Name: Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Découvrez la manipulation génétique par lentivirus pour visualiser les neurones sensoriels olfactifs in vivo. Cette méthode permet d'étudier les trajectoires axonales individuelles et leurs arborisations terminales dans le système olfactif.

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Cette étude est soutenue par le NIH et DC052256 DC006015, et NSF 0324769 au QG et T32-DC008072 à BS.

1. Préparation Cette procédure est la biosécurité de niveau 2, donc toutes les préparations suivantes sont faites dans une hotte Biohazard où la procédure de micro-injection est réalisée. <ol><li> Préparer et préchauffer à 37 ° C à eau: Remplissez un sac de rangement en plastique avec de l&#39;eau - joint et mis sur un bloc de chauffage vidé incubateur. Cela permettra de récupérer les souris après l&#39;injection. </li><li> Remplissez un récipient avec les déchets biologiques dangereux Javel à 10% à un volume adapté à l&#39;immersion de tous les déchets de cette procédure. </li><li> Préparer un petit plat ouverte de 70% d&#39;éthanol et d&#39;un second plat avec ddH2O stérilisés et les placer dans l&#39;enceinte de sécurité biologique. </li><li> Stériliser une capacité 5uL seringue Hamilton avec une aiguille de calibre 33 par pulvérisation bas du corps et de l&#39;aiguille avec de l&#39;éthanol à 70% avec le plongeur a sorti tout le chemin. À plusieurs reprises aspiration d&#39;éthanol à partir du plat et d&#39;éjecter tout le chemin au moins 5 fois. </li><li> Rincer la cartouche seringue en aspirant l&#39;eau stérile et l&#39;éjection d&#39;au moins 5 fois. Placez la seringue en toute sécurité de côté dans le capot de la culture et de lui permettre de sécher. </li><li> Retirer des stocks viraux de -80 stockage ° C et congélateur placer sur la glace pour permettre à la décongélation. Microinjection nécessite 2μL du stock de virus par souris à un titre de 10 9 unités infectieuses / ml. Les lentivirus peuvent être obtenus auprès de sources commerciales ou produites dans le laboratoire selon le protocole établi (Loïs et al., 2002). </li><li> Préparer une étape d&#39;injection qui fournit une zone surélevée au-dessus de la surface du capot - peut utiliser une boîte de culture 10cm recouvert d&#39;une feuille de Kimwipe. </li><li> Organiser des lingettes alcoolisées à proximité de la station d&#39;injection. </li></ol> 2. Microinjection de particules lentiviral dans l&#39;épithélium olfactif Toutes les procédures réalisées sur l&#39;animal dans cette méthode sont faites conformément aux lignes directrices approuvées IACUC. Le Mus musculus souche C57BL/6J est le modèle animal utilisé dans toutes les expériences ont démontré ici. <ol><li> Anesthésier souriceaux par hypothermie en prenant une souris chiot (P0-P3) hors de la cage et mettre le chiot sur un gant de coupe ouverte sur la glace pendant 5 minutes. </li><li> En attendant que le chiot à être entièrement anesthésié, 2μL aspiration du stock viral dans la seringue stérilisée Hamilton. </li><li> Placez la souris chiot au sommet de la phase d&#39;injection. Tirez doucement sur la peau loin du sommet de la tête à l&#39;oreille vers le haut de la nuque. Cela devrait fournir une surface de peau appris au cours de la cavité nasale et la facilité d&#39;injection. </li><li> Insérez l&#39;aiguille à travers la partie supérieure de la cavité nasale environ 3mm en dessous de la surface de la peau pour atteindre l&#39;épithélium olfactif. Microinject 0.5μL de solution virus par coup, en choisissant deux sites de chaque côté, à gauche et à droite (quatre injections au total par la souris = 2μL de virus nécessaire). Les sites d&#39;injection doivent être décalés les uns des autres. Pour cibler des sites d&#39;injection, de rechercher la surface du crâne dorsale pour le contour du bulbe olfactif. Cette ligne est à peine visible à la naissance par la peau semi-translucide et le crâne. Pour faire deux injections par côté, l&#39;objectif d&#39;une injection juste rostrale à un aperçu ampoule à un axe médian. Faire de l&#39;insertion latérale secondes au contour ampoule, assurez-vous encore à l&#39;angle de l&#39;injection médiale afin que vous puissiez atteindre l&#39;épithélium olfactif qui réside ventralement au-dessous de l&#39;ampoule. Éviter de pénétrer le bulbe olfactif! </li><li> Sécher toute solution virale résiduelle ou de sang qui peut s&#39;échapper du site d&#39;injection ou les ouvertures de la narine avec un Kimwipe. Jeter immédiatement Kimwipes dans le récipient eau de javel diluée Biohazard. </li><li> Placez la souris injectées sur le lit à eau incubateur. </li><li> Répétez les étapes 1-4 pour toutes les souris pour être injecté, se souvenant que vous aurez besoin d&#39;environ 2μL du stock de virus par souris. </li><li> Laissez-souris de récupérer sur le matelas d&#39;eau incubateur pendant 30 minutes avant de les retourner dans leur cage de ponte d&#39;origine. </li><li> Disposer de l&#39;étape de micro-injection, lingettes désinfectantes et tous les produits du papier de nettoyage supplémentaire dans l&#39;élimination de Javel risque biologique. </li><li> Nettoyer la seringue Hamilton par aspiration répétée et l&#39;éjection de l&#39;éthanol, puis l&#39;eau comme cela se fait dans les étapes de préparation. Laisser la seringue à sécher. </li><li> Pour une efficacité maximale de transduction répéter cette procédure à nouveau en 4 heures. ARS infectés peuvent être visualisées sur toute la longueur de la cellule en aussi peu que trois jours. </li></ol> 3. L&#39;immunohistochimie de flotter sections bulbe olfactif <ol><li> Sacrifice de la souris injectées au point dans le temps désiré et la perfusion fixer le tissu avec du paraformaldéhyde 4%. Disséquer l&#39;OB. Incuber dans paraformaldéhyde nuit, puis saccharose à 30% en PBS pendant une nuit. Intégrer dans les PTOM sur milieu d&#39;inclusion de la glace sèche. </li><li> Coronales sections OB sont obtenus à un 60μm d&#39;épaisseur en utilisant un cryostat. Balayer sections ampoule dans une boîte de culture 10cm avec 5mL 1x PBS (pH 7,4). Les articles doivent être conservés flottant dans du PBS pour permettre PTOM dissolve. Transfert sections flottantes et PBS dans un flacon de 50 ml conique. </li><li> Autoriser sections pour se déposent au fond du flacon. Vide hors PBS sans aspirer toutes les sections. Rincer les coupes de tissus avec 20 ml de PBS. Répétez les étapes s&#39;installer et passer l&#39;aspirateur. Resuspendre tissus avec 10 mL de PBS et de transfert de sections flottantes dans un flacon de 15 ml conique pour immunocoloration. Une fois les coupes de tissus sont installés, aspirateur hors du PBS surnageant sans déranger les tissus. Sections Resuspendre avec 0,3% de Triton X-100 dans du PBS 1X, pH 7,4 (PBS-Tx) permettant de détergent pour perforer les membranes cellulaires. Incuber 10 minutes à température ambiante. Vide le surnageant et l&#39;incubation répéter avec PBS-Tx deux fois. </li><li> Incuber les coupes de tissus dans 10 ml de solution de blocage (sérum de cheval à 5% dans du PBS-Tx) pendant deux heures à température ambiante. </li><li> Rincer la solution de blocage d&#39;au moins deux fois avec du PBS-Tx de 15 minutes chacune à la température ambiante. </li><li> Préparer 2mL d&#39;une solution d&#39;anticorps primaire dans du PBS-Tx. Voir la section Réactifs et équipements pour les anticorps utilisés dans cette expérience. </li><li> Remplacer seconde PBS-Tx lavez blocage avec une solution d&#39;anticorps primaire. Incuber sur une plate-forme à bascule lentement (~ 30rpm) à 4 ° C pendant 24-48 heures pour assurer une pénétration en profondeur dans les sections 60μm flottant. </li><li> Après incubation, la solution d&#39;anticorps primaires peuvent être récupérées avec soin en utilisant une pipette et conservés à 4 ° C pour les réutiliser jusqu&#39;à deux fois plus dans les deux semaines sans aucune perte significative de l&#39;intensité de la coloration. </li><li> Lavez sections à trois reprises dans du PBS-Tx de 20 minutes chacune à température ambiante avec une légère rotation (~ 30rpm). </li><li> Préparer 2mL de dilution anticorps secondaire dans du PBS-Tx. Aspirer le dernier lavage et ajouter une solution d&#39;anticorps secondaire à des coupes de tissus. Enveloppez l&#39;extérieur du flacon coloration dans du papier aluminium pour bloquer la lumière, qui peut causer photoblanchiment fluorophore. Placez enveloppé flacon sur une plate-forme à bascule lentement et laisser incuber à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Jeter la solution d&#39;anticorps secondaire par aspirateur loin. Lavez sections fois avec du PBS-Tx de 20 minutes chacune à la température ambiante. Rincer deux fois supplémentaires avec du PBS (pH 7,4) pendant 20 minutes chacune à la température ambiante. Montez les sections de tissu taché sur des lames de verre à l&#39;aide Fluoromount G. </li><li> Ecran à travers des sections colorées pour les axones OSN positive infectés et Termini axone avec un microscope à fluorescence. </li><li> Pour construire une vue en trois dimensions d&#39;une étiquette axone OSN et le terminal tonnelle, faire une série de sections optiques grâce à la profondeur de la tranche de 60μm tissu cible OB (le long de l&#39;axe z) en utilisant la microscopie confocale. </li><li> Cet empilement de Z-section des images peuvent ensuite être projetées ensemble pour reconstruire une perspective de 360 ​​° de rotation d&#39;un seul axone étiquetés OSN, dont la borne tonnelle en détail dans son intégralité. Toute l&#39;angle d&#39;une rotation unique peut être capturé et exporté comme un fichier image (par exemple JPG, TIFF) pour la présentation format 2D. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Avec les méthodes décrites ici, nous pouvons transduire des neurones sensoriels olfactifs par les lentivirus in vivo. Nous avons jusqu&#39;ici visualisés ARS infectés avec la GFP et les journalistes mCherry fluorescente, aussi bien avec un myc-taggés protéine de fusion via immunocytochimie. Cette technique fournit une abondance d&#39;ARS infectés. Pourtant, la transduction survient sporadiquement suffisante pour fournir ARS étiquetées individuellement, permettant ainsi l&#39;analyse de la morphologie cellulaire unique. Axones et terminaisons axonales sont imagés dans les coupes de tissus au milieu OB leur environnement naturel par microscopie confocale (figure 1). L&#39;ensemble du SVO axone terminal de tonnelle peut généralement être captivé dans une section de 40 50 microns optique. Fort grossissement d&#39;infectés terminaisons axonales OSN permet une analyse détaillée de la morphologie axonale tonnelle à la couche glomérulaire. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Figure 1. Trajectoire de simples olfactifs sensoriels axone des neurones et sa tonnelle terminal. A) une coupe coronale du bulbe olfactif de souris P7 montrant la couche nerf olfactif (ONL) immunocolorées pour OMP (rouge) et la couche glomérulaire (GL) immunocolorées avec deux OMP et Vglut2 (gris). Un seul axone des neurones sensoriels olfactifs exprimant la GFP (vert) se déplace au sein de l&#39;ONL et pénètre dans la structure glomérulaire. B) L&#39;axone terminal de la morphologie Arbor dans le glomérule clairement mis en évidence par expression de la GFP. Vglut2 co-coloration en gris illumine la surface totale glomular dans lequel la GFP-positives axone élabore une avor terminal. C) lentiviraux ARS infectées exprimant la GFP (green) pour l&#39;ENP. Le cytostructure de l&#39;épithélium olfactif est montré avec coloration DAPI (bleu). Expression de la GFP permet de visualiser les corps cellulaires OSN et leur processus cellulaires pour l&#39;ENP. D) Un axone OSN et sa morphologie terminal avec l&#39;expression Rap1GAP2 le knock-down par shRNA. Les lentivirus portant une cassette d&#39;expression double avec Rap1GAP2 shRNA sous le promoteur U6 et la souris GFP sous unePromoteur CMV ont été appliqués à l&#39;ENP. Infected terminaisons axonales olfactifs présentaient un terminal plus simplifiée tonnelle par rapport à celle du contrôle GFP seule. Barre = 20μm.

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

Ce protocole est bio-sécurité de niveau 2 conforme. Toutes les mesures appropriées espace de travail, la protection personnelle, et virales de confinement des déchets ont été établis en conséquence. Toutes les procédures d&#39;animaux ont été effectuées conformément aux directives du IACUC.

Microinjection des résultats lentivirus dans le transfert permanent de constructions de gènes dans l&#39;ADN génomique OSN. Cette approche nous permet d&#39;effectuer des manipulations à court terme ou à long terme de gènes candidats par surexpression ou la médiation shRNA le knock-down. En outre, nous pouvons par fluorescence étiquette ARS unique dans une lignée de souris transgéniques existantes pour observer la co-localisation des populations de récepteurs olfactifs. La microinjection est requis pour la transduction ...

Microinjection: souriceaux nouveau-nés ont été microinjectés l&#39;aide d&#39;une seringue Hamilton 5uL (Hamilton # 7647-01) munie d&#39;une aiguille de calibre 33 (Hamilton # 7762-06). Réactifs immunocytochimie: les anticorps primaires: GFP anticorps polyclonal de lapin (Molecular Probes # A-6455), l&#39;anticorps polyclonal dirigé contre le poulet OMP (personnalisé) (Chen et al, 2005.), La Guinée cochon anticorps polyclonal contre VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticorps secondaire: Cy2 conjugué d&#39;âne anti-lapin (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3 conjugué âne anti-poulet (Jackson Immunolab # 703-165-155) et Cy5-conjugués de chèvre anti-Guinée porc (Jackson Immunolab # 106-175-008). Les sections ont été montées sur des lames de verre avec Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) avec 50ng/mL DAPI chromatine solution de teinture. Imagerie confocale: Z-stack images ont été prises en utilisant un Olympus FV1000 Flouview microscope confocal et d&#39;images collectées et traitées dans les projections en 3D en utilisant Olympus FV10-ASW 2.01 acquisition confocale et des logiciels d&#39;analyse.

lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs in vivo</em

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Développement d&#39;un circuit précis olfactive repose sur la projection précise de olfactifs sensoriels neurone (SVO) axones vers leurs cibles synaptiques dans le bulbe olfactif (OB). Les mécanismes moléculaires de l&#39;OSN axone de croissance et de ciblage ne sont pas bien comprises. L&#39;expression des gènes Manipulation et après la visualisation des axones OSN unique et leur terminal tonnelle morphologie ont été jusqu&#39;à présent difficile. Pour étudier la fonction des gènes au niveau cellulaire unique dans un délai déterminé, nous avons développé une technique basée lentiviraux de manipuler l&#39;expression des gènes dans les ARS in vivo. Particules Lentivirales sont livrés à ARS par microinjection dans l&#39;épithélium olfactif (EO). Des cassettes d&#39;expression sont alors définitivement intégré dans le génome des ARS transduites. Vert l&#39;expression des protéines fluorescentes identifie ARS infectés et expose leur morphologie entier, y compris la tonnelle axone terminal. Grâce au temps de retournement court entre la micro-injection et la détection journaliste, les études de fonction du gène peut être porté dans un délai très étroite du développement. Avec cette méthode, nous avons détecté expression de la GFP dans aussi peu que trois jours et aussi longtemps que trois mois après l&#39;injection. Nous avons atteint deux sur-expression et de médiation shRNA le knock-down par microinjection lentiviraux. Cette méthode fournit des morphologies détaillées des corps cellulaires et des axones OSN au niveau cellule unique in vivo, et permet ainsi la caractérisation de la fonction de gènes candidats au cours du développement olfactif.

Nous présentons une technique lentiviraux pour la manipulation génétique et la visualisation de simples axone neurone olfactif sensorielle et son arborisation terminale<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Le développement d'un circuit olfactif précis repose sur la projection exacte des axones des neurones sensoriels olfactifs (NSO) vers leurs cibles synaptiques dans le...

Un des défis de l'étude du développement en neurosciences consiste à capturer les morphologies dendritiques et axonales au niveau d'une cellule unique in vivo. Dans le système olfactif, les neurones sensoriels olfactifs étendent leurs axones de l'épithélium olfactif du nez jusqu'au bulbe olfactif du cerveau. Lorsque plusieurs neurones sensoriels olfactifs projettent vers le bulbe olfactif, ils s'assemblent en faisceaux.Cela complique l'étude des trajectoires individuelles des axones et de leurs morphologies terminales. Nous avons mis au point une méthode permettant de visualiser in vivo des neurones sensoriels olfactifs individuels par microinjection d'un ADN construct porteur de la GFP dans un lentivirus.Une transduction réussie avec un lentivirus illumine toute la longueur de l'axone sensoriel olfactif, y compris l'arborisation terminale. En plus de permettre la visualisation de neurones sensoriels olfactifs individuels, cette méthode nous permet de manipuler l'expression génique d'un gène d'intérêt particulier afin d'étudier sa fonction dans un contexte in vivo. Ce protocole utilisant le lentivirus relève du niveau de sécurité biologique 2 et doit être réalisé dans une hotte à flux laminaire.Pour maintenir un environnement stérile, vaporisez avec de l'éthanol à 70 % tous les objets insérés dans la hotte, préparez et préchauffez un lit d'eau à 37 degrés pendant au moins 20 minutes avant l'injection. Scellez un sac en plastique rempli à moitié d'eau et placez-le sur un bloc chauffant vide de l'incubateur.Cela permettra aux souris de se remettre après l'injection. Remplir un conteneur de déchets biologiques avec de l'eau de javel à 10 % afin de décontaminer tous les matériaux exposés au virus. À partir de cette procédure, préparer une petite coupelle ouverte contenant de l'éthanol à 70 % et une deuxième coupelle contenant de l'eau distillée stérile.Dans une hotte à flux laminaire, nous utiliserons une seringue Hamilton d'une capacité de cinq microlitres équipée d'une aiguille de calibre 33. Ce modèle particulier permet d'ajuster la résistance du piston en tournant un cadran de tension situé en haut de la chambre du piston. Cette fonctionnalité assure un contrôle précis du volume d'injection microscopique et permet de stériliser l'aiguille ainsi que la chambre de la seringue.Aspirez et éjectez répétitivement de l'éthanol depuis la boîte plusieurs fois. Rincez la cartouche de la seringue en aspirant et en éjectant de l'eau stérile plusieurs fois. Placez la seringue en sécurité à l'écart dans le flux laminaire.Placer des lingettes alcoolisées près de la station d'injection. Préparer une plateforme d'injection offrant une surface surélevée afin de faciliter le positionnement de la souris. On peut utiliser une boîte de culture de 10 centimètres retournée, recouverte de lingettes Kim.Les souriceaux peuvent être anesthésiés par hypothermie jusqu'à l'âge du sevrage. Découpez un doigt d'un gant en caoutchouc et placez-y le souriceau. Ensuite, placez-le sur de la glace pendant cinq minutes.Le gant préviendra les brûlures cutanées qui se produiraient en cas de contact direct de la peau avec la glace. Testez l'anesthésie complète en pinçant les pattes arrière et les quatre pattes du petit pour vous assurer que l'animal ne réagit pas. Nous sommes maintenant prêts pour la microinjection de lentivirus. Nous allons démontrer la procédure sur un petit néonatal.Si un âge plus avancé de souris est utilisé, il faut remplacer l'aiguille de calibre 33 par une aiguille de calibre plus épais afin de pénétrer la surface du crâne. Stériliser la surface du museau de la souris en l'essuyant avec un tampon imbibé d'alcool. Retirer les stocks de lentivirus du congélateur et les décongeler sur de la glace.Nous avons produit nous-mêmes du lentivirus en laboratoire en utilisant des méthodes établies. En élaborant cette méthode, nous avons constaté qu'une concentration virale minimale de 10 puissance neuf unités infectieuses par millilitre est nécessaire pour obtenir un bon taux de transduction. Aspirez deux microlitres de la solution stock de lentivirus dans la seringue stérilisée de Hamilton.Placer le souriceau sur le plateau d'injection. Saisir la peau située au sommet de la tête au niveau des oreilles, puis tirer doucement vers l'arrière. Nous avons équipé notre hotte à flux laminaire d'un microscope stéréoscopique.Pour diriger précisément les micro-injections, recherchez à la surface dorsale du crâne au niveau du prosencéphale le contour du bulbe olfactif. Nos cibles de micro-injection entourent étroitement le bulbe olfactif, mais ne doivent pas inclure le bulbe lui-même. Nous effectuons quatre injections dans l'épithélium olfactif de chaque petit.Ces positions, représentées par des points bleus, nécessitent que l'aiguille soit insérée selon un angle dirigé vers la ligne médiane. Les deux injections supplémentaires, représentées par des points verts, sont décalées, plus médianes et antérieures au bulbe olfactif. Ces injections peuvent être effectuées selon un angle oblique.Les recommandations concernant les angles d'insertion de l'aiguille tiennent compte de la position ventrale de l'épithélium olfactif, qui se situe principalement sous le bulbe olfactif. L'accès perpendiculaire est donc restreint. Insérez l'aiguille par le sommet de la cavité nasale, environ trois millimètres sous la surface de la peau.Pour atteindre l'épithélium olfactif. Une main exercée doit sentir la diminution de la résistance lorsque l'espace luminal de la cavité nasale est atteint. Cette zone doit être évitée.Micro-injecter 0,5 microlitre de solution virale par position. Là encore, en choisissant deux sites par côté, gauche et droit, soit quatre injections au total de 0,5 microlitre. Chaque souris nécessite ainsi deux microlitres de virus par séance d'injection.Encore une fois, faites attention de ne pas injecter le bulbe olfactif à sec afin d'éviter toute solution virale résiduelle ou tout sang pouvant s'échapper du site d'injection ou des orifices des narines. À l'aide d'un essuie-alcool, jetez les essuies dans le récipient contenant de l'eau de javel diluée et placez immédiatement la souris injectée dans l'incubateur à lit d'eau pour sa récupération. Désinfectez la seringue et l'aiguille en répétant la procédure de stérilisation effectuée lors de la préparation. Les souris injectées peuvent être replacées dans leur cage 30 minutes après leur récupération dans l'incubateur à lit d'eau.Cette microinjection complète peut être répétée après quatre heures. Si vous souhaitez augmenter le nombre de neurones sensoriels olfactifs qui seront infectés, les neurones sensoriels olfactifs infectés peuvent être visualisés sur toute la longueur de la cellule en aussi peu que trois jours. Les animaux sont sacrifiés et perfusés pour l'observation au moment souhaité.À l'aide de méthodes standard, afin de visualiser les trajectoires des neurones sensoriels olfactifs transduits au niveau de la cellule unique ainsi que les terminaisons axonales, nous disséquons et sectionnons le bulbe olfactif dans un plan coronal avec une épaisseur de 60 micromètres. La coupe contient ainsi toutes les couches cellulaires du bulbe olfactif, y compris les faisceaux d'axones des neurones sensoriels olfactifs et les terminaisons axonales, qui entrent en synapse au sein de structures glomérulaires situées à la surface du bulbe, en vue d'une immunohistochimie en suspension. Des coupes sérielles du bulbe olfactif sont réalisées et rassemblées collectivement dans une boîte de culture de 10 centimètres contenant cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate.Transférez les sections flottantes dans un flacon conique de 50 millilitres. Une fois que les sections se sont déposées au fond du flacon, aspirez le tampon salin phosphate. Prenez garde de ne pas aspirer les sections.Vos sections sont remises en suspension dans 10 millilitres de tampon frais afin d'éliminer tout fixatif résiduel ou matériau d'inclusion. Prélèvez immédiatement cette suspension à l’aide d’une pipette et transférez-la dans un flacon conique de 15 millilitres, en veillant à récupérer toutes les sections flottantes, aspirez la solution de rinçage, puis percez les sections avec une solution de Triton X-100 à 0,3 % dans du tampon salin phosphate, et placez le flacon sur une plateforme agitée pendant 10 minutes. À température ambiante, vous pouvez ensuite suivre un protocole standard de coloration immunohistochimique dans le même flacon conique, en répétant les étapes d'aspiration et d'agitation selon les besoins pour ce volume, tout en conservant un volume de 10 millilitres pour les étapes de coloration et de rinçage.Voici une liste d'anticorps que nous utilisons pour la double coloration des neurones sensoriels olfactifs positivement transduits et de la population générale des neurones sensoriels olfactifs. Pour une pénétration optimale des anticorps dans les sections de bulbe de 60 microns, il est recommandé une incubation toute la nuit à quatre degrés Celsius. La durée de chaque lavage ne doit pas être inférieure à 20 minutes.Étaler délicatement chaque section sur une lame en verre à l’aide d’un pinceau, puis monter chaque lame avec du FloraMount G supplémenté d’une solution de colorant pour la chromatine. S’efforcer d’éliminer toutes les bulles du milieu de montage. Monter les sections en rangées afin de simplifier l’étape ultérieure de criblage.Analysez ces couches sur vos sections de bulbe immuno-marquées à la recherche de fibres axonales et de terminaisons positives pour la GFP. À l’aide d’un microscope à fluorescence, les terminaisons nerveuses infectées positivement peuvent ensuite être observées par microscopie confocale. Il est utile d’étalonner le plan focal dans la région d’intérêt en utilisant les canaux DPI et protéine marqueur olfactif.Ces résultats montrent une fibre axonale unique de neurone sensoriel olfactif et son terminal axonal au sein du glomérule, où le CO est marqué en rouge par la protéine marqueur olfactif et les corps cellulaires de neurones sensoriels olfactifs infectés par vlu deux en gris. Les corps cellulaires des neurones sensoriels olfactifs infectés ainsi que leur bouton dendritique peuvent également être visualisés au sein de l'épithélium olfactif si ce tissu a été inclus lors des étapes de dissection et de marquage immunohistochimique. Ma projection confocale nous offre une morphologie extrêmement détaillée du trajet d'extension axonale et de l'arborisation terminale d'un neurone sensoriel olfactif unique. On peut observer le crochet de la fibre axonale en direction de sa cible glomérulaire, ainsi que les détails de son schéma de ramification au sein du neuropile glomérulaire.La méthode de microinjection lentivirale permet la visualisation de l'axone d'une cellule unique, des morphologies des neurones sensoriels olfactifs, et autorise des études impliquant la manipulation de l'expression génique ; la transduction par lentivirus entraîne une intégration génomique stable des constructions. Le lentivirus n'infecte pas transsynaptiquement les cellules voisines. La visualisation peut être obtenue en aussi peu que trois jours et a été confirmée pour durer au moins trois mois, probablement plus longtemps.Les neurones sensoriels olfactifs ne sont pas facilement infectés par une perfusion nasale de solution de lentivirus. Par conséquent, une microinjection à travers la surface est nécessaire dans cette procédure. Voilà donc notre procédure de microinjection de lentivirus.J'espère que vous avez trouvé toutes ces informations utiles pour parvenir à obtenir des morphologies cellulaires uniques. Bonne chance dans vos recherches.

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Neurones adultes-né du bulbe olfactif peut être contrôlé à l'aide optogenetically Channelrhodopsin2 exprimant l'injection lentiviral dans le flux migratoire et rostrale photostimulation chronique avec une miniature implanté à LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Source : Kozin, E. D., et.al. Visualisation directe du noyau cochléaire dorsal murin pour la stimulation optogénétique de la voie auditive. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre le transfert de gènes médié par le virus dans le noyau cochléaire dorsal (DCN) de souris pour permettre la stimulation auditive induite par la lumière. Un vecteur viral codant pour l’opsine, un canal ionique sensible à la lumière, est injecté dans le DCN à la suite d’une craniotomie et d’une aspiration cérébelleuse...

Transfert de gènes médié par un virus dans le noyau cochléaire dorsal de souris pour une stimulation auditive induite par la lumière

Les vecteurs viraux permettent une manipulation du gène ciblé. Nous démontrons une méthode pour l'expression génique conditionnelle ou l'ablation de la moelle épinière de souris, par injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans la corne dorsale, un important site de contact synaptique entre les afférences somesthésiques primaires et les neurones du système nerveux central.

Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Nous décrivons un protocole de marquage in vivo des neurones sensoriels olfactifs par électroporation et par balayage laser confocal ultérieur ou microscopie multiphotonique pour visualiser la morphologie neuronale et son développement au fil du temps.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie In Vivo

Nous décrivons ici une procédure basée sur l’utilisation de particules lentivirales pour la modification génétique à long terme des cellules souches neurales et/ou de leurs cellules épendymaires adjacentes dans la niche neurogène ventriculaire-sous-ventriculaire adulte qui permet l’analyse séparée des effets autonomes et non autonomes des cellules dépendantes de la niche sur les cellules souches neurales.

Stable et efficace modification génétique de cellules dans le Adulte souris V-SVZ pour l&#39;analyse des cellules souches neurales autonome et effets non autonomes

Intrarachidienne de recombinase dépendant adeno-associated virus recombinant (rAAV) peut être utilisée pour manipuler n’importe quel type de cellules génétiquement marquées dans la moelle épinière. Ici, nous décrivons comment transmettre des neurones de la corne dorsale de la moelle épinière lombaire. Cette technique permet d’interrogatoire fonctionnelle du sous-type neurone manipulé.

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression dans les neurones de la moelle épinière génétiquement définies

Le protocole actuel démontre une méthode simple pour tracer les projections de glutamate de l’aire tegmentale ventrale (VTA) vers l’hippocampe. La photostimulation des neurones du glutamate VTA a été combinée à l’enregistrement CA1 pour démontrer comment les terminaux VTA glutamate modulent la vitesse de tir pyramidale putative CA1 in vivo.

Traçage anatomique et fonctionnel in vivo combiné des terminaux de glutamate de la zone tegmentale ventrale dans l’hippocampe

Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.

Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral

Nous décrivons ici des méthodes pour induire et analyser le remodelage dépendant de l’expérience olfactive des glomérules synaptiques du lobe antennaire dans le cerveau juvénile de la drosophile .

Remodelage dépendant de l’expérience de la connectivité synaptique des neurones sensoriels olfactifs du cerveau juvénile au cours d’une période critique au début de la vie

Découvrez la manipulation génétique par lentivirus pour visualiser les neurones sensoriels olfactifs in vivo. Cette méthode permet d'étudier les trajectoires axonales individuelles et leurs arborisations terminales dans le système olfactif.

Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo

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