Name: Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Découvrez le silençage de gènes induit par virus chez le coton via Agrobacterium, utilisant le virus TRV pour étudier la fonction du gène GrCLA1. Cette méthode rapide permet d'observer le phénotype albinos en deux semaines.

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Nous sommes reconnaissants aux Drs. SP Dinesh Kumar et Yule-Liu pour TRV-VIGS vecteurs, et les Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr et Bayer CropScience pour fournir des semences de coton. Ce travail a été financé par la NSF à LS et les NIH à PH

1. Pousser les semis de coton <ol><li> Semer les graines du coton upland (Gossypium hirsutum) variété Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR et Deltapine 90 dans des pots (7 cm de diamètre) contenant Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Gardez les pots dans un plateau recouvert d'un dôme en plastique à 23 ° C, 120 uE m -2 s -1 lumière, avec une photopériode 12 heures heure de lumière/12 sombre dans une chambre de croissance. </li><li> Retirez le dôme lorsque deux cotylédons ont émergé. </li><li> Environ deux semaines plus tard, l'utilisation des plantes avec deux cotylédons sont entièrement développés pour le dosage VIGS. A ce stade, les vraies feuilles n'ont pas encore émergé (figure 1). </li></ol> 2. Construire vecteur VIGS transportant GrCLA1 ​​génique <ol><li> Amplifier le alterados Cloroplastos 1 gène de coton (GrCLA1) par PCR avec des amorces GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'et GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' à partir d'une bibliothèque d'ADNc de G. raimondii tissus foliaires. </li><li> Recueil des produits de PCR de GrCLA1 ​​avec EcoRI et Kpnl et insérez-le dans pYL156 (pTRV-RNA2) vecteur par ligature. </li><li> Ecran clones sur des plaques d'agar LB contenant 50 pg / ml de kanamycine. Vérifiez les constructions par digestion d'enzymes de restriction et le séquençage. </li><li> Transformer le plasmide dans Agrobacterium tumefaciens GV3101 par électroporation et de récupérer dans un milieu liquide LB à 28 ° C. Sélectionnez les transformants sur plaques avec le LB + kanamycine (50 pg / ml) + gentamicine (25 ug / ml). Les bactéries peuvent être stockés dans le glycérol 25% à -80 ° C pour une utilisation à long terme. </li></ol> 3. Effectuer VIGS l'inoculation <ol><li> Trois jours avant l'inoculation stocks strie, glycérol congelés d'Agrobacterium tumefaciens portant pYL192 (VRT): ARN1, pYL156 (VRT): RNA2 (vecteur seul) et pYL156 (VRT): RNA2-GrCLA1 ​​sur les plaques d'agar LB contenant 50 ug / ml de kanamycine et 25 pg / ml de gentamycine. Incuber les plaques à 28 ° C pendant 24 heures. </li><li> Deux jours avant l'infiltration VIGS, choisissez une seule colonie pour chaque construction à partir des plaques ci-dessus et inoculer dans 5 ml de milieu LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine et 25 pg / ml de gentamycine; Cultiver la culture bactérienne à 28 ° C pour la nuit dans un tambour à rouleaux à une vitesse de 50 rpm. </li><li> Transférer la culture au-dessus d'un flacon avec 50 ml de milieu LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine et 25 pg / ml de gentamycine, majoré de 10 mM de MES (2 - (4 morpholino) éthane sulfonique) et 20 acétosyringone uM. Cultiver la culture à 28 ° C pour la nuit dans un shaker avec une vitesse de 50 rpm. </li><li> Le jour suivant, ralentit les cellules agro-bactérienne à 4000 rpm pendant 5 minutes; remettre en suspension de la culture dans le tampon d'infiltration contenant 10 mM MgCl2, 10 mM de MES et 200 acétosyringone uM. Réglez la DO 600 de la culture à 1,5. </li><li> Laisser la culture sur le banc à la température ambiante pendant 3 heures. </li><li> Avant l'infiltration d'agrobactéries, de punch en dessous des cotylédons des plants de coton avec une aiguille 25 G sans percer à travers les cotylédons. Un ou deux trous (dépend de la douceur des tissus) ont été perforées sur chaque section du cotylédon (figure 2). </li><li> Mélanger la suspension de la culture d'agrobactéries pYL192 (VRT): ARN1 et pYL156 (VRT): RNA2 ou pYL156 (VRT): RNA2-GrCLA1 ​​dans un rapport 1:1; main d'infiltrer le mélange du dessous de cotylédons à travers les sites utilisant un blessant une mL sans aiguille de seringue (figure 3). </li><li> Couvrez les plantes avec un dôme de plastique et laisser les plantes infiltrées à température ambiante sous condition de faible lumière pour la nuit. </li><li> Transfert plantes pour une chambre de croissance avec la température de 23 ° C, 120 uE m -2 s -1 lumière avec un cycle de lumière heures / 12 12 heures d'obscurité. </li></ol> Remarque: VIGS fonctionne lorsque les plantes sont sous soit 23 ° C ou en serre (25-28 ° C). Lorsque la température est relativement basse (23 à 25 ° C), il est plus facile pour l'inoculation et le phénotype est plus uniforme par rapport supérieur (28-30 ° C) ou la température fluctue. Couvrant les plantes avec un dôme permet également VIGS plus efficace. <ol start="10"><li> Examinez le phénotype taire à 7 ~ 8 jours après l'infiltration. Les vraies feuilles de plantes réduites au silence par pYL156 (VRT): RNA2-GrCLA1 ​​commencé à afficher le phénotype albinos (figure 4). Les plantes infiltrées par la réalisation agrobactéries pYL156 (VRT): RNA2 servir de contrôle. </li><li> Vérifier l'efficacité inactivation des gènes en examinant le niveau d'expression de gènes endogènes en utilisant la transcription inverse de réaction en chaîne polymérase (RT-PCR) avec l'ARN isolé de contrôle et de plants de coton au silence. </li></ol> Note: Les plantes VIGS-ED doivent être maintenus sous des conditions contenues quarantaine et les plantes doivent être bien à l'autoclave et éliminés après les tests que VRT a un large spectre d'hôte et est un agent pathogène à déclaration obligatoire. 4.Les résultats représentatifs: Environ deux semaines après la main-imprégnation avec le mélange d'agrobactéries, le phénotype albinos causés par GrCLA1 ​​taire a été clairement observé sur les vraies feuilles. L'efficacité taire atteint presque 100% dans de multiples expériences avec plus de 50 plantes. Les plantes présentent un phénotype taire uniformément répartie et très forte sur les albinos, nouvellement développés laisse avec une mosaïque sur les feuilles âgées (figure 4). <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Un plant de coton d'environ deux semaines avec deux vieux stade de cotylédons sont entièrement développés utilisé pour l'infiltration agrobactéries. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Poinçonnage des trous minuscules sur le dessous de cotylédons des plantes de coton à l'aide d'une aiguille 25 G pour faciliter l'infiltration agrobactéries. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Infiltration de la main d'un mélange d'agrobactéries dans les cotylédons de coton par les sites en blessant l'aide d'une seringue sans aiguille <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Phénotype albinos est apparu sur VIGS taire les plants de coton. Quatre cultivars sont présentés. A) Fibermax 832; B) Phytogen 480WR; C) Phytogen 425RF; D) Deltapine 90.

<ol><li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+sequencing+cotton+%28Gossypium%29+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li>
<li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li>
<li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li>
<li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+of+CLA1%2C+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li>
<li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLA1%2C+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development%2C+is+highly+conserved+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li>
<li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

VIGS a été prouvé être un outil puissant dans l&#39;analyse génomique fonctionnelle par transitoirement renversant l&#39;expression de gènes endogènes. Dans cette étude, nous avons développé une VIGS Agrobacterium en utilisant un vecteur binaire basée VRT. Le coton CLA1 (GrCLA1) gène a été développé comme un repère visuel pour surveiller l&#39;efficacité taire. Nous avons toujours obtenu 100% d&#39;efficacité silençage génique, a démontré par le phénotype albinos apparaissant sur les feuilles vrai dans toutes l...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom des réactifs et des équipements </th><th> Société </th><th> Catalogue / numéro de série </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Rouleau à tambour </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-bactérie de la culture </td></tr><tr><td> Incubateur </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc </td><td> 01046209 </td><td> Agro-bactérie de la culture </td></tr><tr><td> UV / Vis spectrophotomètre </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modèle: DU530 </td><td> Mesure OD </td></tr><tr><td> Gene Pulser </td><td> BioRad </td><td> Modèle: 1652076; de série: 154BR3880 </td><td> L&#39;électroporation </td></tr><tr><td> Pulser contrôleur </td><td> BioRad </td><td> Modèle: 1652098; de série: 232BR4833 </td><td> L&#39;électroporation </td></tr><tr><td> Micropulser électroporation cuvette </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> L&#39;électroporation </td></tr><tr><td> Seringue de 1 mL </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> L&#39;inoculation de l&#39;agro-bactérie </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> Plantule croissance </td></tr><tr><td> Terra Cotta pot </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Plantule croissance </td></tr><tr><td> Monohydraté MES </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> Mémoire tampon d&#39;infiltration </td></tr><tr><td> Acétosyringone </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> Mémoire tampon d&#39;infiltration </td></tr></tbody></table>

agrobacterium induite par le virus assay gene silencing en coton

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotonnier (Gossypium hirsutum) est l&#39;une des cultures les plus importantes dans le monde entier. Des efforts considérables ont été réalisés sur l&#39;amélioration moléculaire des variétés nouvelles. L&#39;analyse génétique à grande échelle fonctionnelle de coton a été en retard sur la plupart des espèces végétales modernes, probablement en raison de sa grande taille de la duplication du génome, le gène et la polyploïdie, cycle de croissance long et récalcitrant à la transformation génétique 1. Pour faciliter l&#39;étude fonctionnelle à haut débit génétique / génomique dans le coton, nous essayons de développer des tests rapides et efficaces transitoires afin d&#39;évaluer les fonctions des gènes de coton. Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) est une technique puissante qui a été développé sur la base de l&#39;hôte inactivation génique post-transcriptionnelle (PTGS) pour réprimer la prolifération virale 2,3. Agrobacterium VIGS a été appliquée avec succès dans un large éventail d&#39;espèces dicotylédones telles que des Solanacées, Arabidopsis et des espèces de légumineuses, et des espèces monocotylédones dont l&#39;orge, le blé et le maïs, pour diverses études génomiques fonctionnelles 3,4. Comme cette approche rapide et efficace évite la transformation des plantes et surmonte redondance fonctionnelle, il est particulièrement attrayant et adapté pour l&#39;étude de génomique fonctionnelle chez les espèces de cultures comme le coton ne se prêtent pas à la transformation. Dans cette étude, nous présentons le protocole détaillé du système d&#39;Agrobacterium VIGS en coton. Parmi les vecteurs viraux plusieurs VIGS, le virus du rattle (VRT) envahit un large éventail d&#39;hôtes et est capable de se propager à travers vigoureusement la plante entière encore produire des symptômes bénins sur le hosts5. Pour surveiller l&#39;efficacité taire, GrCLA1, un gène homologue de Arabidopsis Cloroplastos alterados une gène (AtCLA1) en coton, a été cloné et inséré dans le code binaire VIGS vecteur pYL156. CLA1 gène est impliqué dans le développement des chloroplastes 6, et les études précédentes ont montré que perte de fonction de AtCLA1 abouti à un phénotype albinos sur les vraies feuilles 7, offrant un excellent marqueur visuel pour faire taire l&#39;efficacité. À environ deux semaines après l&#39;infiltration d&#39;Agrobacterium, le phénotype albinos ont commencé à apparaître sur les feuilles vraies, avec une efficacité de 100% en silence toutes les expériences répétées. La réduction au silence l&#39;expression des gènes endogènes a également été confirmée par analyse RT-PCR. De manière significative, pourrait faire taire puissamment se produisent dans tous les cultivars que nous avons testés, y compris les diverses variétés cultivées commercialement au Texas. Cette rapide et efficace au moyen d&#39;Agrobacterium test VIGS fournit un outil très puissant pour rapide et à grande échelle d&#39;analyse des fonctions des gènes au niveau de l&#39;échelle du génome du coton.

Nous présentons le protocole détaillé pour Agrobacterium induite par le virus du gène taire (VIGS) de dosage dans le coton. Le virus du rattle (VRT) vecteurs dérivés VIGS ont été déployés pour inciter RNA silencing de coton GrCLA1, alterados Cloroplastos une gène. Le phénotype albinos causés par faire taire GrCLA1 ​​a été observée au stade plantule dans les 2 semaines après l&#39;inoculation.

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

Le coton (*Gossypium hirsutum*) est l'une des cultures les plus importantes au monde. Des efforts considérables ont été déployés pour la sélection moléculaire de nouvelles variétés. Le...

L'objectif général de cette procédure est de développer un dosage de silençage génique induit par un virus, médié par une agrobactérie, chez le coton, afin d'étudier la fonction des gènes. Cette approche est réalisée en faisant d'abord pousser des semis de coton jusqu'au stade de 10 jours à deux semaines. Ensuite, le gène rados des chloroplastes du coton est cloné dans un vecteur de type virus de la mosaïque du tabac (Tobacco rattle virus).La troisième étape consiste à préparer des cultures d'agrobactéries contenant P-T-R-V-R-N-A un et P-T-R-V-G-R-C-A un. L'étape finale est d'inoculer manuellement les cultures d'agrobactéries dans les cotylédons de coton. Enfin, les résultats du silençage génique peuvent être observés en examinant le phénotype albinos sur les vraies feuilles des plantes de coton environ deux semaines plus tard.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la transformation, est que les VIGS offrent une plateforme rapide et efficace pour l'étude de la fonction des gènes chez le coton. Bien que cette méthode puisse s'avérer être un outil puissant pour une analyse rapide à grande échelle de la fonction des gènes au niveau du génome entier chez le coton, elle peut également être appliquée à d'autres espèces végétales importantes. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il est délicat d'inoculer manuellement les cultures d'agrobactéries et le coléoptile du coton.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique et de la génomique du coton, telles que l'exploration des fonctions des gènes, afin de cultiver des plants de coton pour la silencing génique induit par virus. Ajouter le mélange Metro Mix 700 dans plusieurs pots de sept centimètres et placer les pots remplis dans un bac. Ensuite, planter les graines de plusieurs variétés de cotonnier d'upland, telles que Fiber Max 8 3 2 Phyto, Gen 4, 2 5, RF Phyto, Gen Four 80 WR et Delta Pine 90.Dans les pots préparés, recouvrez le plateau contenant les pots d'un dôme en plastique et placez le plateau dans une chambre de croissance à 23 degrés Celsius, avec un éclairement de 120 micro Einsteins par mètre carré par seconde et un photopériode de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Après trois à quatre jours, une fois que deux folioles ont émergé, retirez le dôme en plastique. Laissez les plants de coton pousser environ 10 jours, jusqu'à ce qu'ils atteignent un stade où deux cotylédons complètement développés soient présents, mais avant l'apparition des vraies feuilles. Les plants sont alors prêts à être utilisés pour le test de silençage génique induit par un virus.Ces procédures de clonage doivent être réalisées pendant la période de deux semaines où les plants de coton atteignent le stade de pleine expansion. Dans un premier temps, amplifier un gène des chloroplastes de coton à partir d'une bibliothèque d'ADNc de tissus foliaires de CACI remondii, en utilisant les amorces fournies dans le protocole écrit, selon les procédures standards de PCR. Ensuite, digérer le produit PCR de GCA1 par EcoR1 et Kpn1 selon les protocoles du fabricant des enzymes.Visualisez le produit PCR de 500 paires de bases sur un gel à l'athénium bromure. Découpez la bande et extrayez le ligate d'ADN, le produit PCR purifié, dans le vecteur PYL 1 56. À l'aide de la ligase T4 de l'ADN, transformez des cellules d'e coli compétentes avec le vecteur ligaturé, puis étalez 10 à 50 microlitres des cellules transformées sur des géloses LBA contenant 50 microgrammes par millilitre de canamycine.Incuber la plaque pendant toute la nuit à 37 degrés Celsius le jour suivant. Prélever des colonies à partir de la plaque et les faire croître pendant toute la nuit dans deux millilitres de bouillon LB contenant 50 microgrammes par millilitre de canamycine. Récolter les bactéries par centrifugation et effectuer les préparations d'ADN selon les procédures standard. Pour purifier l'ADN plasmidique, vérifier les constructions par digestion aux enzymes de restriction et par séquençage.Une fois la présence et l'orientation de l'insert dans le vecteur PYL 1 56 confirmées, électrotransformer le plasmide dans l'agrobactérie tumefaciens GV 3 1 0 1 et réaliser la récupération en milieu liquide LB à 28 degrés Celsius. Sélectionner les transformants sur des boîtes de gélose LBI contenant 50 microgrammes par millilitre de canamycine et 25 microgrammes par millilitre de gentamicine. Si désiré, les bactéries peuvent être conservées dans du glycérol 25 % à moins 80 degrés Celsius.Trois jours avant l'inoculation, étaler sur des plaques d'agar LB contenant des antibiotiques des stocks glycérolés d'Agrobacterium tumefaciens portant les constructions PYL 1 9 2 RNA un PY, 1 56 RNA deux et PY 1 56 RNA deux GLA un. Incuber les plaques à 28 degrés Celsius pendant 24 heures. Le jour suivant, prélever une colonie isolée pour chaque construction et inoculer chaque colonie dans cinq millilitres de milieu LB, supplémenté avec 50 microgrammes par millilitre de kanamycine et 25 microgrammes par millilitre de gentamicine.Faire pousser la culture bactérienne à 28 degrés Celsius pendant la nuit dans un agitateur réglé à une vitesse de 50 tours par minute. Transférer la culture PYL 1 56 ARN deux GLA un et les cultures témoins dans des flacons séparés contenant 50 millilitres de milieu LB supplémenté avec 50 microgrammes par millilitre de canamycine et 25 microgrammes par millilitre de gentamicine, plus 10 millimolaire de MES et 20 micromolaire d'acéto. Cy Ringy Faire pousser la culture à 28 degrés Celsius pendant la nuit dans un agitateur réglé à une vitesse de 50 tours par minute.Le jour suivant, transférez les cultures dans des tubes de centrifugation et centrifugez les cellules agrobactériennes à 4 000 tours par minute pendant cinq minutes. Résuspendez la culture dans le tampon d'infiltration contenant 10 millimolaire de chlorure de magnésium, 10 millimolaire de MES et 200 micromolaire d'acétosyringone. Mesurez l'OD à 600 nm de la culture et ajustez-la à 1,5 avec le tampon d'infiltration. Incubez la culture sur le plan de travail à température ambiante pendant trois heures avant l'infiltration foliaire agrobactérienne.Percer la face inférieure du carpophore des plants de coton à l’aide d’une aiguille de calibre 25, sans transpercer entièrement le carpophore. Un ou deux trous sont effectués sur chaque section de carpophore. Ensuite, mélanger la culture bactérienne agrobactérienne d’ARN PYL 1 92 avec soit l’ARN PYL 1 56 soit l’ARN PY 1 56 GRCA 1 selon un rapport un pour un.Ensuite, à l’aide d’une seringue ou d’une aiguille de un millilitre, introduire le mélange sur la face inférieure des cotylédons à travers les trous perforés. Couvrir les plantes avec un dôme en plastique et laisser les plantes infiltrées à température ambiante, à la lumière tamisée, pendant la nuit.Transférez les plantes dans une chambre de croissance à une température de 23 degrés Celsius, avec une lumière de 120 micro Einstein par mètre carré par seconde et un cycle de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Examinez le phénotype de silençage entre sept et huit jours après l'infiltration. À ce stade, les feuilles vraies des plantes silencées par PY 1 56 ARN deux GLA un commencent à présenter un phénotype albinos.Les plantes infiltrées avec des bactéries agrobactériennes portant l'ARN PYL 1 56 deux servent de témoin. Vérifiez l'efficacité de la silencing génique en analysant le niveau d'expression des gènes endogènes par transcription inverse en PCR, à l'aide d'ARN isolé à partir de plantes de coton témoins et avec gènes silencés, selon des procédures standard.Cette image montre un cultivar Fiber Max 8 3 2 après la silenciation génique induite par un virus du gène GLA one. Notez les feuilles de couleur blanche là où la silenciation du gène a eu lieu. Un cultivar PHYTO four 80 WR présente également un phénotype albinos après la silenciation génique induite par un virus.De même, ce cultivar phyto 4 2 5 RF présente des feuilles blanches là où le silençage génique induit par le virus s'est produit. Enfin, cette image montre une autre expérience réussie de silençage génique induit par un virus, cette fois chez des cultivars Delta PINE 90. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'ajouter de l'acétone dans les cultures d'agrobactéries avant de les laisser au banc pendant les trois heures suivant cette procédure.D'autres méthodes, telles que la vigilance, le clonage de bibliothèques d'ADNc, peuvent ensuite être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'exploration de fonctions géniques nouvelles après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la génétique végétale pour explorer la fonction des gènes et la réponse de défense aux stress antibiotiques et biotiques dans les plantes cultivées d'importance économique. Une fois les données masquées, cette technique peut être réalisée en deux à trois jours si elle est effectuée correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser un silençage génique induit par un virus chez le coton.

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Source : Beernink, B. M. et al. Agroinoculation directe des semis de maïs par injection avec des clones infectieux du virus de la mosaïque de la queue de renard et du virus de la mosaïque de la canne à sucre. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo montre la délivrance médiée par Agrobacterium de clones viraux recombinants dans les semis de maïs pour la mise en silence génétique. Il décrit le processus d’infection à Agrobacterium , la propagation systémique du virus et les changements phénotypiques liés...

Délivrance médiée par Agrobactérie de clones viraux recombinants dans les semis de maïs pour le silence génétique

Induite par le virus gene silencing est un outil utile pour identifier les gènes impliqués dans la résistance non hôte des plantes. Nous démontrons l'utilisation d'agents pathogènes bactériens exprimant GFPuv dans l'identification des gènes des plantes silencieux sensibles aux pathogènes non hôtes. Cette approche est simple, rapide et facilite le dépistage à grande échelle et un protocole similaire peut être appliquée à l'étude de divers autres interactions plantes-microorganismes.

VIGS-Mediated dépistage génétique avant pour l&#39;identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte

La production de protéines dans les plantes de Nicotiana transitoire basée sur l'infiltration sous vide avec Agrobacteria transportait des vecteurs de lancement (virus de la mosaïque à base de tabac) est une approche rapide et économique pour produire des antigènes de vaccins et de protéines thérapeutiques. Nous avons simplifié la procédure et amélioré l'accumulation de cible en optimisant les conditions de culture de bactéries, la sélection des espèces hôtes, et co-introduction de RNA...

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Nous avons développé un protocole simple et efficace pour la préparation de grandes quantités de protoplastes de soja afin d’étudier les mécanismes réglementaires et signalisation complexes dans des cellules vivantes.

Une méthode Simple pour l’isolement de protoplastes de soja et Application aux Analyses d’Expression génétique transitoire

Ici, nous présentons une méthode de criblage modifiée qui peut être employée intensivement pour examiner rapidement des suppresseurs de silençage d'ARN dans les agents pathogènes de plante.

Dépistage et identification des suppresseurs de silençage de l'ARN des agents d'effets sécrétés des pathogènes végétaux

Un protocole d’injection (agroinjection) à base d’Agrobacterium est présenté pour l’inoculation du virus de la mosaïque de la queue de renard et du virus de la mosaïque de la canne à sucre dans les semis de maïs. L’inoculation de cette manière conduit à une infection virale, à un silençage génique induit par le virus des gènes marqueurs et à une surexpression virale de GFP.

Agroinoculation directe de plants de maïs par injection avec le virus recombinant de la mosaïque de la queue de renard et le virus de la mosaïque de la canne à sucre Clones infectieux

Nous présentons ici un protocole pour la production à haute efficacité de racines velues de soja transgéniques.

Transformation racinaire poilue du soja pour l’analyse de la fonction génique

Nous présentons ici le premier protocole d’infiltration sous vide localisée pour des études in vivo de la transformation génétique de plantes de grande taille. En utilisant cette méthodologie, nous avons réalisé pour la première fois la transformation transitoire du cacao par Agrobacterium in planta .

Agro-infiltration forcée sous vide pour la transformation in planta de plantes récalcitrantes : le cacao comme étude de cas

Découvrez le silençage de gènes induit par virus chez le coton via Agrobacterium, utilisant le virus TRV pour étudier la fonction du gène GrCLA1. Cette méthode rapide permet d'observer le phénotype albinos en deux semaines.

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

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