Name: Low-Cost Cryo-Lumière de fabrication étape par microscopie lumineuse corrélées / Electron Microscopy (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Découvrez la fabrication d'une platine cryogénique à faible coût pour microscopie à lumière réfléchie. Cette méthode permet une imagerie corrélative efficace entre cryo-lumière et cryo-microscopie électronique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier le juge Brandon Zipp et Ken B. Kaplan pour l&#39;accès à la souche de levure utilisée dans cette étude. Les auteurs remercient également Julio Dominguez Lénine-Ramirez à l&#39;aide d&#39;enregistrements vidéo. JEE reconnaît le soutien financier du NIH numéro de subvention 5RC1GM91755.

1. Fabrication et montage <ol><li> Placez le dissipateur thermique en aluminium à l'intérieur du 22,96 cm (9 ") moule à tarte d'environ 2 cm du côté de la poêle, comme le montre la figure 1c aide d'un marqueur noir, marque pour les trous de dissipateur thermique en aluminium Remarque:.. Si l'aluminium bloc (acheté dans un magasin de ferrailles locales ou en ligne à <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) ne vient pas avec trous pré-percés, vous aurez besoin de prendre des dispositions pour avoir des trous percés et fraisés avant l'étape 1 pour obtenir de l'aluminium bloc à l'assiette à tarte. Nous avons utilisé 5 trous pour fixer le bloc à la plate-forme et 4 trous supplémentaires pour permettre aux bulles de gaz azote pour sortir du sous de l'aluminium. </li><li> Placez la boîte cryo-réseau à proximité de l'emplacement du puits de chaleur en aluminium et de marquer l'encoche et de chaque côté. </li><li> Percez des trous pour chaque position marquée en utilisant un bit # 17 trous de forage pour le radiateur en aluminium et un peu # 35 trous de forage pour le boîtier cryo-grille. </li><li> Montez le dissipateur thermique en aluminium avec 5 - # 10, 1,9 cm (3 / 4 ") à tête plate fendue boulons et écrous correspondants, ainsi que 15 - # 10 rondelles Placer deux rondelles en dessous du bloc en aluminium et le troisième à l'arrière de l'. moule à tarte pour chaque billet de trou:. surplombs non garantis du bloc en aluminium à proximité de la zone de visualisation peut entraîner des vibrations qui limitent les capacités d'imagerie de la scène Assurez-vous que tous les boulons de fixation sont bien serrées.. </li><li> Insérer 3 - # 4, 0,95 cm (3 / 8 ") autour des boulons et des écrous à fente correspondante de l'arrière du moule à tarte d'agir comme la boîte de cryo-grille de montage. </li><li> Tape 4 baguettes en binôme avec un autre sommet baguettes. Ruban à chaque paire de bords opposés du moule à gâteau à agir comme des entretoises. </li><li> Mouiller la surface supérieure et inférieure du gâteau et la tarte aux casseroles respectivement avec ddH 2 O. </li><li> Remplir le moule à cake avec deux couches de mousse isolante pulvérisée. Mouillant chaque couche avant d'aller à l'étape suivante. </li><li> Appuyez sur le moule à tarte dans la mousse. </li><li> Retourner les casseroles à l'envers et appuyez sur le moule à gâteau jusqu'à ce que le entretoises contacter le moule à tarte. Placez tous les objets pondérés au sommet de la moule à cake et laissez reposer toute la nuit pour guérir. </li><li> Avec un couteau dentelé, couper l'excès de pulvérisation de mousse isolante secs à partir du bord de la casseroles et enlever les baguettes. </li><li> Retirez le moule à gâteau de la moule à tarte. Le moule à tarte avec dissipateur thermique en aluminium est maintenant isolé et sera appelé le "étage cryotechnique» (figure 1a). </li><li> Placez une planchette à pince en plastique transparent (n'importe quelle couleur et plus de 3 mm d'épaisseur) sur le dessus de l'étage cryotechnique. Marquer avec un marqueur noir l'emplacement de la boîte de montage cryo-grille en dessinant un cercle d'environ 1,5 fois le diamètre d'un seul tour cryo-grille de la boîte. Découpez le trou avec un 1,9 cm (3 / 4 ") le trou vu. Ce presse-papier sera appelé le" écran de chargement "(Fig 1b). </li><li> Mettre un nouveau presse-papiers transparents au-dessus de l'étage cryogénique et le placer sur le microscope avec le dissipateur de chaleur directement sous lentilles de l'objectif. Avec un marqueur noir, marque le chemin des objectifs de leur rotation. </li><li> Coupez le long de la ligne marquée suppression d'un demi-cercle du bord de la planchette. Ceci peut être accompli avec une scie sauteuse ou en utilisant un 7,62 cm (3 ") le trou a vu plusieurs fois, comme indiqué dans la vidéo. </li><li> Enfin couper un trou de 1,9 cm (3 / 4 ") de demi-cercle, mais toujours dans la zone de l'antenne. Ce sera le port pour le remplissage d'azote liquide (LN2), si baisse des niveaux tout en imagerie. Ce presse-papier sera renvoyé le "affichage à l'écran» (figure 1c). </li></ol> 2. Préparation des échantillons <ol><li> Diluer la levure cellules phase log cultivé dans de synthèse complet (SC) des médias à une concentration appropriée de 1x10 6 cellules / mL dans l'eau. </li><li> 2 ml de la levure diluée sont pipette sur une R2 / 1 400 mailles holey carbone revêtu de cuivre cryo-EM grille (fournitures SPI, West Chester, PA) et a permis à adsorber pendant 15 secondes. </li><li> Blot loin l'excès de liquide de la surface de la grille en touchant l'arrière de la grille pour un morceau de tissu déchiré de cellulose souple (Kimwipe) pendant 2 secondes. </li><li> Si nécessaire, la grille peut être lavée avec 3 gouttes uL d'eau (1-3 fois), et les méchants de suite que dans l'étape 3 en tamponnant à l'arrière. </li><li> Avant le lavage final, l'échantillon est chargé dans le congélateur plonger pneumatiques et la grille de la pendaison est lavé comme à l'étape 2.4. Après transfert de la grille avec un papier tissu déchiré (Kimwipe) pour enlever la majorité de l'eau de la surface, la grille est plongé dans ln 2 éthane liquide refroidi et transféré à une boîte de cryo-grille pour le stockage Remarque 1:. Il est important de laisser une couche de liquide aussi mince que possible sur la surface à conserver l'échantillon hydraté. Une mauvaise buvard sera soit sécher l'échantillon ou de quitter la glace qui est opaque au faisceau d'électrons. </li></ol> 3. Cryo-microscopie lumineuse <ol><li> Remplir le stade cryogéniquesLN 2 et de couvrir rapidement avec l'écran de chargement (clipboard en plastique avec une seule 1,9 cm (3 / 4 ") le trou). </li><li> Une fois que le métal atteigne la température de ln 2, le transfert de la boîte cryo-réseau à travers les 1,9 cm (3 / 4 ") le trou de l'écran de chargement et de transfert dans le montage créé par les 3 vis décrite dans la partie A5. Dévissez la boîte cryo-grille de son support et retirez le support pour améliorer l'accès. Maintenez le porte-case cryo-grille sous LN 2 dans un dewar séparés jusqu'à l'étape 3.10. La boîte de cryo-réseau devraient également être maintenus sous LN 2 pour empêcher le réchauffement de grille d'échantillonnage. </li><li> . Recharge LN 2 de l'étage cryotechnique juste en dessous du haut de l'évier de chaleur en aluminium Remarque: ln 2 niveaux doivent être vérifiés périodiquement et rempli pendant le processus d'imagerie afin d'assurer ln 2 est continuellement en contact avec le dissipateur thermique. En général, la recharge se produit toutes les 10 minutes via le port de remplir l'écran de visualisation. </li><li> Pré-refroidir la pointe pince en ln 2, puis le transfert de votre grille (s) sur la surface plate de la visualisation dissipateur thermique en aluminium avec des pincettes, en utilisant le 1,9 cm (3 / 4 ") le trou de l'écran de chargement. </li><li> Soigneusement déplacer la cryo-dessous de scène pour les ouvertures objectif du microscope de lumière réfléchie. </li><li> Placez l'écran d'affichage transparents au-dessus de l'écran de chargement. Puis retirez lentement l'écran de chargement en le faisant glisser sous l'écran Remarque visualisation:. A ce stade, l'échantillon est le plus vulnérable. Tous les courants d'air autour du microscope doit être minimisée, notamment: la respiration, une ouverture de porte à proximité, les gens marchant passé, etc Nous vous suggérons de porter un masque ou d'accrocher un écran facial transparent ci-dessous les oculaires du microscope comme une mesure de précaution. </li><li> Tournez lentilles de l'objectif dans l'environnement de gaz d'azote froid de la cryo-scène et de balayage de l'échantillon sur la zone de visualisation dissipateur thermique plat. Utilisation de la norme lumière des techniques de microscopie en champ se concentrer sur la grille avec un objectif de faible grossissement pour trouver le centre et prendre une image d'aperçu. Spécifications concernant les lentilles de microscope optique utilisé pour cette expérience sont répertoriés dans la section expérimentale des matériaux. Remarque: ln 2 n'entre pas en contact avec les lentilles de l'objectif et nous avons encore à voir la dégradation des images ou des dommages aux lentilles des effets du refroidissement . </li><li> Focus dans grossissement élevé sur une zone d'intérêt et d'acquérir des données avec un champ clair, fond noir, la lumière polarisée ou l'imagerie de fluorescence. Soyez sûr d'enregistrer l'emplacement de la zone d'intérêt sur l'image de terrain faible grossissement brillante pour la corrélation future. Si toutes les précautions énumérées ci-dessus pour le remplissage de la LN 2 sont suivis, la pression positive de l'azote s'évapore est suffisante pour maintenir un environnement sans contamination (indépendante de l'humidité ambiante) pour la durée de l'imagerie. </li><li> Une fois terminé, remplacez l'écran de chargement en le faisant glisser sur le haut de l'écran de visualisation. Enlever l'écran d'affichage en ralentissant le faisant glisser sous l'écran de chargement. </li><li> Retirez le stade de la cryo microscope et avec pré-refroidissement des pincettes, le transfert de la grille de revenir à la boîte de cryo-grille. Visser le support boîte de cryo-grille dans la grille de cryo-case pour sceller contre l'environnement et le transfert à son détenteur d'un dewar LN2 pour le stockage et l'imagerie avenir. </li></ol> 4. Cryo-microscopie électronique <ol><li> Suite à des techniques standard et établie, la charge de la grille de l'échantillon dans un support de transfert de cryo-EM tout en gardant l'échantillon à température de l'azote liquide à tout moment. </li><li> Insérez la cryo-porte avec grille échantillon dans un microscope électronique à transmission. </li><li> Dans une vue en faible grossissement adaptés (50-500x de grossissement nominal), trouver le centre de la grille d'échantillonnage. </li><li> Utilisez le faible grossissement précédemment recueillies cryo-LM données de l'étape 3.7 pour déterminer l'orientation relative des onglets de la grille en cuivre central (comme décrit dans la figure 2) et d'identifier les domaines précis d'intérêt pour la corrélation. </li><li> Procéder à l'alignement de microscope, à faible dose cryo-EM imagerie et de collecte de données. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs L'étage cryogénique (figure 1a) est un moyen efficace de rassembler des cryo-LM de données pour la cryo-microscopie par fluorescence et analyse cryo-LM/cryo-EM corrélative. La figure 2 montre comment la combinaison de bas et haut de grossissement cryo-LM images vous permet de construire des cartes de référence qui vous dirigent vers des zones spécifiques en cryo-EM. La résultante de cryo-LM carte de référence (figure 2b) a été utilisé lors de la cryo-EM acquisition de données pour localiser des régions exacte de la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Étage cryogénique. A) L'aménagement de l'étage cryotechnique est constitué d'un transfert de zone de cryo-grille de montage indiqué wvec une flèche blanche et d'un dissipateur thermique en aluminium. Les grilles sont transférés en vertu de ln 2 de la boîte de cryo-grille et placé directement sur ​​la zone de visualisation du dissipateur de chaleur, comme indiqué par la flèche noire. B) Image illustrant l'étage cryotechnique avec écran de chargement. Le trou dans l'écran de chargement est placé directement sur ​​la boîte cryo-grille de monter et agit comme un port de transférer des échantillons et des échantillons pour le déplacement de la boîte de cryo-grille à la surface de l'échantillon visualisation sur le dissipateur de chaleur avec des pincettes. C) Le cryogénique étape dans la position sous les lentilles d'objectif avec l'affichage à l'écran en place. La découpe spéciale sur l'écran d'affichage permet de lentilles de l'objectif de facilement swing dans la position sans bouger l'étage cryotechnique. Le trou dans l'écran de visualisation loin de la zone de l'échantillon agit comme un ln 2 orifice de remplissage pour reconstituer ln 2 niveaux si nécessaire. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Navigation dans la cryo-LM pour les études corrélatives. A) à faible grossissement cryo-LM vue des cellules de levure adhère à une grille d'échantillonnage. B) La même image dans (a) recouverte d'une image à fort grossissement de fluorescence d'une zone d'intérêt et avec un polygone rempli d'orange marquant le centre de la grille d'échantillonnage. Le centre se compose d'un groupe de quatre carrés, trois ayant une languette métallique supplémentaire et le quatrième ouvert. Pour les trois places avec une languette métallique supplémentaire, deux paires part l'onglet sur les axes longs et courts formant un centre asymétrique. Ce centre asymétrique peut être vu dans le coin supérieur gauche et a été utilisé pour indiquer l'angle de rotation et d'impartialité de la grille entre les cryo-LM et cryo-EM. D'un faible grossissement de nombreuses zones de l'image d'intérêt peut être marqué et utilisé comme une carte de référence pour localiser les zones identiques en cryo-EM. C) Un magnifié par fluorescence cryo-LM image de la zone d'intérêt en (b). HTA1-PCP, un marqueur de la PCP C-terminale des histones, peut être vu comme une structure verte ponctuée d'étiquetage de l'emplacement du noyau. D) Une image cryo-EM de la zone correspondante (c). Barres d'échelle représentent 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Corrélation des cryo-LM et cryo-EM. Deux champs de vue montrant des cellules de levure identiques en corrélation avec la cryo-fond clair (A, D), la cryo-fluorescence (B, E), et cryo-EM (C, F Barres d'échelle). représentent 5 microns.

<ol><li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li>
<li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%3A+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li>
<li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li>
<li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent pas des intérêts concurrents financiers.

<p class="jove_content"&gt; Grâce à notre étage cryogénique et les techniques de préparation des échantillons, des études de corrélation entre la Cryo-LM et cryo-EM présentent plusieurs avantages sur la température ambiante approches traditionnelles, y compris, mais sans s&#39;y limiter: fixation rapide<sup&gt; 1,2</sup&gt;, A réduit photoblanchiment<sup&gt; 3</sup&gt;, Et la numérisation de l&#39;intégrité de l&#39;échantillon avant de cryo-EM<sup&gt; 4,5</sup&gt; Ou chimique Fixation / embedding<sup&gt; 6</sup&gt;. L&#39;un des goulots d&#39;étranglement pour la cryo-EM de collecte de données est le temps nécessaire à la fois pour le transfert de l&#39;échantillon dans un TEM et de balayage de la grille pour trouver des régions propices à l&#39;image. Avec cryo-LM d&#39;acquisition de données rapide<sup&gt; 5</sup&gt;, Le temps passé à trouver les bonnes cellules peuvent être considérablement réduits. Ainsi, nous pouvons économiser temps et argent et de réduire ce goulot d&#39;étranglement par la pré-numérisation et la cartographie des zones d&#39;intérêt dans la cryo-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Plus cher ou complexes étages cryogéniques peuvent permettre l&#39;imagerie haute résolution cryo-LM. Cependant, la scène fabriquée ici est plus que suffisant pour de nombreuses applications. Si cryo-LM imagerie et les transferts de grille de l&#39;échantillon sont effectuées avec prudence comme décrit dans le texte et la vidéo, l&#39;imagerie entièrement libre de contamination qui peut être accompli. Cette méthode permet une corrélation directe des données de microscopie à fluorescence et électronique de la même cellule, organite ou complexes macromoléculaires dispersé sur le support de carbone ou contenus dans une section de tissu mince<sup&gt; 7</sup&gt;. Il faut noter que la valeur de cette étape cryogénique s&#39;étend au-delà cryo-LM/cryo-EM études corrélatives au domaine de la microscopie optique dans son ensemble. Cette étape cryogénique est bien adaptée pour les deux échantillons délicats et colorants fluorophore / taches<sup&gt; 8</sup&gt;, Les points quantiques, ou de protéines par fluorescence taggés<sup&gt; 9</sup&gt; Qui peut être instable lors de la fixation chimique à température ambiante et l&#39;intégration avec le glutaraldéhyde et le paraformaldéhyde. En conséquence, nous espérons que ce stade cryogénique fournira un meilleur accès à ceux qui s&#39;intéressent à la cryo-LM, qui ont déjà été dissuadés par les coûts d&#39;accès et insuffisante.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Dépannage Cryo-Light Microscopy</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. Exemple d&#39;adsorption:</em&gt; Différents échantillons peuvent présenter des caractéristiques variables d&#39;adsorption à l&#39;aide de carbone. Vous trouverez peut-être nécessaire d&#39;utiliser d&#39;autres types de grilles de support tels que le carbone continue, de carbone troué, ou formvar grilles recouvertes de soutien de l&#39;échantillon. De plus, si l&#39;échantillon est contraignant pour les barres de cuivre de la grille et non la surface du carbone, il peut être nécessaire d&#39;ajuster la chimie de surface de carbone par incubation de la grille avec un agent mouillant ou par éclat de décharge avant l&#39;addition de l&#39;échantillon.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. La stabilité scène:</em&gt; Si vous remarquez des vibrations, il est probablement dû à l&#39;étape de l&#39;échantillon étant surchargé par le poids plutôt que le bouillonnement de LN2. Le poids supplémentaire de l&#39;étage cryotechnique, peut parfois provoquer des vibrations à basse fréquence pour transmettre le long de la norme 3-axes platine du microscope de voyage, et nuire à l&#39;imagerie par le flou. Cela peut facilement être corrigée en soutenant l&#39;étape de voyage du microscope par le dessous avec soit un mini-lift réglable ou un adaptateur réglable avec double vis de bras, comme le montre la vidéo. Ces deux mécanismes de soutien réglables interagir avec une partie non mobile de la phase de déplacement et permet donc encore X et Y-axe de translation tel que requis pour l&#39;imagerie.</p

Table des réactifs spécifiques et les équipements: <table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Société </th><th> Catalogue # </th><th> Commentaires </th><th> Coût </th></tr><tr><td> 1 à 22,86 cm (9 &quot;) moule à tarte avec bord en pente </td><td> Bon cuisinier </td><td></td><td> Épicerie locale </td><td> 4,39 $ </td></tr><tr><td> 1 à 22,86 cm moule à gâteau (9 &quot;) </td><td> Bon cuisinier </td><td></td><td> Épicerie locale </td><td> 4,93 $ </td></tr><tr><td> 4 paires de baguettes </td><td></td><td></td><td> Épicerie locale </td><td> 0,50 $ </td></tr><tr><td> 1 - Grande pulvérisation de mousse Stuff </td><td> Great Stuff </td><td></td><td> Quincaillerie locale </td><td> 5,98 $ </td></tr><tr><td> 1 - 4cm x8cm x1cm bloc d&#39;aluminium </td><td></td><td></td><td> Quincaillerie locale ou dans la cour de ferraille </td><td> 10,00 $ </td></tr><tr><td> 5 - n ° 10 de 1,91 cm (3 / 4 &quot;) à tête plate fendue boulons w / noix </td><td></td><td></td><td> Quincaillerie locale </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 3 - # 4 0,95 cm (3 / 8 &quot;) ronde fendue boulons w / noix </td><td></td><td></td><td> Quincaillerie locale </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 15 - # 10 rondelles </td><td></td><td></td><td> Quincaillerie locale </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 2 - planchettes en plastique transparent </td><td></td><td></td><td> Magasin de bureaux locaux </td><td> 6,84 $ </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM case de la grille support </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM tige de manipulation grille de la boîte </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 film de carbone troué, 400 mailles de support en cuivre cryo-EM </td><td> Fournitures SPI </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Matériaux expérimentaux <ol><li> La souche de levure: Hta1-PCP:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-PCP:: KanMX6 du laboratoire Kaplan à l&#39;UC Davis). </li><li> Cryo-microscopie Lumière: images de microscopie cryo-légers ont été prises sur un microscope Leica DM4000M reflétant avec un Leica DFC310 FX caméra CCD. Champ clair, fond noir et des images de fluorescence ont été acquises en utilisant soit une HCX Fluotar PL 5x 0,15 NA aérienne objectif, un HCX Fluotar PL 10x 0,30 NA aérienne objectif, un PL Fluotar 50x 0,55 NA de l&#39;air ou d&#39;un objectif 100x NPLAN 0,75 NA l&#39;air objectif. Champ lumineux et images utilisés sur le terrain foncé une lampe au tungstène 12V 100W comme source de lumière. Pour la fluorescence, une source EL6000 lampe UV a été utilisé en conjonction avec un Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 et LP 580) Cube filtre. </li><li> Electron Microscopy Cryo-Transmission: Cryo-EM images ont été acquises sur un microscope JEM-2100-FEG électronique à transmission (JEOL, Japon) fonctionnant à 200 keV en utilisant un Gatan 626 cryo-transfert titulaire (Gatan, USA). Micrographies ont été enregistrées à des grossissements nominale de X 50, 200, 1200 et 4000 sur un 4096 x 4096 pixels Tietz caméra CCD (TVIPS, Gauting, Allemagne). </li></ol>

low-cost cryo-lumière de fabrication étape par microscopie lumineuse corrélées / electron microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Le couplage de la cryo-microscopie à la lumière (la cryo-LM) et la cryo-microscopie électronique (la cryo-ME) pose un certain nombre d&#39;avantages pour la compréhension de la dynamique cellulaire et l&#39;ultrastructure. Tout d&#39;abord, les cellules peuvent être visualisées dans un environnement proche natif pour les deux techniques. Deuxièmement, en raison du processus de vitrification, les échantillons sont conservés par l&#39;immobilisation physique rapide plutôt que la fixation chimique lente. Troisièmement, l&#39;imagerie du même échantillon à la fois avec la cryo-LM et cryo-EM offre de corrélation des données provenant d&#39;une seule cellule, plutôt que d&#39;une comparaison des &quot;échantillons représentatifs&quot;. Bien que ces avantages sont bien connus à partir d&#39;études antérieures, l&#39;utilisation généralisée des corrélative cryo-LM et cryo-EM reste limitée en raison de la dépense et la complexité de l&#39;achat ou la construction d&#39;un étage cryogénique convient microscopie optique. Ici nous démontrons l&#39;assemblée, et l&#39;utilisation d&#39;un stade peu coûteuse cryogénique qui peut être fabriqué dans n&#39;importe quel laboratoire pour moins de 40 $ avec des pièces trouvées dans les quincailleries et les épiceries locales. Cette étape cryo-LM est conçue pour une utilisation avec reflétée microscopes optiques qui sont équipés de longues travailler objectifs de l&#39;air à distance. Pour corrélative cryo-ML et cryo-EM études, nous nous adaptons à l&#39;utilisation du carbone revêtu standard de 3 mm cryo-EM grilles comme supports spécimen. Après adsorption de l&#39;échantillon à la grille, les protocoles précédemment établies pour la vitrification de l&#39;échantillon et le transfert / la manipulation de la grille sont suivies pour permettre multi-technique d&#39;imagerie. En conséquence, cette configuration permet à n&#39;importe quel laboratoire avec un microscope à lumière reflétée d&#39;avoir accès à l&#39;imagerie corrélative direct des échantillons congelés hydratés.

Nous démontrons la fabrication d&#39;une scène à faible coût cryogénique conçu pour s&#39;adapter à la plupart des microscopes optiques réfléchie. Cette étape de laboratoire construit cryogénique permet efficace et fiable d&#39;imagerie corrélative entre la Cryo-lumière et cryo-microscopie électronique.

Low-Cost Cryo-Lumière de fabrication étape par microscopie lumineuse corrélées / Electron Microscopy

Le couplage de la cryo-microscopie photonique (cryo-LM) et de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) présente un certain nombre d'avantages pour la compréhension de la dynamique cellulaire...

Bonjour, je suis David Carlson, étudiant diplômant dans le laboratoire de James Evans en biochimie et biologie moléculaire à l'Université de Californie à Davis. Dans cette vidéo, je vais vous montrer comment construire un dispositif d'observation cryogénique simple mais efficace pour la microscopie correlative cryogénique en lumière et en électrons. Un dispositif cryogénique comprend un flux de visualisation transparent, une découpe destinée aux objectifs, un réservoir d'azote liquide, un dissipateur thermique pour observer votre échantillon et un support de transfert d'échantillon.La majorité des matériaux utilisés ont été achetés dans un magasin de bricolage et d'alimentation local. Ils comprennent un moule à manqué de neuf pouces, un moule à gâteau de neuf pouces, quatre paires de baguettes, de la mousse expansible en bombe, un bloc d'aluminium de quatre centimètres sur huit centimètres sur un centimètre percé de trous de fixation pour vis numéro 10, boulons cinq. Boulons et écrous à tête plate fendue numéro dix, trois quarts de pouce, boulons et écrous ronds fendus numéro 4, 3/8 pouce, 15 rondelles numéro 10, deux porte-blocs en plastique transparent, de l'eau, ainsi qu'un support de grille pour cryo-ME et une tige de manipulation, disponibles chez Ted Pella.Placer le plat à tarte sur la platine du microscope sous les objectifs. Placer le bloc d'aluminium près du bord du plat et faire la mise au point sur la surface de l'aluminium. Vérifier que les objectifs peuvent pivoter librement vers l'intérieur et l'extérieur au-dessus du rebord du plat à tarte.Sinon, repositionnez le bloc d'aluminium et vérifiez à nouveau. Une fois la position du bloc d'aluminium déterminée, marquez l'emplacement des boulons de fixation à l'aide d'un marqueur. Placez la boîte à grilles cryo à côté du bloc d'aluminium et, à l'aide d'un marqueur, notez la position de l'encoche et de chaque côté de la boîte à grilles cryo en tenant compte de la disposition des boulons notée sur la surface du plat creux.Utilisez une vis pointue et un marteau pour piquer des trous de démarrage sur chacun des points marqués à l’aide d’un foret numéro 17. Percez les trous pour le montage du bloc d’aluminium. Arrondissez chaque trou afin de lisser les bords.Ensuite, utilisez un foret numéro 35 pour percer et arrondir les trous destinés au montage de la boîte de grille cryo et du plat creux. Préparez et percez. Insérez des vis à tête plate à fente numéro 10 de trois quarts de pouce dans les trous du bloc d'aluminium et placez deux rondelles SAE numéro 10 sur chacun des côtés du bloc d'aluminium.Trouvez les trous de fixation sur le plat à tarte. Ensuite, fixez le bloc en utilisant vos doigts pour engager chaque boulon, puis serrez-les à l’aide d’un tournevis électrique. Retournez le plat à tarte et placez une rondelle n°10 sur chaque boulon, puis fixez-les avec un écrou.Utilisez une clé pour vous assurer que tous les écrous sont bien serrés. Ensuite, à partir de l'arrière du plat à tarte, placez le numéro quatre, tête ronde à fente. Faites passer les boulons par les trous de fixation de la boîte à grille cryo et fixez-les avec un écrou placé au-dessus du plat à tarte.Avec la partie supérieure de la platine cryogénique terminée, nous montrons comment transférer la boîte de grilles cryogéniques en l'absence à la fois du bloc-notes en plastique et de l'azote liquide. Ensuite, nous commençons la préparation du moule en mousse isolante. Commencez par fixer les baguettes par paires à l’aide de ruban adhésif.Ensuite, fixez avec du ruban adhésif chaque faisceau de baguettes chinoises sur le rebord du moule à gâteau, en les positionnant l'une en face de l'autre. Les baguettes chinoises permettent d'obtenir une épaisseur uniforme de l'isolation en mousse. Humidifiez ensuite le moule à gâteau ainsi que la surface inférieure du plat à tarte avec de l'eau.Commencez par ajouter une seule couche de matière excellente. Vaporisez de la mousse sur toute la surface du fond du moule à gâteau, puis vaporisez de l'eau. Ajoutez une deuxième couche de mousse expansée excellente et vaporisez de l'eau.Appuyez uniformément et fermement le plat à tarte dans le moule à gâteau. Retournez les plats assemblés et placez un poids lourd sur le dessus. Laissez durcir la mousse toute la nuit.Une fois que la mousse est durcie, utilisez un couteau denté pour détacher le plat et retirer l'excédent de mousse sur les côtés du plat. Retirez les espacements en bâtonnets et séparez le plat à tarte du moule à gâteau. La mousse doit rester collée au plat à tarte.Ensuite, placez la platine cryogénique sous l'objectif et positionnez un porte-bloc en plastique par-dessus. À l’aide d’un feutre, tracez le trajet des objectifs lorsqu’ils pivotent vers l’intérieur et l’extérieur. Marquez un X à distance du demi-cercle, près du bord du plat creux.Avec le deuxième presse-papiers, marquer l'emplacement du support de la grille de foule. Découper le trou pour le boîtier de la grille de foule à l'aide d'un foret à couronne de trois quarts de pouce et d'un perceuse, en appuyant sur l'autre presse-papiers. Découper le X avec un foret à couronne de trois quarts de pouce.Retirez la zone semi-circulaire en effectuant plusieurs découpes à l’aide d’un foret creux de trois pouces et d’une perceuse à colonne. La fabrication est désormais terminée. Les matériaux nécessaires à la préparation des échantillons comprennent une boîte cryogénique pour grilles et une tige de manipulation, des pinces, un bloc de transfert pour boîte cryogénique, une lingette en tissu déchirée, un récipient de refroidissement, un récipient d’éthane liquide, des grilles électroniques EM en carbone R2/1 à 400 mailles, une boîte en polystyrène et un congélateur pneumatique à plongée. Remplissez verticalement la boîte en polystyrène, la boîte cryogénique, le bloc de transfert, le récipient de refroidissement et le récipient d’éthane liquide avec de l’azote liquide.Ensuite, placez la boîte de grilles cryo dans le bloc de transfert de boîte de grilles cryo. À l'aide de la pince, tenez la grille de microscopie électronique avec le côté au carbone vers le haut. Appliquez deux microlitres de suspension cellulaire à deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre sur la surface de la grille.Chargeez les pinces sur le piston pneumatique et aspirez le liquide depuis la surface de la grille en maintenant un morceau de chiffon chimique déchiré contre l'arrière de la grille EM, puis plongez-le dans la suspension d'éthane liquide. Déplacez rapidement la grille de l'éthane liquide vers l'azote liquide et placez-la dans une boîte à grilles cryogéniques. Pour utiliser le porte-objet cryogénique, commencez par remplir le récipient avec de l'azote liquide et couvrez-le avec un porte-bloc.Après avoir transféré la boîte de grilles cryo à travers toute la fente dans le porte-bloc en plastique, retirez une grille de la boîte et placez-la sur la surface de visualisation du bloc en aluminium. Après avoir positionné le porte-objet cryo sur le microscope, placez le deuxième porte-bloc par-dessus le premier et faites-le glisser délicatement.Insérez les objectifs et utilisez le microscope normalement. Commencez par balayer à faible grossissement pour localiser le centre de la grille indiqué par trois languettes métalliques. Ici, faites la mise au point à 50 x.Vous pouvez observer une fine couche de glace vitreuse recouvrant la grille, qui devient fluorescente. Vous pouvez voir le marqueur d'histone CFP localisé dans le noyau de la cellule. Ensuite, je change d'objectif pour passer à 100 x et je focalise sur des cellules de levure individuelles.Pour retirer le porte-objet cryogénique du microscope, placez le premier bloc-notes au-dessus du second et faites glisser délicatement le bloc-notes inférieur vers l'extérieur. Retirez le porte-objet cryogénique du microscope et remettez la grille dans la boîte à grilles cryogéniques en utilisant l'entaille prévue à cet effet sur le bloc-notes. Enfin, vissez la tige de manipulation de la boîte à grilles cryogéniques dans la boîte et transférez-la dans de l'azote liquide pour un examen ultérieur.La stabilité de la platine est très importante en microscopie électronique. En microscopie, nous avons constaté que la majeure partie de l'instabilité de l'image dans notre système provient du poids supplémentaire de la platine cryogénique sur la platine du microscope. En l'absence d'azote liquide, on observe une grande instabilité lorsqu'on est focalisé sur le bloc d'aluminium.En ajoutant un support à l'avant de la platine du microscope, l'instabilité est considérablement réduite. Ici, je présente une structure de support composée d'un mécanisme de vis ajustable placé entre la platine et la base du microscope. L'avantage de ce soutien supplémentaire apparaît également en microscopie cryogénique, démontrant que l'instabilité provient du poids ajouté et non des bulles d'azote liquide.Comme vous pouvez le constater, ce dispositif de microscopie cryogénique est un moyen peu coûteux et utile pour recueillir des informations fluorescentes sur des cellules congelées et hydratées. L’analyse en champ clair et en champ sombre permet de cartographier les zones de glace uniforme. Une fois que nous avons localisé ces zones d’intérêt, nous pouvons utiliser le canal de fluorescence pour visualiser notre fluorophore, qui sert ici à marquer les protéines d’intérêt, un marqueur d’histone CFP.Après avoir capturé les images en fluorescence cryo, nous pouvons utiliser les images à faible grossissement pour cartographier et retrouver la même grille, le même carré, puis imager les mêmes cellules en microscopie électronique cryo. Comme vous pouvez le voir, ce dispositif optique cryo constitue un moyen utile et peu coûteux d'obtenir des images de fluorescence d'échantillons d'hydrogène gelés. La même région peut également être observée en cryo-ME en suivant les techniques standards de transfert et d'imagerie en cryo-ME.Dans ce cas, les données de microscopie optique cryogénique servent de carte de référence pour identifier la région exacte destinée à l'étude corrélative. Ce dispositif peut être utilisé pour l'imagerie corrélative de nombreux types d'échantillons, notamment des cellules entières, des réactions in vitro de complexes macromoléculaires ou d'organites isolés, ainsi que des sections cryogéniques minces de tissus. Merci d'avoir regardé, et j'espère que vous trouverez ce dispositif de microscopie optique cryogénique aussi utile que nous le trouvons.

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Lensfree tomographie optique est une technique de microscopie en trois dimensions qui offre une résolution spatiale de moins de 1 um × &lt;1 um x &lt;3 microns en x, y et z dimensions, respectivement, au cours d'une imagerie grand volume de 15-100...

Lensfree sur puce microscopie tomographique Employant multi-angle d&#39;éclairage et de Pixel Super-résolution

Nous décrivons une méthode de microscopie corrélative qui combine la microscopie à haute vitesse 3D de cellules vivantes fluorescent lumière et de haute résolution tomographie cryo-électronique. Nous démontrons la capacité de la méthode corrélative par imagerie dynamique, les petites VIH-1 particules en interaction avec des cellules HeLa d'accueil.

Microscopie corrélative pour l&#39;analyse structurale 3D des interactions dynamiques

Ici, nous fabriquons des micro/nanostructures polymères 3D dans lesquelles la forme et l’alignement moléculaire peuvent être modifiés avec une précision à l’échelle nanométrique par l’utilisation de l’écriture laser directe. La déformation induite par la lumière de plusieurs types de microstructures d’élastomères à cristaux liquides peut être contrôlée à l’échelle microscopique.

Free-forme légère Actionneurs - Fabrication et contrôle des Actuation dans l&#39;échelle microscopique

Une méthode de microscopie corrélative électron (CLEM) est appliquée aux structures intracellulaires Viro-induite d’image par microscopie électronique (EM) dans les cellules qui sont préalablement sélectionnés par microscopie photonique (LM). LM et EM sont combinés en une approche d’imagerie hybride pour obtenir une vision intégrée des interactions virus-hôte.

Corrélatives microscopie électronique léger (CLEM) de suivi et d’imagerie protéine virale associés Structures des cellules immobilisées Cryo

La microscopie optique à base de puces est une nouvelle approche de la microscopie à fluorescence et offre des avantages en termes de rentabilité et de débit. Ici, les protocoles de préparation et d'imagerie des puces sont présentés pour la microscopie TIRF et la microscopie super-résolution basée sur la localisation.

Fluorescence interne totale de réflexion à haut débit et microscopie optique stochastique directe de reconstruction utilisant une puce photonique

Ce protocole montre comment imager des échantillons biologiques cryo-préservés à l’aide de la microscopie à éclairage cryo-structuré. Nous démontrons la méthodologie en imageant le cytosquelette des cellules U2OS.

Collecte de données microscopiques d’éclairage cryostructuré à partir de cellules cryogéniquement préservées

Utilisation du broyage par faisceau d’ions focalisés pour produire des lamelles vitreuses sur grille à partir d’échantillons biologiques congelés pour la cryotomographie électronique.

Préparation de lamelles à partir d’échantillons biologiques vitreux à l’aide d’un microscope électronique à balayage à double faisceau pour la cryotomographie électronique

Le protocole décrit la génération de sphéroïdes à haut débit pour la bio-impression à l’aide de l’analyse multiparamétrique de leur oxygénation et de leur mort cellulaire sur un microscope à fluorescence standard. Cette approche peut être appliquée pour contrôler la viabilité des sphéroïdes et effectuer une normalisation, ce qui est important dans la modélisation des tissus 3D, le microenvironnement tumoral et la biofabrication réussie des (micro)tissus.

Biofabrication assistée par microscopie à oxygène abordable de sphéroïdes multicellulaires

Un cadre d’imagerie hyperspectrale multimodale rapide a été développé pour obtenir des images de génération de somme de fréquence vibratoire (VSFG) à large bande, ainsi que des modalités d’imagerie de génération de deuxième harmonique (SHG) en fond clair. En raison de la fréquence infrarouge en résonance avec les vibrations moléculaires, des connaissances microscopiques structurelles et morphologiques mésoscopiques sont révélées à partir d’échantillons autorisés par symétrie.

Imagerie chimique hyperspectrale non linéaire multimodale à l’aide de la microscopie à génération de somme et de fréquence vibrationnelle à balayage linéaire

Ce protocole décrit en détail comment construire un microscope à fluorescence à feuillet de lumière à objectif unique et son utilisation pour visualiser les réseaux de cytosquelettes.

Conception et construction d’un microscope à fluorescence à feuillet de lumière personnalisable à objectif unique pour la visualisation des réseaux de cytosquelettes

Ce flux de travail permet la production de lamelles ciblant des structures biologiques marquées par fluorescence qui sont petites (&lt;1 μm d’étendue axiale) et rares (1 copie par cellule) à l’aide d’une plateforme d’imagerie cryogénique tri-coïncidente. Cette plate-forme intègre la microscopie à fluorescence, le broyage par faisceau d’ions focalisés et la microscopie électronique à balayage à une seule position focale et permet la microscopie à fluorescence simultanée pendant le broyage.

Flux de travail à l’aide d’un microscope cryogénique à fluorescence coïncidente, à faisceau d’électrons et d’ions pour le broyage ciblé de cellules

Découvrez la fabrication d'une platine cryogénique à faible coût pour microscopie à lumière réfléchie. Cette méthode permet une imagerie corrélative efficace entre cryo-lumière et cryo-microscopie électronique.

Low-Cost Cryo-Lumière de fabrication étape par microscopie lumineuse corrélées / Electron Microscopy

Explorer plus de vidéos