Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo

L’un des défis de l’étude du développement en neurosciences est de capturer les morphologies dendritiques et axonales à l’échelle d’une seule cellule in vivo. Dans le système olfactif, les neurones sensoriels olfactifs étendent leurs axones de l’épithélium olfactif du nez au bulbe olfactif du cerveau. Lorsque plusieurs neurones sensoriels olfactifs se projettent vers le bulbe olfactif, ils se fascinent en faisceaux.

Cela complique l’étude des trajectoires axonales individuelles et de leurs morphologies terminales. Nous avons développé une méthode pour visualiser des neurones sensoriels olfactifs uniques in vivo en micro-injectant une construction GFP. Porteur de lentivirus.

Une transduction réussie avec le lentivirus illumine toute la longueur de l’axone sensoriel olfactif, y compris l’arbre terminal. En plus de visualiser des neurones sensoriels olfactifs uniques, cette méthode nous permet de manipuler l’expression génique d’un gène d’intérêt particulier pour étudier sa fonction dans un contexte in vivo. Cette procédure de lentivirus est de niveau de biosécurité deux et doit être effectuée dans une hotte à flux laminaire.

Pour maintenir un environnement stérile, vaporisez tout ce qui est inséré dans la hotte avec de l’éthanol à 70 % dans la hotte, préparez et préchauffez un lit à eau à 37 degrés au moins 20 minutes. Avant l’injection. Fermez un sac de rangement en plastique à moitié plein avec de l’eau et placez-le sur un incubateur à bloc chauffant vide.

Cela permettra aux souris de récupérer après l’injection. Remplissez un contenant de déchets biologiques avec de l’eau de Javel à 10 % pour décontaminer tout le matériel exposé aux virus. À partir de cette procédure, préparez un petit plat ouvert à 70 % d’éthanol et un deuxième plat avec de l’eau distillée stérile.

Dans une hotte à flux laminaire, nous utiliserons une seringue Hamilton d’une capacité de cinq microlitres avec une aiguille de calibre 33. Ce modèle particulier vous permet d’ajuster la résistance du piston en tournant un cadran de tension situé en haut de la chambre du piston. Cette fonction permet de contrôler le volume de micro-injection pour stériliser la chambre de l’aiguille et de la seringue.

Aspirez et éjectez plusieurs fois l’éthanol de la parabole. Rincez la cartouche de la seringue en aspirant et en éjectant plusieurs fois de l’eau stérile. Placez la seringue en toute sécurité dans la hotte.

Disposez des lingettes imbibées d’alcool près de la station d’injection. Préparez une étape d’injection qui offre une surface surélevée qui facilitera le positionnement de la souris. On peut utiliser une boîte de culture inversée de 10 centimètres recouverte de lingettes Kim.

Les bébés souris peuvent être anesthésiés par hypothermie jusqu’à l’âge du sevrage. Découpez le doigt d’un gant en caoutchouc et placez le bébé souris dans le doigt qui coupe. Ensuite, placez sur de la glace pendant cinq minutes.

Le gant empêchera les brûlures cutanées qui se produiraient en cas de contact direct de la peau avec la glace pour une anesthésie complète en pinçant l’arrière et les quatre pattes du chiot pour s’assurer que l’animal ne répond pas. Nous sommes maintenant prêts pour la micro-injection de lentivirus. Nous ferons une démonstration avec un chiot nouveau-né.

Si une souris plus âgée est utilisée, il faut remplacer l’aiguille de calibre 33 par une aiguille de calibre plus épais afin de pénétrer la surface du crâne. Stérilisez la surface du nez de la souris en l’essuyant avec un tampon imbibé d’alcool. Retirer les stocks de lentivirus du congélateur et les décongeler sur de la glace.

Nous avons nous-mêmes produit du lentivirus en laboratoire en utilisant des méthodes établies. En développant cette méthode, nous avons constaté qu’un titre viral minimal de 10 à la neuvième unité infectieuse par mil est nécessaire pour un bon taux de transduction. Aspirez deux microlitres de solution mère de lentivirus dans la seringue Hamilton stérilisée.

Placez le chiot souris sur l’étape d’injection. Saisissez la peau sur le dessus de la tête au niveau des oreilles et tirez doucement vers l’arrière. Nous avons équipé notre hotte d’une lunette de dissection.

Afin de diriger avec précision les micro-injections, recherchez la surface dorsale du crâne au niveau du cerveau antérieur pour un contour du bulbe olfactif. Nos cibles de micro-injection entourent étroitement le bulbe olfactif, mais ne doivent pas inclure le bulbe lui-même. Nous administrons quatre injections dans l’épithélium olfactif de chaque chiot.

Ces positions représentées par des points bleus nécessitent que l’aiguille soit insérée à un angle dirigé médialement. Les deux injections supplémentaires représentées par des points verts sont décalées, plus médialement et antérieurement au bulbe olfactif. Ces injections peuvent être inclinées de manière coddée.

Les suggestions d’angles d’aiguille sont faites en tenant compte du positionnement ventral de l’épithélium olfactif, qui est principalement situé sous le bulbe olfactif. L’accès perpendiculaire est donc restreint. Insérez l’aiguille dans le haut de la cavité nasale à environ trois millimètres sous la surface de la peau.

Pour atteindre l’épithélium olfactif. Une main entraînée devrait sentir la baisse de résistance lorsque l’espace luminal de la cavité nasale est atteint. Cette zone est à éviter.

Micro-injecter 0,5 microlitre de solution mère de virus par position. Encore une fois, en choisissant deux sites de chaque côté, à gauche et à droite, quatre injections totalisent 0,5 microlitre. Chaque souris signifie deux microlitres de virus nécessaires par souris en une seule séance d’injection.

Encore une fois, veillez à ne pas injecter le bulbe olfactif pour sécher toute solution virale résiduelle ou du sang qui pourrait s’échapper du site d’injection ou des ouvertures nasales. À l’aide d’une lingette à l’éthanol, jetez les lingettes dans le récipient liquide blanchi dilué, placez immédiatement la souris injectée sur l’incubateur à lit d’eau pour la récupération. Décontaminer la seringue à aiguille en répétant la procédure de stérilisation effectuée pendant la préparation Les souris injectées peuvent être renvoyées dans leur cage 30 minutes après leur récupération sur l’incubateur à lit d’eau.

L’intégralité de cette micro-injection peut être répétée en quatre heures. Si vous souhaitez augmenter le nombre de neurones sensoriels olfactifs qui seront infectés, les neurones sensoriels olfactifs infectés peuvent être visualisés sur toute la longueur de la cellule en aussi peu que trois jours. Les animaux sacrifiés et perfusés pour l’observation au moment souhaité.

À l’aide de méthodes standard, afin de visualiser les trajectoires des neurones sensoriels olfactifs et les terminaisons axonales transduits, nous disséquons et sectionnons le bulbe olfactif coronal à une épaisseur de 60 microns. La section contiendra donc toutes les couches cellulaires du bulbe olfactif, y compris les faisceaux axonaux des neurones sensoriels olfactifs et les terminaisons axonales, qui font synapse dans des structures glomérulaires liées à la surface du bulbe en préparation de l’immunohistochimie flottante. Des sections en série du bulbe olfactif sont fabriquées et balayées collectivement dans une boîte de culture de 10 centimètres avec cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate.

Transférez les sections flottantes dans un flacon conique de 50 millilitres. Une fois que les sections se sont déposées au fond du flacon, aspirez la solution saline tamponnée au phosphate. Faites attention à ne pas aspirer.

Vos sections se remplissent de 10 millilitres de tampon frais pour éliminer tout résidu de fixateur ou de matériau d’enrobage. Pipetez immédiatement cette remise en suspension dans un flacon conique de 15 millilitres, en veillant à capturer toutes les sections flottantes, aspirez la solution de rinçage et perforez les sections avec une solution saline de 0,3 % Triton X 100 dans un tampon phosphate placé sur une plate-forme à bascule pendant 10 minutes. À température ambiante, vous pouvez ensuite procéder à un protocole d’immunocoloration standard dans le même flacon conique, en répétant les étapes de vide et de bascule au besoin pour ce récipient de taille, en conservant un volume de 10 millilitres pour les étapes de coloration et de rinçage.

Voici une liste d’anticorps que nous utilisons pour co-colorer les neurones sensoriels olfactifs transduits positivement et la population générale de neurones sensoriels olfactifs. Pour une pénétration complète des anticorps dans les sections de l’ampoule de 60 microns, il est recommandé d’incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. La profondeur de lavage ne doit pas non plus être inférieure à 20 minutes chacune.

Étalez doucement chaque section sur une lame de verre à l’aide d’un pinceau : montez chaque lame avec la flore Mount G complétée par une solution de coloration à la chromatine. Efforcez-vous d’éliminer toutes les bulles du support de montage. Montez vos sections en rangées pour simplifier l’étape de criblage suivante.

Scannez ces couches sur les sections de votre bulbe d’immunocoloration pour les fibres axonales et les terminaisons positives de la GFP. À l’aide d’un microscope fluorescent, les terminaisons nerveuses infectées positivement peuvent ensuite être imagées par microscopie confocale. Il est utile de calibrer le plan focal dans votre zone d’intérêt à l’aide du DPI et des canaux protéiques marqueurs olfactifs.

Ces résultats montrent qu’un seul neurone capteur olfactif et une terminaison axonale dans le glomérule, qui est CO avec protéine marqueur olfactive en rouge et vlu deux en gris Les corps cellulaires neuronaux du capteur olfactif infectés et leur bouton dendritique peuvent également être visualisés dans l’épithélium olfactif si ce tissu a été inclus dans les étapes de dissection et d’immunomarquage. Bonjour, ma projection confocale nous fournit une morphologie très détaillée d’un seul neurone sensoriel olfactif, d’un seul chemin d’extension axonale et d’un seul arbre terminal. On peut voir l’accrochage de la fibre axonale vers sa cible glomérulaire, ainsi que les détails de son motif de ramification dans la pilule neuro glomérulaire.

La méthode de micro-injection lentivirale permet de visualiser les axones unicellulaires, les morphologies des neurones sensoriels olfactifs, et permet des études qui manipulent l’expression des gènes, la transduction du lentivirus aboutit à une intégration génomique stable des constructions. Le lentivirus n’infecte pas trans-synaptiquement les cellules voisines. La visualisation peut être réalisée en aussi peu que trois jours et il a été confirmé qu’elle dure au moins trois mois et persiste probablement pendant de plus longues périodes.

Les neurones sensoriels olfactifs ne sont pas facilement infectés par l’infusion nasale d’une solution de lentivirus. Par conséquent, une micro-injection à travers la surface est nécessaire dans cette procédure. C’est donc notre procédure de micro-injection de lentivirus.

J’espère que vous avez trouvé toutes ces informations utiles pour obtenir des morphologies de cellules uniques de votre propre chasse heureuse.