Name: Micro-ondes assistée diagnostic rapide des maladies virales des plantes par microscopie électronique à transmission (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez un diagnostic rapide des maladies virales des plantes par microscopie électronique à transmission assistée par micro-ondes. Cette méthode réduit le temps de préparation à deux heures pour un diagnostic en une demi-journée.

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Ce travail a été soutenu par le Fonds autrichien pour la science (FWF, P20619 P22988 et à BZ).

Préparation de l'échantillon à micro-ondes assistée <ol><li> Avant le début de la préparation des échantillons doit programmer le processeur micro-ondes automatique des tissus pour la microscopie électronique (EM AMW Leica, Leica Microsystems, Vienne, Autriche) avec les protocoles suivants (tableau 1) pour la préparation d'échantillons pour le TEM micro-ondes assistée: <img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="Tableau 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> Tableau 1. Protocole de préparation de l'échantillon en utilisant un rayonnement micro-ondes. Les différentes colonnes indiquent (de gauche à droite): <ol><li> Nombre flacon (nr Vial.) Représente l'ordre dans lequel le flacon est chargé dans le carrousel du processeur. </li><li> Étape du processus réel. </li><li> Réactifs dans les flacons. </li><li> Durée de l'étape actuelle. </li><li> La température maximale qui est atteinte dans le flacon avant l'irradiation micro-ondes est mis hors tension. </li><li> Réglage irradiation micro-ondes: Continu = incrément rapide de la températurease, maintien de la température de consigne; Pente = augmentation de la température douce, la température finale atteinte à la fin; pulsé = augmentation rapide de la température, il s'est éteint jusqu'à ce que la température baisse de 5 ° C, la puissance repris pour atteindre la température. </li><li> Puissance maximale de l'irradiation micro-ondes. </li></ol></li><li> Fraîchement préparer les solutions pour les différentes étapes décrites dans le protocole de préparation d'échantillon (pour résine époxy Agar 100 voir 1.7), les remplir dans les flacons désignés selon le protocole programmé (tableau 1), charger les flacons sur le carrousel, puis insérez le carrousel dans le traitement des tissus à micro-ondes, et finalement charger le premier flacon dans la chambre de mono-mode. </li><li> Découpez de petites sections de feuilles (1mm 2) de Nicotiana tabacum infectée par le virus de la mosaïque du tabac (TMV) avec une lame de rasoir sur une plaque de cire à modeler dans une goutte de glutaraldéhyde à 3% (Agar Scientific Ltd, Stansted, Angleterre) dans 60 mM Sørensen tampon phosphate (pH 7,2) à la température ambiantetérature. </li><li> Transférer les sections fines avec des pincettes tout de suite dans les paniers désignés avec une largeur de maille d'environ 200 um. Empiler les paniers les uns sur les autres et de les insérer dans la chambre de mono-mode. Il faut veiller à ce que les échantillons sont constamment couvertes de la solution de fixation pendant le chargement et l'empilage des paniers afin qu'ils ne se dessèchent pas. </li><li> Démarrer le micro-ondes préalablement programmé assistée protocole de préparation des échantillons pour la fixation, la déshydratation et l'infiltration. </li><li> Alors que la préparation des échantillons est effectuée automatiquement par le processeur tissu micro-ondes continuer avec coloration négative avec la matière végétale restante comme décrit dans la section 3 (coloration négative). </li><li> Fraîchement préparer résine époxy Agar 100 en mélangeant les composants suivants comme décrit: remplissage 24g Agar 100, 16g d'anhydride succinique dodécényle, et 10 g d'anhydride méthyl nadique (pour toutes les composantes voir Agar Scientific Ltd, Stansted, Angleterre) dans un gobelet en plastique, chaleur elle à40 ° C et bien mélanger. Ajouter 1,2 g de benzyldiméthylamine et bien mélanger. Remplir de résine époxy Agar 100 dans la polymérisation désigné se forme juste avant le protocole de préparation de l'échantillon arrive à son terme (par exemple, lors de l'étape 22 dans le tableau 1). </li><li> Une fois le protocole terminé (après l'étape 22 dans le tableau 1) libérer les paniers empilés contenant les échantillons infiltrés à partir de la chambre de mono-mode dans le dernier flacon du carrousel. Retirez le carrousel de l'appareil à micro-ondes, dépiler les paniers et les charger à l'aide de pinces fines dans les formes polymérisation désignés. Il faut veiller à ce que les échantillons sont toujours recouverts de résine époxy Agar 100 au cours de dépilage et le chargement de sorte qu'ils ne se dessèchent pas. </li><li> Empiler les formulaires de polymérisation au-dessus de l'autre. Il faut veiller à ce que les échantillons sont toujours recouverts de résine époxy Agar 100 lors de l'empilage et de chargement afin qu'ils ne se dessèchent pas. </li><li> Retirer les flacons utilisés précédemment dans le carrousel de la micro-onde tissue processeur, chargez-le avec les paniers empilés et insérez le carrousel dans le traitement des tissus à micro-ondes. </li><li> Démarrez le protocole de polymérisation précédemment programmé (tableau 1). </li><li> Alors que la polymérisation est effectuée automatiquement par le processeur tissu micro-ondes, d'examiner les grilles colorées négativement avec un microscope électronique à transmission [par exemple Philips CM10 TEM, FEI (anciennement Philips), Eindhoven, Pays-Bas] et effectuez l'analyse d'image comme décrit dans la section 3 et 4 ( coloration négative et analyse d'image). </li><li> Après le protocole est terminée, retirez les formes de polymérisation de la chambre de mono-mode, dépiler les formes de polymérisation et enlever les blocs polymérisés contenant les échantillons. Ils sont maintenant prêts à être sectionné avec un microtome. </li></ol> 2. Découper et de sectionnement <ol><li> Insérez un ou plusieurs blocs dans des porte-échantillons distincts pour la coupe ultra fin avec l'échantillon sur le collage supérieure d'environ 1 cm de la porte. </li><li>Coupez le bloc avec une tondeuse échantillon pour TEM (par exemple Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems) de sorte qu'une face du bloc de max. 1 mm de longueur et 200 um de largeur, qui contient du matériel foliaire autant que possible est atteint (la taille du bloc visage pourrait être nécessaire d'ajuster à la taille du couteau de diamant). </li><li> Section du bloc avec un ultramicrotome (par exemple Reichert Leica Ultracut S; Leica Microsystems) à l'aide d'un couteau de diamant à un angle de 45 ° couteau (p. ex Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, Autriche). L'épaisseur de coupe doit être réglé à environ 70 à 90 nm et la vitesse de coupe doit être d'environ 1 mm / s. Procurez-vous plusieurs sections avec un formvar (Agar Scientific Ltd) recouvert de cuivre ou de nickel 200 grille à mailles carrées. </li><li> Post-tacher les sections sur la grille avec du citrate de plomb (Agar Scientific Ltd; citrate de plomb dissous dans 42ml 1.1g eau bidistillée et 8ml NaOH 1N) pendant 5 minutes dans une boîte de Pétri partiellement remplis avec du NaOH pour créer une émission de CO 2 l'environnement et pour 15 kmnutes avec de l'acétate d'uranyle 1% (Agar Scientific Ltd) dissous dans de l'eau distillée à température ambiante. Laver les grilles avec de l'eau distillée pendant 1 minute entre chaque étape de post-coloration. Sécher à l'air les grilles dans une maille. </li><li> Examiner les sections avec un microscope électronique à transmission (TEM par exemple Philips CM10, FEI, Eindhoven, Pays-Bas). </li></ol> 3. Coloration négative <ol><li> Récolte environ 100 mg de TMV-infecté des feuilles et préparer sève brute en homogénéisant le matériel pendant 2 minutes avec une lame de rasoir sur une lame de microscope dans 100 ul de 60 mM de tampon phosphate Søfrensen (pH 7,2). </li><li> Transfert 20 pi de l'homogénat obtenu sur le premier puits d'une lame de microscope enduite de téflon avec 4 ou plusieurs puits (en variante, il est également possible de transférer le broyat sur un morceau de parafilm). </li><li> Placer une grille formvar revêtu sur le dessus de l'homogénat avec la formvar (Agar Scientific Ltd) côté enduit tournée vers la goutte et incuil bate de 5 minutes. </li><li> Laver la grille 2 fois pendant 2 minutes chacun en plaçant la grille au-dessus de deux gouttes de 200 pl 60 mM Sørensen tampon phosphate (pH 7,2). </li><li> Incuber la grille pendant 1 minute avec un acide phosphotungstique fraîchement préparée de 2% (Agar Scientific Ltd) en solution dans 60 mM Sørensen tampon phosphate (pH 6,5). </li><li> Retirez la grille et le laisser sécher à l'air dans une maille. </li><li> Examinez la grille avec un microscope électronique à transmission (par exemple Philips CM10 TEM; FEI, Eindhoven, Pays-Bas). Prendre au moins 10 images de virions choisis au hasard coloration négative (au moins 10 ou plus virions doit être visible sur chaque image) avec le microscope électronique à transmission à un grossissement primaire de 21000X ou plus. Il faut veiller à ce que toutes les images ont le même grossissement. </li></ol> 4. L'analyse d'image <ol><li> Mesurer la longueur et la largeur d'au moins 100 particules de virus choisis au hasard simples sur les micrographies réalisées à partir deles échantillons colorées négativement à l'aide de n'importe quel logiciel d'analyse d'images [Cell par exemple D (Olympus, Vie et Sciences des Matériaux Europe GmbH, Hamburg, Allemagne) avec l'outil d'analyse de particules ou Optimas 6.5.1-(Media Cybernetics Inc, Bethesda, Maryland, USA)]. </li><li> Calculer les moyennes et les écarts types pour atteindre une longueur moyenne et la largeur des particules virales visualisés par coloration négative méthodes et TEM. </li><li> Comparer la longueur et des caractéristiques ultrastructurales (obtenu en 2.5) avec des tailles de virus et des altérations ultrastructurales induites par les maladies virales connues dans la littérature afin d'identifier clairement les maladies virales. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Après avoir assisté à micro-ondes de préparation des échantillons typiques TMV-induites modifications ultrastructurales tels que grandes surfaces contenant des virions alignés sous forme parallèle a pu être observée au microscope électronique à transmission dans le cytosol des personnes infectées Nicotianquelques cellules tabacum (figure 1A). En outre, dans la sève brute de TMV-infecté laisse particules TMV a pu être observé que flexueux, en forme de bâtonnets structures après coloration négative (figure 1B). Analyse de l'image de 100 particules virales ont révélé une taille moyenne de 280 nm pour TMV en longueur et en largeur 17Nm (figure 2). L'ultrastructure de cellules infectées par le TMV et la taille des virions observés dans cette étude ont été jugés en conformité avec TMV propriétés induites par le tabac et ultrastructurales dans la gamme de taille de particules TMV précédemment rapportés dans la littérature 9-15. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Micrographies électroniques à transmission de cellules infectées par le TMV feuilles et des virions. A) L'image montre l'ultrastructure des cellules infectées par le TMV feuilles mésophylle de Nicotiana tabacum après-ondes usine de préparation d'échantillons assistée. Notez la grande région de virions parallèles alignés qui se sont accumulés dans le cytosol.C = chloroplastique avec de l'amidon (St), M = mitochondrie, N = noyau, V = vacuole, Bar = 2 pm. B) L'image montre des virions qui ont été détectées par coloration négative dans la sève des feuilles infectées. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Taille relative des virions. Distribution relative de la longueur et la largeur de TMV-particules après coloration négative la sève des feuilles infectées telles qu'elles figuraient dans le microscope électronique. Les valeurs moyennes (moyenne longueur / largeur ± écart-type) ont été calculés à partir de 100 virions.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Micro-ondes préparation assistée échantillon de plante pour le TEM a été prouvé à fournir des données rapide et fiable ultrastructurales dans les quelques heures 3,4,16. La préservation structurale fine des organites et membranes obtenus avec la méthode utilisée dans cette étude était similaire aux échantillons conventionnels et cryofixed 5,15 avec l&#39;avantage d&#39;une réduction massive de la fixation de l&#39;échantillon et l&#39;incorporation de temps de 3 jours ou plus pour environ 2 heures. Cela représente le protocole le plus rapide de préparation des échantillons pour le TEM actuellement disponibles dans la littérature. La méthode décrite dans cette étude a combiné micro-ondes préparation assistée échantillon de plante pour le TEM aux méthodes de coloration négative qui a permis une identification claire et rapide de TMV-induites modifications ultrastructurales et l&#39;agent viral lui-même. TMV modifications ultrastructurales induites pourraient être étudiés après la coupe, de sectionnement et de post-marquage pendant environ 4 heures après le début de la fixation de la transmission électron microscope. Utilisation de la manière entièrement automatique en mode de préparation des échantillons libéré le chercheur pour mener coloration négative dans l&#39;intervalle afin de déterminer la taille et la largeur de l&#39;agent viral. Ainsi, nous pouvons conclure que cette méthode permet un diagnostic clair et rapide des maladies à virus des plantes en une demi-journée qui est d&#39;une grande importance pour une utilisation future dans des expériences agricoles et scientifiques des plantes phytopathologie. Comme cette méthode pourrait également être utilisée pour le diagnostic rapide des maladies animales et humaines qu&#39;il a un grand potentiel pour des applications futures dans le domaine médical et de pathologie vétérinaire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Glutaraldéhyde </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1312 </td><td></td></tr><tr><td> Tétroxyde d&#39;osmium </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1022 </td><td></td></tr><tr><td> 100 agar résine </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1043 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;anhydride dodécénylsuccinique </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1051 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;anhydride méthyl nadique </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1081 </td><td></td></tr><tr><td> Benzyldiméthylamine </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1060 </td><td></td></tr><tr><td> Citrate de plomb </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1210 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acétate d&#39;uranyle </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1260A </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide phosphotungstique </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1213 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1202 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Leica EM AMW </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultratrim </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Modèle plus récent est disponible </td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultracut S </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Modèle plus récent est disponible </td></tr><tr><td> Diatome Ultra 45 </td><td> Gröpl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Philips CM10 TEM </td><td> FEI (anciennement Philips) </td><td> &lt;/ Td&gt; <td> Modèle plus récent est disponible </td></tr><tr><td> La cellule D </td><td> Olympus Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Optima 6.5.1 </td><td> Media Cybernetics Inc </td><td></td><td> Une version plus récente est disponible </td></tr></tbody></table>

micro-ondes assistée diagnostic rapide des maladies virales des plantes par microscopie électronique à transmission

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Les enquêtes sur les modifications ultrastructurales induites par les virus sont souvent nécessaires pour identifier clairement les maladies virales chez les plantes. Avec une préparation d&#39;échantillon conventionnel pour microscopie électronique à transmission (MET) de telles enquêtes peut prendre plusieurs jours 1,2 et ne sont donc pas adapté pour un diagnostic rapide des maladies à virus des plantes. Fixation à micro-ondes peut être utilisé pour réduire considérablement le temps de préparation d&#39;échantillons pour les enquêtes TEM avec des résultats similaires à ceux observés ultrastructurales après préparation des échantillons conventionnelle 3-5. Beaucoup de différents dispositifs sur mesure à micro-ondes faites sont actuellement disponibles qui peuvent être utilisés pour la fixation réussie et l&#39;intégration des échantillons biologiques pour les enquêtes TEM 5-8. Dans cette étude, nous montrons sur le virus de la mosaïque du tabac (TMV) infecté plantes de Nicotiana tabacum qu&#39;il est possible de diagnostiquer des altérations ultrastructurales dans les feuilles en une demi-journée à l&#39;aide de la préparation des échantillons à micro-ondes assistée pour TEM. Nous avons choisi de réaliser cette étude avec un appareil à micro-ondes disponible dans le commerce car il effectue la préparation des échantillons presque entièrement automatiquement 5 à la différence des autres appareils disponibles, où de nombreuses étapes doivent encore être effectuées manuellement 6-8 et sont donc plus de temps et beaucoup de travail. En préparation de l&#39;échantillon est effectuée de manière entièrement automatique coloration négative de particules virales dans la sève des autres TMV feuilles infectées et l&#39;examen suivant de l&#39;ultrastructure et la taille peut être effectuée lors de la fixation et l&#39;inclusion.

Cette étude décrit une méthode qui permet le diagnostic rapide et claire des maladies à virus des plantes en une demi-journée à l&#39;aide d&#39;une combinaison de micro-ondes usine de préparation d&#39;échantillons assistée par microscopie électronique à transmission et les méthodes de coloration négative.

Micro-ondes assistée diagnostic rapide des maladies virales des plantes par microscopie électronique à transmission

Les études des changements ultrastructuraux induits par les virus sont souvent nécessaires pour identifier clairement les maladies virales chez les plantes. Avec un échantillonnage conventionnel...

L'objectif général de cette procédure est de diagnostiquer les maladies virales des plantes en quelques heures par microscopie électronique en transmission. Cette procédure commence par une fixation et une inclusion assistées par micro-ondes du matériel végétal infecté. L'étape suivante consiste à extraire et à colorer les particules virales à partir des échantillons végétaux par coloration négative, suivie de la sectionnement des échantillons végétaux inclus. Les échantillons sont ensuite analysés au microscope électronique en transmission et la taille des particules virales est mesurée par analyse d'image. En définitive, les résultats révèlent des altérations ultrastructurales typiques induites par le virus ainsi que la taille des particules virales, grâce aux méthodes de microscopie électronique en transmission. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la fixation et l'incorporation classiques à température ambiante, qui peuvent prendre plusieurs jours, réside dans le fait que le temps de préparation des échantillons pour la microscopie électronique en transmission peut être réduit à environ deux heures, permettant ainsi un diagnostic clair de la maladie virale en environ une demi-journée.En collaboration avec moi pour démontrer cette procédure, seront présents Gerhard Kaba, technicien, et le professeur Zelnik, un collègue de notre laboratoire. Avant le début du programme de préparation des échantillons, configurez le processeur automatique de tissus par micro-ondes pour microscopie électronique LA A-E-M-A-M-W avec les protocoles appropriés. Préparez les solutions nécessaires aux différentes étapes décrites dans le protocole programmé — fixation, déshydratation et infiltration — puis versez-les dans les flacons désignés selon le protocole. Placez les flacons sur le plateau tournant. Insérez le plateau tournant dans le processeur de tissus par micro-ondes, puis chargez le premier flacon dans la chambre à mode unique.Ensuite, découpez de petits morceaux de feuilles de tabac *Nicotiana* infectées par le virus de la mosaïque du tabac, ou TMV, à l’aide d’un scalpel sur une plaque de cire de modelage, dans une goutte de glutaraldéhyde en tampon phosphate-sorénus à température ambiante. Lors de la récolte des échantillons et de leur chargement dans les paniers, il est essentiel de s’assurer qu’ils sont toujours recouverts de solution fixatrice afin qu’ils ne s’assèchent pas. À l’aide de fines pinces, transférez immédiatement les fragments dans les paniers désignés, dont la largeur de maille est d’environ 200 µm.Empilez les paniers les uns sur les autres et insérez-les dans la chambre du mode mono. Démarrez le protocole de préparation d'échantillon assisté par micro-ondes programmé précédemment pour la fixation, la déshydratation et l'infiltration. Juste avant la fin du protocole de préparation d'échantillon, remplissez avec la résine époxy Agar 100 fraîchement préparée les moules de polymérisation désignés.Une fois le protocole terminé, sortir les paniers empilés contenant les échantillons infiltrés de la chambre en mode mono et les placer dans le dernier flacon du plateau tournant. Retirer le plateau tournant de l'appareil à micro-ondes et prélever le flacon contenant les échantillons du plateau. Puis, extraire les paniers du flacon et les désassembler à l’aide de pinces fines.Chargeez les échantillons dans les moules de polymérisation désignés. Ensuite, empilez les moules de polymérisation les uns sur les autres et retirez les flacons précédemment utilisés du plateau tournant du processeur de tissus par micro-ondes. Chargez le plateau tournant avec les paniers empilés et insérez-le dans l'appareil à micro-ondes.Démarrer maintenant le protocole de polymérisation précédemment programmé. Une fois le protocole terminé, retirer les moules de polymérisation de la chambre à mode unique et les démonter. Extraire les blocs polymérisés contenant les échantillons, qui sont désormais prêts à être coupés au microtome pour entamer la procédure de sectionnement des blocs contenant les échantillons.Insérez un ou plusieurs blocs dans des porte-échantillons séparés pour la coupe ultramince. Placez l'échantillon vers le haut, en laissant dépasser environ un centimètre du porte-échantillon. Taillez le bloc à l’aide d’un taille-bloc pour MET afin d’obtenir une surface de bloc mesurant au maximum un millimètre de longueur et 200 micromètres de largeur, contenant autant que possible du matériel foliaire.Régler le microtome ultrapérissable pour couper des sections d'une épaisseur d'environ 70 à 90 nanomètres à une vitesse de coupe d'environ un millimètre par seconde. Sectionner le bloc à l'aide d'un couteau en diamant avec un angle du couteau de 45 degrés. Prélever plusieurs sections avec une grille carrée en cuivre ou en nickel recouverte de VAR, de 200 mailles, puis colorer les sections sur la grille avec du citrate de plomb pendant cinq minutes dans une boîte de Pétri partiellement remplie de NA OH afin de créer un environnement exempt de CO2.Lavez les grilles à l’eau distillée pendant une minute. Enfin, effectuez une coloration secondaire pendant 15 minutes avec de l’acétate d’urane à 1 % dissous dans de l’eau distillée à température ambiante après avoir lavé les grilles à l’eau distillée pendant une minute, puis faites sécher à l’air dans une boîte à grilles. La coloration négative du matériel végétal restant est réalisée pendant que la préparation de l’échantillon est effectuée automatiquement par le processeur de tissus au micro-ondes.Commencez par récolter environ 100 milligrammes de tissu foliaire infecté par le TMV et préparez un extrait brut en homogénéisant le matériel pendant deux minutes avec une lame de rasoir sur une lame de microscope en présence de buffer phosphate et de sornes. Transférez 20 microlitres de l'homogénat obtenu dans le premier puits d'une lame de microscope revêtue de téflon.Glissez avec quatre puits ou plus. Ensuite, placez une grille recouverte de forme VAR sur le haut de l'homogénat, le côté recouvert de forme VAR tourné vers la goutte, et incubez pendant cinq minutes. Lavez la grille pendant deux minutes en plaçant la grille sur une goutte de tampon phosphate de Sorensen.Répétez le lavage pendant encore deux minutes. Ensuite, incubez la grille pendant une minute avec une solution fraîchement préparée d'acide phospho stick langue. Après une minute, retirez la grille et laissez-la sécher à l'air.Dans une boîte de grille, insérez la grille colorée négativement dans le porte-échantillon et examinez-la au microscope électronique en transmission. Pendant que la polymérisation est effectuée automatiquement par le processeur de tissus au micro-ondes, prenez au moins 10 images d'ions colorés négativement choisis aléatoirement. Au moins 10 ions ou plus doivent être visibles sur chaque image.Avec le microscope électronique en transmission à un grossissement primaire de 21 000 x ou supérieur, il est essentiel de s'assurer que toutes les images possèdent le même grossissement. Les coupes contenant les échantillons de tissu traités automatiquement par le processeur de tissu à micro-ondes sont également examinées au microscope électronique en transmission. L'analyse des images obtenues par MET peut être réalisée à l'aide de tout logiciel d'analyse d'image.Logiciel informatique doté d'un outil d'analyse de particules. Mesurer la longueur et la taille d'au moins 100 particules virales simples choisies aléatoirement sur les micrographies obtenues à partir des échantillons colorés négativement. Calculer les moyennes et les écarts types afin d'obtenir une longueur et une largeur moyennes des particules virales visualisées par les méthodes de coloration négative et de MET après une préparation d'échantillon assistée par micro-ondes.Des altérations ultrastructurales typiques induites par le TMV, telles que de grandes zones contenant des ions alignés parallèlement, peuvent être observées au microscope électronique en transmission dans le cytosol de cellules de tabac nicotiana infectées. Sur cette micrographie électronique en transmission, C représente un chloroplaste avec de l'amidon. St.M correspond à une mitochondrie, N au noyau, et V à une vacuole.De plus, dans le jus brut de feuilles infectées par le TMV, des particules de TMV pouvaient être observées sous forme de structures rodéennes après coloration négative. Figure un B. Ce graphique montre la distribution relative de la longueur et de la largeur de 100 particules de TMV telles qu'elles sont apparues au microscope électronique. Après coloration négative, l'analyse d'image du jus de feuilles infectées a révélé une taille moyenne du TMV de 280 nanomètres de longueur et de 17 nanomètres de largeur, suite à son développement pour le diagnostic rapide des maladies virales cérébrales.Cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans les domaines de la pathologie animale et humaine pour diagnostiquer rapidement les maladies animales et humaines par microscopie électronique en transmission.

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