l’incubation, appliquez les colorants appropriés tels que la falline pour l’imagerie de l’actine filamenteuse.

Comme dernière étape, les cellules peuvent être imagées sur la nouvelle topographie montrée ici est la mémoire de forme unidirectionnelle en vrac d’un seul remède NOA 63. Répété trois fois où l’astérisque indique un début expérimental guéri. NOA 63 est un solide transparent et vitreux qui possède d’excellentes propriétés de mémoire de forme.

Dans ce cas, le matériau a été durci et présente une TG uniforme de 51,1 degrés Celsius, déterminée dès le début de la baisse du module de stockage. La baisse de déformation observée ici se produit au tg mesuré. Un grand pourcentage de la déformation appliquée de 4,7 % a été fixé après décharge à 20 degrés Celsius, ce qui correspond à un rapport de fixation de 89,3 %. La déformation fixe a ensuite été récupérée à un rapport de 84,4 % dans une plage de température relativement petite pendant le chauffage.

Les performances de la mémoire de forme n’ont montré aucune détérioration jusqu’à trois cycles, comme en témoigne le fait que toutes les courbes suivent presque exactement le même chemin. L’amplitude de la topographie temporaire diminue au fil du temps à 30 degrés Celsius de 30 heures. À 30 degrés Celsius.

L’amplitude a été réduite d’environ 50 % indiquée ici au temps zéro. Il réduit encore 10 % au cours des 9,5 prochaines heures. Lorsque la récupération est déclenchée par l’augmentation de la température à 37 degrés Celsius, l’amplitude est réduite à 0,5 % de l’amplitude initiale en 9,5 heures pour l’embosseuse utilisée et une contrainte de gaufrage de 4,9 mégapascals.

Cela correspond à un changement fonctionnel de 13 micromètres de rainures en une surface presque plane. Ce polymère récupère dans la plage de température de 30 à 37 degrés dans des conditions de culture cellulaire. Cela est dû à l’absorption d’eau du milieu de culture, le plastique de l’eau dimensionne le polymère, ce qui abaisse le tg, permettant la récupération à des températures inférieures au TG sec de 51 degrés.

Un exemple de comportement cellulaire contrôlé par l’utilisation de substrats de culture cellulaire actifs est une modification de l’organisation du cytosquelette sur des substrats rainurés temporaires. Avant que la récupération ne soit déclenchée, les microfilaments d’actine s’alignent dans la direction des rainures. Après récupération par augmentation de la température, les microfilaments se sont réorganisés et sont orientés de manière aléatoire.

À l’inverse, les échantillons témoins qui ont des rainures statiques, plates ou statiques ne se réorganisent pas après une augmentation de la température. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la géométrie de la chambre de durcissement, la température de transition du polymère, la méthode de fixation de la déformation et la composition du polymère lui-même peuvent toutes être ajustées pour obtenir la transition souhaitée dans votre propre expérience en suivant cette procédure. D’autres méthodes, telles que la PCR en temps réel, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont l’expression des gènes change en réponse à la stimulation mécanique du substrat après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la mécanobiologie cellulaire pour étudier le cytosquelette, le réarrangement et la physique de la matière molle cellulaire en deux dimensions. Merci de l’intérêt que vous portez à notre travail et merci de nous avoir regardés.